Summary
للسماح للكشف عن درجة عالية من الحساسية لسرطان القولون والمستقيم البشرية نشر الخلايا (CRC) استعمار الأنسجة، نعرض هنا بروتوكولا لكفاءة توصيل الجسيمات لينتيفيرال البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) إلى خلايا أورجانويد المستمدة من PDX CRC قبل الحقن في الفئران المستفيدة، مع ملاحظة مجهرية ستيريو-الأسفار.
Abstract
وعلى الرغم من التقدم الحالي في علاج سرطان القولون والمستقيم البشرية (CRC)، علاجات جذرية قليل فعالة للمراحل المتأخرة من اتفاقية حقوق الطفل. للتغلب على هذا التحدي السريرية، والورم إكسينوجرافت الماوس نماذج استخدام الراسخة قد وضعت خطوط الخلايا البشرية سرطان والعديد من نماذج الماوس المحورة وراثيا بالأورام كنماذج الإكلينيكية. جزئيا تحاكي ملامح السرطانات البشرية، ولكنها غالباً ما تفشل بإيجاز الجوانب الرئيسية للأورام الخبيثة البشرية بما في ذلك الغزو، وورم خبيث. وهكذا، طال انتظار النماذج البديلة التي تمثل أفضل تطور خبيث في البشرية اتفاقية حقوق الطفل.
هنا نعرض جيل تكثيفها الورم المستمدة من المريض (بدكسس) بغرس تحت الجلد الصغيرة الشظايا CRC تشريح جراحيا من مريض. القولون بدكسس تطوير ويشابه هيستوباثولوجيكالي اتفاقية حقوق الطفل في المريض. ومع ذلك، ميكروميتاستاسيس عفوية قليلة قابلة للاكتشاف في المقاطع العرضية التقليدية المتأثرة الأجهزة البعيدة في نموذج PDX. لتيسير الكشف عن نشر المنتشر في الأجهزة البعيدة، استخرجنا الخلايا السرطانية أورجانويد من بدكسس القولون في الثقافة والمصابين منهم lentivirus التجارة والنقل قبل الحقن في شدة العوز إيماءة/شي-إخضاعها IL2Rγفارغة (null) الفئران (وتد). الخلايا أورثوتوبيكالي حقن CRC المستمدة من PDX أورجانويد دائماً شكل الأورام الأولية الإيجابية للتجارة والنقل في الفئران المستفيدة. وعلاوة على ذلك، وضع عفويا ميكروميتاستاتيك المستعمرات معربا عن التجارة والنقل لا سيما اكتشاف في الرئتين من هذه الفئران بالفحص المجهري الأسفار. وعلاوة على ذلك، حقن إينتراسبلينيك من أورجانويدس لجنة حقوق الطفل كثيرا ما تنتج الاستعمار الكبد. أخذت معا، تشير هذه النتائج إلى المسمى بروتينات فلورية خضراء في الخلايا أورجانويد PDX المستمدة من اتفاقية حقوق الطفل أن يكون بصريا يمكن اكتشافها أثناء عملية متعددة الخطوات ووصف تتالي غزو خبيث. وتشمل البروتوكولات وصف إنشاء بدكسس البشرية اتفاقية حقوق الطفل، وثقافة 3D من الخلايا أورجانويد CRC المقابلة ترانسدوسيد بجسيمات لينتيفيرال التجارة والنقل.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي الثاني لوفيات السرطان في جميع أنحاء العالم1. عدم كفاية الاستجابة للعلاجات التقليدية للمرضى الذين يعانون من المرض مرحلة متقدمة تشير إلى عدم فعالية المحاولات الرامية إلى علاج جذري المجتمعي. وضع نهج علاجية أكثر فعالية، تم إنشاء مختلف نماذج الماوس الإكلينيكية للسرطان التي تحاكي خصائص مراكز التأهيل المجتمعي. مختلف خطوط الخلايا في اتفاقية حقوق الطفل قد استخدمت على نطاق واسع لتوليد تكثيفها الورم سبب راحة وسهولة التلاعب. ثقافة طويلة الأجل لخطوط خلايا السرطان، ومع ذلك، غالباً ما يسبب اختيار السكان الخلايا الفريدة التي التكاثري تماما تحت شرط ثقافة معينة، مما يؤدي إلى نتائج لا يمكن الاعتماد عليها والقيود الحاسمة في العقاقير السريرية التنمية.
دون أن يكون مثقف في المختبر، كما تم إنشاؤها تكثيفها الورم المستمدة من المريض (بدكسس) بواسطة غرس في نماذج حيوانية للأنسجة البشرية CRC تشريح جراحيا من المرضى2،،من34. بدكسس معروفة على نطاق واسع كما لخص أهم الميزات التشريحية المرضية والتعديلات الوراثية الموجودة أصلاً في أورام المرضى التي اشتقت منها. وعلاوة على ذلك، أورجانويدس الورم المستمدة من المريض تتألف من خلية الورم ووضعت مجموعات الثقافة ظروف 3D الذي يحاكي عن كثب الخصائص البيولوجية للأورام الأصلي5،6. وطبقت هذه أورجانويدس الورم أيضا لفحص المخدرات الفائق، مما يسمح للعلاجات مخصصة لتكون مصممة5. بيد غير متجانسة على نحو ملحوظ CRC السكان يفترض أن تكون موجودة داخل ورم الجماهيري. قد بشكل انتقائي تتكاثر خاصة CRC السكان وتوسيع خلال السلسلة في الجسم الحي وفي المختبر من الممرات PDX والورم أورجانويدس، على التوالي. قد يسمح هذا أيضا ملامح التعبير الجيني الشاملة وبرنامج التحصين الموسع والوراثية مركز من مراكز التأهيل المجتمعي المتأثرة تغيير، مما يؤدي إلى تشابه الحد الأدنى لاتفاقية حقوق الطفل الوالدية.
أورجانويدس CRC المستمدة من المريض وتلك المستخرجة من القولون البشرية نونكانكيرووس إجراء هندسة عكسية للميناء مجموعات من الطفرات النمطان استخدمت أيضا للتحقيق في السمات المميزة للخلايا السرطانية البشرية المتمثلة بغزو الورم وورم خبيث 67،،،من89. ومع ذلك، حدوث منخفضة جداً من ورم خبيث العفوية الناشئة عن أورثوتوبيك غرس CRC المستمدة من المريض في الفئران العوز، جعلت من الصعب لدراسة عملية متعددة الخطوات لتتالي غزو خبيث يحتوي على المحلية الغزو، إينترافاسيشن، النقل في مجرى الدم، والتسرب واستعمارها للأجهزة البعيدة4،10. ميكروميتاستاسيس كممثلة بورم الخلايا ترسب مم دي تو، شكلتها المستمدة من المريض أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل، وغالباً ما تم تجاهله في تحليل نسيجية للأقسام من الأجهزة البعيدة المتضررة في النماذج التجريبية الماوس. التصور ميكروميتاستاسيس عفوية وقد الحد الأدنى في فيفو نظراً لصعوبة كفاءة إدخال علامات مضيئة في الخلايا السرطانية أورجانويد قبل الحقن في الفئران المستفيدة. في هذه الدراسة، وضعنا بروتوكولا كفاءة ترانسدوسي lentivirus التجارة والنقل إلى الخلايا أورجانويد المستمدة من PDX CRC في الثقافة 3D قبل الحقن في الفئران المستفيدة والسماح للكشف عن درجة عالية من الحساسية، استخدام الفحص المجهري ستيريو-الأسفار، لما استعمار أجهزة مختلفة للنموذج ميكروميتاستاسيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
قدم المريض الموافقة الخطية وتمت الموافقة المشروع قبل "لجنة أخلاقيات البحوث" كلية الطب في جامعة جونتيندو. تجارب الماوس أيضا موافقة "لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية" جونتيندو كلية الطب.
1-إنشاء لجنة حقوق الطفل بدكسس في الفئران العوز
ويرد في الشكل 1Aالإجراءات التجريبية لوضع "بدكسس" (الخطوة 1) من اتفاقية حقوق الطفل.
- إعداد الأنسجة CRC الابتدائي فورا بعد الاستئصال الجراحي للورم من المريض.
- أغسل الأنسجة CRC الأولية بالانفعالات لطيف عدة مرات في 30 مل من الفوسفات العقيمة المثلج مخزنة المالحة (PBS) في أنبوب 50 مل مخروطية وإبقائه على الجليد.
- ضع الأنسجة على طبق بيتري 10 سم باستخدام ملاقط معقمة وإزالة مناطق نخرية على نطاق واسع قدر الإمكان باستخدام مقص معقم وقطع أنسجة الأورام الصلبة إلى قطع صغيرة (5 × 5 × 5 مم3 في الحجم) باستخدام شفرات الحلاقة العقيمة.
ملاحظة: مناطق نخرية غالباً أكثر بياضا وأكثر نعومة وقابلة للتفتيت أكثر من المناطق المحيطة بها. - ضع قطعة صغيرة من الورم باستخدام ملاقط معقمة في 2 مل من المثلج PBS العقيمة على لوحة 6-جيدا.
- تولد 6 أسبوع IL2Rγ إيماءة/شي-مشمولان فارغة (وتد) شدة العوز الفئران ظروف حرة ومحددة الممرض–جرثومة–الحرة.
- تخدير الفئران مع استنشاق إيسوفلوراني باستخدام جهاز التخدير استنشاق الحيوانات الصغيرة وتطهير الجلد مع الإيثانول 70%. أؤكد بالمعدل العادي وعمق التنفس وغياب منعكس قرصه تو أنيسثيتيزيشن السليم. مرهم البيطرية في العيون خيار، لمنع جفاف العين في حين تحت التخدير.
- تعقيم كل الأدوات الجراحية باستخدام التعقيم الحرارة الجافة وثم استخدام هذه الأدوات لجميع الإجراءات لمنع عدوى الجرح في الفئران المستفيدة.
- ضع الماوس أنيسثيتيزيد في موقف معرضة على مقاعد البدلاء المختبر. إجراء شق صغير في الأجزاء السفلي من الجناحين الأيمن والأيسر للماوس المتلقية لتوليد جيوب تحت الجلد لزرع الأنسجة باستخدام مقص معقم. الحرص على عدم ثقب الغشاء البريتوني. ينبغي أن يكون هناك نزيف قليلاً مع هذا الإجراء.
- بلطف وتراجع أعلاه إعداد أجزاء الورم إلى 50 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية وثم زرع لهم في الأجزاء السفلي من اليمين واليسار جيوب تحت الجلد.
- خياطة الشق مع مقاطع الجرح في الفئران تمر الإجراءات الجراحية. تأكد من أن توجد أنسجة الورم مزروع في بعض المسافة من شق تحت الجلد.
ملاحظة: وفقا للتقليل إلى أدنى حد من العمليات الجراحية، كانت تدار لا علاجات للإصابة والألم بعد الجراحة في هذه الدراسة. - ضع الماوس على وسادة دافئة، والحفاظ على موقف راقد القصية حتى يتم استعادة الوعي الكافي. متى تعافي تماما وقادرة على الجلوس في كل أربعة أرجل، يمكن إرجاع الفئران إلى اقفاصها المنزل. لمنع اﻻفتراس، لا تسمح بتربية مع الحيوانات غير تعمل في نفس القفص.
- التحقق من وجود تسرب خياطة وتأكيد أن الفئران هم في حالة مستقرة في اليوم التالي، في المجموعة المعالجة جراحيا. تحقق من الفئران لعلامات المرض وقياس حجم الورم في كل الماوس، مرة في أسبوع، استخدام الفرجار.
2-تشريح لحقوق الطفل بدكسس من الفئران
ويرد في الشكل 1Bالإجراءات التجريبية لتشريح "بدكسس" (الخطوة 2) من اتفاقية حقوق الطفل.
- تسمح الورم ينمو تحت الجلد إلى ~ 1 سم3 في الحجم، والذي عادة ما يستغرق حوالي 1 – 3 أشهر.
- تخدير الماوس مع استنشاق إيسوفلوراني باستخدام جهاز التخدير استنشاق الحيوانات الصغيرة وتطهير الجلد مع الإيثانول 70%.
- ضع الماوس في وضع عرضه على مقاعد البدلاء المختبر. جداً الجلد وتعريض الورم وفصل الجلد من الورم باستخدام مقص معقم بعناية. بعد إزالة الورم، وضعه على 10 سم طبق بيتري وإزالة أي مناطق نخرية صارخ من الورم، ثم شطف مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: مناطق نخرية غالباً أكثر بياضا وأكثر نعومة وقابلة للتفتيت أكثر من المناطق المحيطة بها. -
مكان الورم على الجليد وتقسيمه على قدم المساواة إلى مالا يقل عن 4 أجزاء لتطبيقات مختلفة بما في ذلك 1) حقوق الطفل أورجانويد الثقافة، 2) زرع في الثانوي الفئران، فحص 3) النسيجي و 4) تجميد وتخزين أجزاء الورم.
- لجيل أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل، بوضع أنسجة الأورام الصلبة على طبق بيتري 6 سم يحتوي على 1 مل PBS العقيمة. الحفاظ على النسيج على الجليد حتى تجهيز (الخطوة 3).
- لإنشاء نموذج PDX للبشرية اتفاقية حقوق الطفل، ممر بدكسس CRC الطازجة في ماوس ثانوي. قطع الأنسجة الورم إلى قطع صغيرة (5 × 5 × 5 مم3 في الحجم) باستخدام شفرات الحلاقة العقيمة وتراجع هذه الشظايا الأنسجة بلطف إلى 50 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية. ثم زرع هذه الأجزاء إلى الأجزاء السفلي من جيوب تحت الجلد الأيمن والأيسر للماوس وتد، كما هو موضح في الخطوة 1، 1.8 – 11.
- للتحليل النسيجي، إصلاح العينات في 5 مل من 10% فورمالين مخزنة محايدة في أنبوب مخروطي 15 مل في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
- لنعد، قطع الأنسجة الورم إلى قطع صغيرة (5 × 5 × 5 مم3 في الحجم) وتراجع بلطف العينات إلى 500 ميليلتر من الخلية تجميد الحل في أنابيب كريوفيال 1 – 1.5 مل. ثم قم بنقل الأنبوب لثلاجة-80 درجة مئوية.
3-استخراج بدكسس في تعليق خلية لثقافة أورجانويد لجنة حقوق الطفل
ويرد في الشكل 1Bالإجراءات التجريبية للانفصال من "بدكسس" (الخطوة 3) من اتفاقية حقوق الطفل.
- وشظايا مكان الورم استعداد (الخطوة 2.4.1) أعلاه على 10 سم طبق بيتري.
- فرم الأجزاء باستخدام شفرات الحلاقة العقيمة وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 8 مل مصل العجل الجنين 10% (FCS)-المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) مع 80 ميليلتر من الأسهم إنزيم كولاجيناز (انظر الجدول للمواد).
- أغلق الأنبوب محكم والتفاف الغطاء مع بارافيلم لمنع التسرب. أن تنأى بشظايا ورم مفروم في تعليق خلية، تحرض عليه برفق ح 2 في 37 درجة مئوية. علما أنه سيكون هناك لا تزال أجزاء كثيرة من عسر الهضم الأنسجة المتبقية في الأنبوب.
- الطرد المركزي الأنبوب في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية. حل بيليه الخلية باستخدام 10 مل من 10% دميم FCS جعل تعليق خلية.
- لإزالة الحطام الأنسجة عسر الهضم، تصفية تعليق خلية مرتين باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. ثم الطرد المركزي خلال التدفق في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وإبقاء بيليه على الجليد.
4-جيل أورجانويدس CRC مثقف في المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية
ويرد في الشكل 1Bالإجراءات التجريبية لثقافة حقوق الطفل أورجانويد بدكسس القولون (الخطوة 4).
- إنشاء وسيلة ثقافة مناسبة أورجانويدس المستمدة من PDX CRC (انظر الجدول للمواد، "حقوق الطفل أورجانويد الثقافة المتوسطة") توظيف وسائل الإعلام المذكورة سابقا للبشرية القولون أورجانويدس11.
- تطبيق 150 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية (انظر الجدول للمواد) كل جيدا على لوحة 12-جيدا على الجليد واحتضان ثم أنه لمدة 30-60 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة ترسيخ المواد الهلامية.
- تعليق بيليه الخلية من الخطوة 3.5 مع متوسط الثقافة أورجانويد اتفاقية حقوق الطفل (من الخطوة 4، 1) مع 5 ٪ السفح لتحقيق التكيف مع 3 × 105 خلايا/مل. ثم البذور 1 مل المتوسطة إلى اصطناعية خارج الخلية المغلفة بمصفوفة لوحة إعدادها في الخطوة 4، 2. واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2. استخدام هيموسيتوميتير لعد عدد الخلايا السرطانية بما في ذلك الخلايا المفردة ومجموعات متعددة الخلايا (مجموعة من الخلايا ملتصقة) في تعليق خلية.
ملاحظة: يتم استخدام 5 ٪ السفح إخماد النشاط الأنزيمي المتبقية من كولاجيناز في هذه الدراسة. - بعناية جمع المتوسطة الثقافة، بما في ذلك العائمة الخلايا التي قد فصل من لوحة المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية الاصطناعية، إلى 1.5 مل الطرد المركزي الأنبوب في اليوم التالي والطرد المركزي أنه في س 1,400 ز لمدة 5 دقائق. ثم إزالة المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 70 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية على الجليد.
- زيادة صلاحية خلية CRC، تراكب الورم الذي يحتوي على الخلية الاصطناعية خارج الخلية المصفوفة على أورجانويد ورم الخلايا تعلق على لوحة المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية الاصطناعية واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة ترسيخ طلاء المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية. ثم احتضان أنه مع 1 مل من اتفاقية حقوق الطفل أورجانويد خلية الثقافة المتوسطة مع السفح 1% في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
- تغيير ثقافة المتوسط كل يوم الثاني. كما أورجانويدس CRC ملء المتوسطة، فقد يصبح من الضروري تغيير في المتوسط يوميا.
5-جيل وتخصيب جزيئات لينتيفيرال بروتينات فلورية خضراء
ويرد في الشكل 1الإجراءات التجريبية لتوليد وتخصيب جزيئات بروتينات فلورية خضراء لينتيفيرال (الخطوة 5).
- الثقافة HEK293T الخلايا مع روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10% FCS و إعداد ستة أطباق 10 سم (2 × 106 خلايا كل طبق) تعداء الإجراء التالي.
- تعداء كل طبق، وإعداد 500 ميليلتر من المخلوط بما في ذلك 20 ميليلتر من الكاشف تعداء في دميم مع ناقل برل-التجارة والنقل (5 ميكروغرام)12 وهما والبلازميدات التغليف لينتيفيرال، مثل بكمف-منظمة-G (1 ميكروغرام) ودفبر بكمف-dR8.2 (5 ميكروغرام)، في معقم 1.5 مل microtube. الاحتفاظ بهذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم تراكب على كل من الأطباق 10 سم واحتضانها لهم ح 18.
- إزالة المتوسطة وإضافة 5 مل من الطازج المتوسط 1640 FCS RPMI 10% لكل طبق، وترك مكانة ح 24.
- جمع المتوسطة مكيفة من كل طبق في أنبوب 50 مل الطرد مركزي وتخزين ما مجموعة 30 مل الوسط عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إضافة 5 مل من 1640 RPMI جديدة على كل طبق وترك مكانة ح 24.
- جمع المتوسطة مكيفة من كل طبق في أنبوب 50 مل الطرد المركزي والحفاظ، في المجموع، 30 مل من الوسط على الجليد. وبعد ذلك، تجاهل الخلايا.
- تصفية 60 مل الوسط (من الخطوة 5، 4 – 5.5) من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرون لإزالة الخلايا وتقسم هذه الكمية إلى اثني عشر أنابيب الطرد المركزي البوليبروبيلين 5 مل تنبيذ فائق.
- إلى تركيز الفيروس، الطرد المركزي لهم استخدام دوار دلو يتأرجح (انظر الجدول للمواد) في 85,327 س ز ح 1.5 في 4 درجات مئوية.
- على الفور إزالة المتوسطة. حل فيروس مركزة بيليه، ضع 250 ميليلتر من خليط F-12 "المغذيات حم" (F12)/المتوسطة دميم دون FCS في كل من اثني عشر أنابيب والحفاظ عليه في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. علما بأن الفيروس بيليه في كثير من الأحيان غير مرئية.
- بلطف "الماصة؛" وسيلة لجمع 3 مل تركيز 5 x GFP lentivirus المخزون، في المجموع، يفترض بما في ذلك الجسيمات لينتيفيرال التجارة والنقل مع 108 وحدات ترانسدوسينج كل مل (تي يو/mL). ثم تخزين microtubes 1.5 مل اثنا عشر (بما في ذلك 250 ميليلتر كل أنبوب) تحت ظروف معقمة في-80 درجة مئوية لتصل إلى سنة. إعداد العديد من مختبرين الصغيرة الحل الأصلي لتجنب عدة دورات ذوبان تجميد–.
6-وضع العلامات CRC أورجانويد الخلايا التي تحتوي على بروتينات فلورية خضراء جسيمات لينتيفيرال المستزرعة في المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية
ويرد في الشكل 1الإجراءات التجريبية لوضع العلامات الخلايا أورجانويد CRC مع التجارة والنقل لينتيفيروس (الخطوة 6).
- السماح أورجانويدس CRC إعدادها في الخطوة 4.6 تنمو دون تدخل لمدة 7 – 10 أيام وحصادها آليا باستخدام مكشطة خلية عقيم وثم تحويلها إلى microtube 1.5 مل.
ملاحظة: نمو أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل في الثقافة يعتمد على طبيعة الأورام الأصلي من المرضى. تجنب فرط أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل، بإبقائها في التقاء 60 – 70% السابقة لنقل بنسبة 1:2 تقسيم على جديدة اصطناعية خارج الخلية المغلفة بمصفوفة جيدا 12 لوحة. - الطرد المركزي في microtube لمدة 3 دقائق في س 1,400 ز، وإزالة المتوسطة الثقافة وحل بيليه الخلية في 500 ميليلتر لبرنامج تلفزيوني عن طريق التنصت لطيف.
- الطرد المركزي في microtube لمدة 3 دقائق في 1,400 س ز والقضاء على برنامج تلفزيوني.
- أن تنأى أورجانويدس CRC ملتصقة، إضافة 500 ميليلتر من حل الخلية المفرزة من proteolytic وبيليه في الأنبوب الإنزيمات كولاجينوليتيك للخلية ومزجها بالتنصت على لطيف. ثم ترك هذه الأنابيب تسوية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بلطف جداً "الماصة؛" تعليق خلية مع ميليلتر 500 إضافية 1% دميم FCS عدة مرات في microtube 1.5 مل فصل الخلايا تقريبا. جيل خلايا المفردة من أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل قبل بيبيتينج قاسية ملحوظ يقلل بقاء الخلية. وبالتالي، من الضروري ترك كتلة الخلايا يمكن كشفها بصريا في تعليق خلية بها بلطف جداً بيبيتينج في microtube 1.5 مل.
- الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 3 دقائق في 1,400 س ز وإزالة المادة طافية.
- حل بيليه الخلية مع خليط من 100 ميليلتر من 5 x GFP lentivirus الأسهم (> 108 تو/mL) و 400 ميليلتر من متوسط الثقافة أورجانويد CRC في microtube 1.5 مل عن طريق التنصت لطيف للتكيف بتركيز من 5 × 105 فصل الخلايا السرطانية الواحدة 500 ميليلتر . استخدام هيموسيتوميتير لعد عدد الخلايا السرطانية، بما في ذلك مجموعات من الخلايا والخلايا المفردة في تعليق خلية، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4، 3).
- إعداد اصطناعية خارج الخلية المغلفة بمصفوفة جيدا 12 صفيحة، كما هو موضح في الخطوة 4، 2. ثم ضع 500 ميليلتر من تعليق خلية إعدادها في الخطوة 6.7 على اللوحة وترك الأمر ح 18 في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
- جمع المتوسطة مع الخلايا عائمة منفصلة عن لوحة المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية الاصطناعية في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. الطرد المركزي أنه في س 1,400 ز ومن ثم إزالة المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 70 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية على الجليد.
- زيادة صلاحية خلية CRC، تراكب الورم الذي يحتوي على الخلية الاصطناعية خارج الخلية المصفوفة على أورجانويدس الورم تعلق اصطناعية خارج الخلية المغلفة بمصفوفة جيدا 12 لوحة، كما هو موضح في الخطوة 4، 5. المقبل، احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة ترسيخ طلاء المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية وثم الثقافة أنه مع 1 مل المتوسط الثقافة أورجانويد CRC مع السفح 1% في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
- مراقبة الخلايا في 3 أيام بعد الإصابة تحت مجهر الأسفار لتأكيد ما يقارب 100% بروتينات فلورية خضراء الإيجابية نتيجة لاستخدام عيار عال جسيمات لينتيفيرال (انظر الشكل 2 أ).
- الثقافة أورجانويدس CRC لفترات 7-10 أيام لتوسيع نمو الخلايا قبل الحقن في الفئران المستفيدة.
7-جيل الانبثاث من أورجانويدس التجارة والنقل المسمى CRC في الفئران المستفيدة
ويرد في الشكل 1الإجراءات التجريبية لتوليد الانبثاث باستخدام أورجانويدس بروتينات فلورية خضراء المسمى CRC (الخطوة 7).
- لننأى أورجانويدس بروتينات فلورية خضراء المسمى CRC في تعليق خلية، حصادها آليا باستخدام مكشطة خلية عقيم وتحويلها إلى microtube 1.5 مل، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 6، 1).
- الطرد المركزي microtube لمدة 3 دقائق في س 1,400 زوإزالة متوسط الثقافة، وحل بيليه الخلية في 500 ميليلتر لبرنامج تلفزيوني عن طريق التنصت لطيف.
- الطرد المركزي في microtube لمدة 3 دقائق في 1,400 س ز والقضاء على برنامج تلفزيوني.
- تراكب 500 ميليلتر من محلول مفرزة الخلية على بيليه الخلية في الأنبوب ومزجها بالتنصت على لطيف. بعد ذلك، ترك مكانة الخليط لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة فصل انزيماتيكالي أورجانويدس CRC ملتصقة، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 6، 4).
- بلطف جداً "الماصة؛" تعليق خلية مع ميليلتر 500 إضافية 1% دميم FCS عدة مرات في microtube 1.5 مل تقريبا فصل الخلايا، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 6، 5). جيل خلايا المفردة من أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل قبل بيبيتينج قاسية ملحوظ يقلل بقاء الخلية. وهكذا، ترك يمكن كشفها بصريا في تعليق خلية كتلة الخلايا التي بيبيتينج بلطف جداً في microtube 1.5 مل.
- الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 3 دقائق في 1,400 س ز وإزالة المادة طافية.
-
وضع نموذج ماوس عفوية ورم خبيث من "بدكسس اتفاقية حقوق الطفل":
- إعداد تعليق خلية بما في ذلك 5 × 105 خلايا في 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 50% مصطنعة المصفوفة خارج الخلية الواحدة والماوس. الإبقاء على تعليق على الجليد قبل الاستخدام. استخدام هيموسيتوميتير لعد الخلايا السرطانية، كما هو مبين في الخطوة 4، 3.
- تخدير بماوس مع استنشاق إيسوفلوراني باستخدام جهاز التخدير استنشاق الحيوانات الصغيرة وتطهير الجلد مع الإيثانول 70%، كما هو مبين في الخطوة 1، 6.
- ضع الماوس وتد في موقف ضعيف على مقاعد البدلاء المختبر. فهم مخاطية المستقيم بملاقط معقمة واسحبه برفق خارج فتحه الشرج. ثم حقن فورا تعليق خلية إعدادها في الخطوة 7.7.1 إلى سوبموكوسا المستقيم من الماوس باستخدام حقنه (إبرة الحجم: 22 ز). وتستخدم الفئران 4 – 6 كل مجموعة بشكل روتيني، لتقييم النتائج.
-
لإنشاء نموذج تجريبي ورم خبيث من "بدكسس لجنة حقوق الطفل":
- إعداد تعليق خلية أورجانويد اتفاقية حقوق الطفل بما في ذلك 4 × 104 خلايا في 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للماوس. الإبقاء على تعليق على الجليد قبل الاستخدام. استخدام هيموسيتوميتير لعد الخلايا السرطانية (الخطوة 4، 3).
- تخدير بماوس مع استنشاق إيسوفلوراني باستخدام جهاز التخدير استنشاق الحيوانات الصغيرة وتطهير الجلد مع الإيثانول 70%، كما هو مبين في الخطوة 1، 6.
- ضع الماوس وتد أنيسثيتيزيد في موقف معرضة على مقاعد البدلاء المختبر. إجراء شق صغير في الجزء السفلي من الجناح الأيسر وثم قطع الصفاق فضح الطحال باستخدام مقص معقم والملقط بعناية. فهم في الأنسجة الدهنية التي تعلق على الطحال مع ملاقط معقمة، ثم ببطء بحقن 50 ميليلتر من تعليق خلية (أعدت الصيغة الواردة أعلاه، خطوة 8.1) الطحال. تكون على يقين من أن تعليق خلية يتم حقن مناسب دون التسرب إلى الخارج، ومن الطحال. وتستخدم الفئران 4 كل مجموعة بشكل روتيني، لتقييم النتائج.
- ضع جميع الفئران على وسادة دافئة بعد الجراحة والحفاظ على موقف راقد القصية حتى يتم استعادة الوعي الكافي، كما هو موضح في الخطوة 1، 11. وبمجرد الفئران شفوا تماما، إعادتها إلى اقفاصها المنزل. لمنع اﻻفتراس، لا تسمح بتربية مع الحيوانات غير تعمل في نفس القفص.
- التحقق من وجود تسرب خياطة وتأكيد أن الفئران هم على قيد الحياة، في المجموعة المعالجة جراحيا، في اليوم التالي. تحقق من الفئران لعلامات المرض وقياس أحجام الورم، استخدام الفرجار، في الفئران كل مرة واحدة في أسبوع.
- مراقبة الفئران للكشف عن ورم خبيث عفوية (لفترات تصل إلى 2.5 أشهر) وخبيث التجريبية (1 شهر) بعد الحقن.
- التضحية الفئران عن طريق التخدير والتفكك عنق الرحم في الأيام المشار إليها. تشريح الأورام الأولية والأنسجة المختلفة بما فيها الكبد والرئتين. ضع تشريح الأورام والأجهزة في 5 مل من برنامج تلفزيوني المثلج على 10 سم طبق بيتري وتخزينها على الجليد.
- للكشف عن الخلايا أورجانويد CRC الحاملات للتجارة والنقل، مراقبة تشريح الأنسجة تحت مجهر ستيريو-الأسفار. الحصول على الصور مع كاميرا CCD وإعداد باستخدام برامج معالجة الصور القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم غدية القولون الابتدائي شخصت باعتدال متمايزة مستأصل جراحيا من امرأة عمرها 76 تنم في تصنيف، المرحلة IIIa، متبوعاً بالعلاج الكيميائي بعد الجراحة. إيمونوهيستوتشيميكالي الخلايا CRC الابتدائي الملون إيجابية لكي-67 و carcinoembryonic antigen وعموم سيتوكيراتين ه-كادهيرين. تم زرع قطعة من الورم ريسيكتيد أيضا تحت الجلد في الفئران وتد لتوليد نموذج PDX القولون. ثم استخلصت الخلايا أورجانويد CRC لزراعة الأنسجة من PDX القولون التي وضعت تحت الجلد في هذه الفئران. أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل كانت قادرة على استمرار تشكيل مجموعات متعددة الخلايا أثناء سلسلة من الممرات في المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية. ورم أورجانويدس الأشيع ووراثيا تعكس طبيعة الأورام الأولية من المرضى5،6، حاولنا وضع نموذج ماوس التي تسمح في فيفو الكشف عن الخلايا أورجانويد CRC مع حساسية عالية أثناء نشر المنتشر. ولتحقيق هذا الهدف، كانوا مصابين أورجانويدس CRC lentivirus التجارة والنقل، مما يؤدي إلى ما يقرب من جميع أورجانويدس عرض بروتينات فلورية خضراء مشرقة جداً (الشكل 2A). وكانت هذه أورجانويدس ثم حقن أورثوتوبيكالي وإينتراسبلينيكالي في الفئران وتد الثانوية قبل الكشف عن الخلايا بروتينات فلورية خضراء-الإيجابية في الأجهزة البعيدة تحت مجهر الأسفار. لاحظنا تشكيل الأورام الأولية إيجابية بروتينات فلورية خضراء في موقع أورثوتوبيك في جميع الفئران الأربعة دراسة (الشكل 2B، اليسار). وعلاوة على ذلك، تم العثور على الانبثاث المجهري في رئات الفئران ثلاثة من أصل أربعة درست في أشهر 2.5 بعد حقن أورثوتوبيك (وسطالشكل 2B، ). وعلاوة على ذلك، لوحظت الانبثاث الكبد استجابة لحقن إينتراسبلينيك في الفئران الأربعة كل درس خلال شهر واحد بعد الحقن (الشكل 2B، حق).
تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن الأسفار بروتينات فلورية خضراء ذات الدقة العالية على الخلايا أورجانويد المستمدة من PDX CRC يسمح بالكشف عنها في كل من ميكروميتاستاسيس العفوية والتي طورت تجريبيا، في الأجهزة البعيدة، عندما قدم إلى المستلم الفئران. كما يوفر هذا الكشف عن حساسية عالية لنشر CRC المستمدة من PDX أورجانويدس في فيفو نموذج متعدد الاستخدامات لدراسة علم الأحياء من ورم خبيث، بل أيضا لتطوير العلاجات المستهدفة في الإعداد السريرية.
رقم 1: التمثيل التخطيطي لجيل الانبثاث أورجانويدس المستمدة من PDX CRC المسمى بالتجارة والنقل لينتيفيروس في الفئران وتد. (أ) غرس قطعة صغيرة من الأنسجة CRC تحت الجلد في الفئران وتد (الخطوة 1). وكان إلى قطع الأنسجة CRC تشريح جراحيا من المريض ومزروع تحت الجلد في الفئران وتد. الليبي: غرس تحت الجلد. (ب) توليد CRC أورجانويدس ينفصل عن بدكسس (الخطوة 2 – 4). تكثيفها CRC المتقدمة المفروم (الخطوة 2) وتحويلها إلى أنبوب 15 مل تحتوي على المتوسط الثقافة بما في ذلك كولاجيناز (الخطوة 3). وكان تعليق خلية لجنة حقوق الطفل بعد الحضانة مع الانفعالات بطيئة، المصفاة (الخطوة 3). ثم كان تعليق خلية أورجانويد في المتوسط أورجانويد CRC المصنف على لوح معدني مغلف بالمصفوفة خارج الخلية اصطناعية والمحتضنة بين عشية وضحاها في حاضنة2 CO (الخطوة 4). الخلايا أورجانويد حقوق الطفل تعلق على المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية أيضا مغطاة بطبقة إضافية من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية والمحتضنة في حاضنة2 CO (الخطوة 4). الليبي: غرس تحت الجلد. (ج) توليد CRC أورجانويدس ترانسدوسيد بجسيمات لينتيفيرال التجارة والنقل قبل استخدام الحقن في الفئران المستفيدة (الخطوة 5 – 7). تم إنشاؤها الجسيمات لينتيفيرال التجارة والنقل في عيار عالية (الخطوة 5). أورجانويدس المستمدة من PDX CRC نمت في المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية مباشرة تحصد مع مكشطة خلية وتحويلها إلى microtube (الخطوة 6). بعد الطرد المركزي، كان بيليه الخلية إعادة معلقة في برنامج تلفزيوني. تم فصل تعليق خلية وبيليه خلية تم فصله. ثم، كان المحتضنة تعليق خلية أورجانويد CRC مع مخزون الفيروس بروتينات فلورية خضراء في الأجلين المتوسط والثقافة أورجانويد اتفاقية حقوق الطفل على لوحة المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية المصطنعة بين عشية وضحاها في حاضنة2 CO (الخطوة 6). الخلايا أورجانويد حقوق الطفل تعلق على المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية كانت مغطاة بطبقة إضافية من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية والمحتضنة في حاضنة2 CO ترسيخ طلاء المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية (الخطوة 6). ثم جرى مثقف أورجانويدس CRC لفترات 7-10 أيام لتوسيع نمو الخلايا (الخطوة 6). وضع نموذج خبيث عفوية، ينتابها 5 × 105 CRC أورجانويد الخلايا المسمى مع بروتينات فلورية خضراء علقت في 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية 50% تم حقن أورثوتوبيكالي وتد الفئران (الخطوة 7). لإنشاء نموذج تجريبي ورم خبيث، 4 × 104 CRC أورجانويد الخلايا المسمى مع التجارة والنقل في 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني تم حقن إينتراسبلينيكالي وتد الفئران (الخطوة 7). و. ت.: حقن أورثوتوبيك، دربهم: حقن إينتراسبلينيك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مثقف التصور "الاستبانة للتجارة والنقل" التي اكتشفت في اتفاقية حقوق الطفل المسمى التجارة والنقل أورجانويدس والأورام الأولية وميكروميتاستاسيس. (أ) قرابة 100% من مثقف CRC أورجانويدس هي التجارة والنقل الإيجابي. تم القبض على الصور باستخدام مجهر الأسفار ستيريو. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. (ب) التجارة والنقل-الإيجابية في الورم الرئيسي وميكروميتاستاسيس في الرئتين والكبد. تعليق خلية أورجانويد CRC معربا عن بروتينات فلورية خضراء معزولة تم حقن submucosa المستقيم (و. ت. inj.) من الفئران وتد. وترد معظم الخلايا السرطانية أن تكون إيجابية بالنسبة للتجارة والنقل في الورم الرئيسي. وترد أيضا ميكروميتاستاسيس بروتينات فلورية خضراء-إيجابية استعمار الرئتين (المشار إليها سهم). وعلاوة على ذلك، يتم الكشف عن الحاملات للتجارة والنقل ميكروميتاستاسيس في الكبد (المشار إليها سهم)، عند تعليق خلية تم حقن إينتراسبلينيكالي (هو inj.) في الفئران. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن نموذج PDX اتفاقية حقوق الطفل قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة نمو الورم الرئيسي، ما إذا كان هذا النموذج ينطبق أيضا على التحقيق في ورم خبيث قد لا بعد تم تماما توضيحها. وكانت أيضا الانبثاث العفوية بالكاد يمكن كشفها في الكبد والرئتين من مختلف عن القولون PDX نماذج4،10. للكشف عن ميكروميتاستاسيس مع حساسية عالية، يمكننا وضع بروتوكول ترانسدوسينج جزيئات بروتينات فلورية خضراء لينتيفيرال في أورجانويدس المستمدة من PDX حقوق الطفل قبل أورثوتوبيك والحقن الوريدية إلى الفئران المستفيدة. من المذكرة، كنا قادرين على إظهار أن هذا الأسلوب يتيح الكشف عن درجة عالية من الحساسية لحقوق الطفل المستمدة من أورجانويد ميكروميتاستاسيس، تشكيل عفويا وتجريبيا، في الأجهزة البعيدة.
وتشمل الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول الحفاظ على تشكيل كروي سليمة دون تحريض anoikis في المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية بلطف بيبيتينج أورجانويدس حقوق الطفل خلال سلسلة باساجينج. إعداد الجسيمات lentivirus عيار عالية تتركز تنبيذ فائق مهم أيضا لتحقيق في 100 ٪ بروتينات فلورية خضراء الإيجابية على ما يقرب من اتفاقية حقوق الطفل أورجانويدس. وعلاوة على ذلك، من المستحسن أن أورجانويدس بروتينات فلورية خضراء المسمى CRC يكون حقن في غضون 10-14 يوما في الفئران المستفيدة. قد يفضلون فترات مفرطة في الطول لتوسيع أورجانويدس حقوق الطفل بعد الإصابة بتحديد أورجانويدس ضعيفة إذ تعرب عن التجارة والنقل.
حقن أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل إلى سوبموكوسا المستقيم وتد الفئران أظهرت نشرها المنتشر في الرئتين، على الرغم من أن ليس في الكبد، ويفترض من خلال الأجوف فينا أقل شأنا. لإنشاء الانبثاث الكبد عفويا، سيكون ضخ أورجانويدس CRC في القولون مع فتح البطن مطلوب13.
علما بأن حالات الإصابة بالأورام الليمفاوية بالخليه في بعض الأحيان زيادة في الفئران العوز وتد مزروع بالانسجة بما في ذلك الخلايا الليمفاوية، المصابين أونكوفيروس ابشتاين-بار، من المرضى الإنسان14. ولذلك فمن المعقول أن يوصي بأن ما إذا كانت الأورام الناشئة تنبع من اتفاقية حقوق الطفل البشري مزروع يحدد أداء immunohistochemistry استخدام علامات الخلية البشرية اتفاقية حقوق الطفل، مثل carcinoembryonic antigen وسيتوكيراتين 20.
كما أننا التحقيق أورجانويدس CRC المستمدة من مريض واحد فقط، سيكون من الضروري عينات أكثر من عدد أكبر من المرضى الذين سينظر إلى تعميم النتائج التي توصلنا إليها في المستقبل. إذا مزروع أورجانويدس المستمدة من PDX CRC إظهار الحد الأدنى من النمو في موقع أورثوتوبيك، ونادراً ما الانبثاث النموذج في مواقع بعيدة، محققين مدعوة إلى النظر في استخراج حقوق الطفل أورجانويدس من بدكسس المختلفة المستمدة من المريض.
الكشف عن درجة عالية من الحساسية ميكروميتاستاسيس المسمى بروتينات فلورية خضراء تحقيقه مع هذا الأسلوب يشجع لنا ليس فقط بمواصلة التحقيق في عدة قضايا البيولوجية التي لم يتم حلها فيما يتعلق بانتقال ميكروميتاستاسيس إلى ماكروميتاستاسيس، تشكيل اللحمية المتخصصة لاستعمار المنتشر واكتساب المقاومة للأدوية، ولكن أيضا لتقييم بلغت أدوية جديدة مضادة للسرطان عن طريق استخدام الحيوانات PDX الحاملة كنماذج الإكلينيكية.
بروتينات فلورية خضراء-على أساس نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز من المعيشة أورجانويدس CRC المستخرجة من المواقع الأساسية والبعيدة أيضا لديه القدرة على السماح للامتحانات واحد يستند إلى الخلية من التعبير الجيني، فضلا عن لمحات جينية و metabolomic، من وجود ورم. هذه النتائج قد يؤدي إلى توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء نشر المنتشر من أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا تضارب محتمل في المصالح الكشف.
Acknowledgments
هذا العمل وأيده "جونتيندو جامعة يونغ محقق الجائزة" (2013 و 2014 و 2015) يو، و "منح المشروع المشترك" (2013 و 2014) إلى ك. م.، ومنح المعونة "البحث العلمي" من وزارة التربية والتعليم والثقافة، والرياضة والعلوم و التكنولوجيا، اليابان (16 15625 ك إلى ك. ي. و 16 ك 15598 للشخص). ونحن ممتنون خاصة لجميع أعضاء قسم الجراحة كولوبروكتولوجيكال و "علم الأمراض الجزيئية" للمناقشات المفيدة والدعم التقني. كما نشكر الدكتور هيرويوكي كونو (جامعة هاماماتسو شولوف الطب) والدكتور هيديكي كيتاجيما (الجامعة الدولية للصحة والرعاية الاجتماعية) على التوجيه التقني السخي في الإجراءات الجراحية لزرع أورثوتوبيك في الفئران والدكتور. يوشيتاكا فرس النهر (مركز شيبا للسرطان) للمشورة التقنية بشأن أداء الثقافة أورجانويد الورم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
