Summary
Om zeer gevoelige detectie van de verspreiden menselijke colorectaal carcinoom (CRC) cellen koloniseren van weefsels, tonen we hierin een protocol voor efficiënte transductie van groen fluorescent proteïne (GFP) lentivirale deeltjes in PDX-afgeleide CRC organoid cellen voorafgaand aan hun injectie in ontvangende muizen, met stereo-fluorescentie microscopische observatie.
Abstract
Ondanks de huidige vooruitgang in de behandeling van menselijke colorectal kanker (CRC) zijn paar radicale therapieën effectief voor de late stadia van CRC. Te overwinnen deze klinische uitdaging, tumor xenograft Muismodellen met behulp van reeds lang gevestigde cellijnen van menselijke carcinoom en vele transgene muismodellen met tumoren zijn ontwikkeld als preklinische modellen. Ze gedeeltelijk na te bootsen de kenmerken van menselijke carcinomen, maar vaak niet de belangrijkste aspecten van menselijke maligniteiten waaronder invasie en metastase recapituleren. Alternatieve modellen die beter de kwaadaardige progressie in menselijke CRC vertegenwoordigen hebben zo lang gewacht.
Hierin laten we generatie van patiënt-afgeleide tumor xenografts (PDXs) door onderhuidse implantatie van kleine CRC fragmenten operatief ontleed van een patiënt. De dikke darm-PDXs ontwikkelen en histopathologically lijken op de CRC in de patiënt. Echter, een paar spontane micrometastasen aantoonbaar in conventionele dwarsdoorsneden van aangetaste verre organen in het PDX-model. Ter vergemakkelijking van de opsporing van metastatische verspreiding in verre organen, we gewonnen van de tumorcellen organoid uit de PDXs van de dikke darm in cultuur en besmet ze met GFP lentivirus vóór injectie in zeer immunodeficiëntie knik/Shi-scid IL2Rγnull (NOG) muizen. Orthotopically geïnjecteerd PDX-afgeleide CRC organoid cellen consequent formulier primaire tumoren positief voor GFP in ontvangende muizen. Bovendien ontwikkelen spontaan micrometastatic kolonies GFP uitdrukken met name in de longen van deze muizen met fluorescentie microscopie worden gesignaleerd. Intrasplenic injectie van CRC organoids produceert bovendien vaak hepatische kolonisatie. Samen genomen, deze bevindingen wijzen erop GFP-gelabelde PDX-afgeleide CRC organoid cellen zijn visueel detecteerbaar een meerstaps tijdens de invasie-metastase cascade genoemd. De beschreven protocollen omvatten de oprichting van PDXs van menselijke CRC en 3D cultuur van de corresponderende CRC organoid cellen getransduceerde door GFP lentivirale deeltjes.
Introduction
Colorectal kanker (CRC) is de tweede belangrijkste oorzaak van kanker doden wereldwijd1. De ontoereikende reactie op conventionele therapieën voor patiënten met de ziekte gevorderd stadium geeft aan de ondoeltreffendheid van de pogingen om de CRC's radicaal te genezen. Ontwikkeling van meer effectieve therapeutische benaderingen, zijn verschillende preklinische Muismodellen van kanker die de kenmerken van de CRC's na te bootsen vastgesteld. Verschillende CRC cellijnen zijn wijd gebruikt voor het genereren van tumor xenografts als gevolg van hun gebruiksgemak en manipulatie. Langetermijnkweek van kanker cellijnen, veroorzaakt echter vaak selectie van unieke cel populaties die heel proliferatieve onder de voorwaarde van een bepaalde cultuur, daardoor resulterend in onbetrouwbare resultaten en cruciale beperkingen in preklinische drug ontwikkeling.
Zonder gekweekt in vitro, zijn patiënt-afgeleide tumor xenografts (PDXs) ook gegenereerd door implantatie in diermodellen van menselijke CRC weefsels die operatief ontleed van patiënten2,3,4. PDXs op brede schaal erkend als de belangrijkste histopathologische kenmerken Recapitulerend en genetische wijzigingen oorspronkelijk in tumoren van de patiënten waarvan ze zijn afgeleid. Bovendien, patiënt-afgeleide tumor organoids samengesteld van tumor cel clusters werden opgericht door cultuur onder 3D omstandigheden dat nauw deed de biologische eigenschappen van de originele tumoren5,6. Deze tumor organoids werden ook toegepast voor high-throughput drug screening, waardoor gepersonaliseerde therapieën ontworpen5. Echter sterk heterogene CRC populaties wordt verondersteld dat zijn aanwezig in een tumor massa. Bijzondere CRC populaties kunnen selectief vermenigvuldigen en uit te breiden tijdens de in vivo en in vitro series van passages van PDX en tumor organoids, respectievelijk. Dit kan ook toestaan de algehele gene expressieprofielen en epi/genetische status van de getroffen CRC's te veranderen, daardoor resulterend in minimale gelijkenis met de ouderlijke CRC.
Patiënt afkomstige CRC organoids en die geëxtraheerd uit noncancerous menselijke Colón ontworpen naar harbor combinaties van oncogene mutaties ook gewerkt hebben aan het onderzoeken van de kenmerken van menselijke tumorcellen wordt geïllustreerd door tumor invasie en metastase 6,7,8,9. Echter, de zeer lage incidentie van spontane uitzaaiing als gevolg van orthotopic implantatie van patiënt-afgeleide CRC naar immunodeficiëntie muizen, heeft het moeilijk gemaakt om te studeren het meerstaps proces van de invasie-metastase cascade waarin lokale invasie, intravasation, vervoer in de bloedbaan, de extravasation en de kolonisatie van verre organen4,10. Micrometastasis als vertegenwoordigd door tumor cel afzetting van ≤2 mm, gevormd door de patiënt afkomstige CRC organoids, heeft vaak over het hoofd gezien op histopathologisch analyse van secties van aangetaste verre organen in experimentele Muismodellen. Visualisatie van spontane micrometastasen geweest ook minimale in-vivo als gevolg van de moeilijkheid van de efficiënt invoering fluorescente markeringen in organoid tumorcellen voorafgaand aan hun injectie in ontvangende muizen. In deze studie, ontwikkelden we een protocol kunnen efficiënt transduce GFP lentivirus in PDX-afgeleide CRC organoid cellen in 3D cultuur vóór injectie in ontvangende muizen en kunnen zeer gevoelige detectie, stereo-fluorescentie microscopie, in dienst van hun kolonisatie van de verschillende organen te formulier micrometastasen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De patiënt verstrekte schriftelijke geïnformeerde toestemming en het project werd goedgekeurd door de ethische commissie van onderzoek van de Juntendo Universiteit faculteit geneeskunde. De muis experimenten werden ook goedgekeurd door het dier onderzoek ethisch comité van de Juntendo faculteit van geneeskunde.
1. oprichting van CRC PDXs in immunodeficiëntie muizen
Experimentele procedures voor de vaststelling van CRC PDXs (stap 1) worden beschreven in figuur 1A.
- Bereid het primaire CRC weefsel onmiddellijk na chirurgische resectie van de tumor van de patiënt.
- Wash de primaire CRC weefsel door zachte agitatie meerdere malen in 30 mL ijskoud steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een conische tube van 50 mL en bewaar deze op ijs.
- Plaats het weefsel op een 10 cm petrischaal met steriel pincet, verwijderen van necrotisch gebieden zo uitgebreid mogelijk met behulp van steriele schaar en de solide tumor weefsels op kleine stukjes (5 x 5 x 5 mm3 in grootte) gesneden met behulp van steriele Scheermesjes.
Opmerking: Necrotic gebieden zijn vaak meer brokkelige dan de omliggende gebieden, witter en zachter. - Leg de kleine stukjes van de tumor met steriel pincet in 2 mL zuiver ijskoude steriel PBS op een plaat van 6-well.
- Fokken van 6 weken oude knik/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) zeer immunodeficiëntie muizen voorwaarden kiem-gratis en specifieke pathogen-gratis.
- Anesthetize van de muizen met Isofluraan inhalatie met behulp van het kleine dierlijke inademing verdoving apparaat en desinfecteren van de huid met 70% ethanol. Verzekeren van het normale tarief en de diepte van de ademhaling en het ontbreken van een teen snuifje reflex voor juiste afstomping. Dierenarts zalf op de ogen is een optie, om te voorkomen dat oogbeschadigingen en/of droogheid terwijl onder verdoving.
- Alle chirurgische instrumenten met behulp van droge hitte sterilisatie steriliseren en vervolgens met deze hulpmiddelen voor alle procedures ter voorkoming van infecties van de wond in ontvangende muizen.
- Plaats de narcose muis in een liggend op de Bank laboratorium. Maak een kleine incisie op de onderste delen van de rechter en linker flank van de ontvangende muis voor het genereren van subcutane zakken voor weefsel implantatie met behulp van steriele schaar. Wees voorzichtig niet te doorprikken de peritoneale membraan. Moet er weinig bloeden met deze procedure.
- Voorzichtig Dompel het bovenstaande bereid tumor fragmenten in 50 µL van kunstmatige extracellulaire matrix en implantaat hen vervolgens in de onderste delen van de rechter en linker subcutane zakken.
- Sutuur (geologie) de incisie met wond clips in de muizen chirurgische ingrepen ondergaan. Zorg ervoor dat de tumor van de geïmplanteerde weefsels zich op enige afstand van de incisie onder de huid bevinden.
Opmerking: Overeenkomstig het minimaliseren van chirurgische ingrepen, geen behandelingen voor post chirurgische pijn en infectie werden toegediend in deze studie. - Plaats de muis op een warme pad en de sternale ligfiets positie handhaven totdat voldoende bewustzijn is hersteld. Eenmaal volledig herstelde en kundig voor zitten op alle vier poten, kunnen de muizen worden teruggebracht naar hun huis kooien. Voorkom predatie en laat niet fokken met dieren niet bediende in de dezelfde kooi.
- Controleer op lekkage van de hechtdraad en bevestigen dat de muizen in stabiele toestand de volgende dag, in de chirurgisch behandelde groep. Controleer de muizen op tekenen van ziekte en meet de grootte van de tumor in elke muis, eenmaal per week, met remklauwen.
2. dissectie van CRC PDXs van muizen
Experimentele procedures voor dissectie van CRC PDXs (stap 2) worden beschreven in figuur 1B.
- Toestaan dat de tumor groeien subcutaan tot ~ 1 cm3 in grootte, die meestal ongeveer 1-3 maanden duurt.
- Anesthetize van de muis met Isofluraan inhalatie met behulp van het kleine dierlijke inademing verdoving apparaat en desinfecteren van de huid met 70% ethanol.
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een liggend op de Bank laboratorium. Incise van de huid, bloot van de tumor en zorgvuldig het loskoppelen van de huid van de tumor met behulp van steriele schaar. Na het verwijderen van de tumor, plaatst u deze op een 10 cm petrischaal en grove necrotische regio's verwijderen van de tumor, dan spoel tweemaal met 5 mL PBS.
Opmerking: Necrotic gebieden zijn vaak meer brokkelige dan de omliggende gebieden, witter en zachter. -
Plaats van de tumor op ijs en gelijkelijk verdelen in ten minste 4 delen voor verschillende toepassingen, met inbegrip van 1) de CRC organoid cultuur, 2) transplantatie in secundaire muizen, 3) histopathologisch onderzoek en 4) invriezen en opslag van de fragmenten van de tumor.
- Voor de generatie van de CRC organoids, de solide tumor weefsel op een 6 cm petrischaal met 1 mL steriele PBS te plaatsen. Houd het weefsel op ijs totdat zij verwerkt (stap 3).
- Om vast te stellen het PDX-model voor menselijke CRC, passage de verse CRC PDXs in een secundaire muis. Snijd de tumor weefsel in kleine stukjes (5 x 5 x 5 mm3 formaat) met behulp van steriele scheermesjes en voorzichtig Dompel deze fragmenten weefsel in 50 µL van kunstmatige extracellulaire matrix. Vervolgens implantaat deze fragmenten in de onderste delen van de rechter en linker subcutane zakken van de muis NOG, zoals beschreven in stap 1.8 – 1.11.
- Voor histologisch analyse, bevestigen de monsters in 5 mL 10% neutraal gebufferde formaline in een conische tube van 15 mL bij kamertemperatuur voor 2 dagen.
- Voor cryopreservatie, snijd de tumor weefsel in kleine stukjes (5 x 5 x 5 mm3 in grootte) en voorzichtig Dompel de monsters in 500 µL van cel bevriezing oplossing in 1-1.5 mL cryovial buizen. Breng de buis naar een vriezer-80 ° C.
3. extractie van PDXs in de celsuspensie voor de CRC Organoid cultuur
Experimentele procedures voor dissociatie van CRC PDXs (stap 3) worden beschreven in figuur 1B.
- Plaats de bovenstaande (stap 2.4.1) bereid tumor fragmenten op een 10 cm petrischaal.
- Mince de fragmenten met behulp van steriele scheermesjes en ze vervolgens overbrengen naar een conische tube van 15 mL, met 8 mL 10% foetaal kalfsserum (FCS)-Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met 80 µL van collagenase enzym materieel (Zie Tabel van materialen).
- Sluit de buis strak en wikkel het GLB met parafilm ter voorkoming van lekkage. Om zich te distantiëren van de gehakt tumor fragmenten in de celsuspensie, doorroeren het zachtjes gedurende 2 uur bij 37 ° C. Er rekening mee dat er nog steeds vele fragmenten van onverteerd weefsel blijft in de buis.
- Centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie. Lossen van de pellet van de cel met behulp van 10 mL 10% FCS-DMEM te maken van de celsuspensie.
- Filteren om te elimineren onverteerd weefsel puin, de celsuspensie tweemaal met behulp van de 40 µm cel zeef instellen op een conische buis van 50 mL. Vervolgens Centrifugeer de doorstroming bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en houd van de pellet op ijs.
4. generatie van de CRC Organoids gekweekt op kunstmatige extracellulaire Matrix
Experimentele procedures voor de CRC organoid cultuur van de dikke darm PDXs (stap 4) worden beschreven in figuur 1B.
- Stellen een kweekmedium geschikt voor het PDX-afgeleide CRC organoids (Zie Tabel van materialen, "de voedingsbodem van de CRC-organoid") dienst media eerder beschreven voor menselijke Colón organoids11.
- Breng 150 µL van kunstmatige extracellulaire matrix (Zie Tabel van materialen) per goed op een 12-well plaat op ijs en het vervolgens Incubeer gedurende 30-60 min. in een 37 ° C, 5% CO2 incubator te stollen de gels.
- Opschorten van de pellet van de cel uit stap 3.5 met het CRC organoid kweekmedium (uit stap 4.1) met 5% FCS tot aanpassing aan de 3 x 105 cellen/mL. Beënt vervolgens 1 mL van het medium op de kunstmatige extracellulaire matrix beklede plaat bereid in stap 4.2. en na een nacht bebroeden bij 37 ° C minder dan 5% CO2. Gebruik een hemocytometer voor het tellen van het aantal tumorcellen met inbegrip van afzonderlijke cellen en meercellige clusters (een groep van Adherente cellen) in de celsuspensie.
Opmerking: FCS van 5% wordt gebruikt voor het doven van de resterende enzymatische activiteit van collagenase in deze studie. - Zorgvuldig verzamelen het kweekmedium, met inbegrip van zwevende cellen die hebben losgemaakt van de kunstmatige extracellulaire matrix beklede plaat, in een 1,5 mL Centrifugeer buis op de volgende dag samen en Centrifugeer het bij 1.400 x g gedurende 5 min. Vervolgens Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 70 µL van kunstmatige extracellulaire matrix op ijs.
- Het vergroten van de levensvatbaarheid van de cellen van de CRC, bedekken de tumor cel-bevattende kunstmatige extracellulaire matrix op de organoid van de tumor cellen gekoppeld aan de kunstmatige extracellulaire matrix beklede plaat en incubeer gedurende 30 min. in een 37 ° C, 5% CO2 incubator te stollen de kunstmatige extracellulaire matrix coating. Vervolgens, Incubeer het met 1 mL van het CRC organoid cel kweekmedium met 1% FCS bij 37 ° C onder 5% CO2.
- Wijzig het kweekmedium elke tweede dag. Zoals de CRC organoids het medium vullen, kan het nodig zijn om te veranderen het medium dagelijks geworden.
5. generatie en verrijking van GFP lentivirale deeltjes
Experimentele procedures voor generatie en verrijking van GFP lentivirale deeltjes (stap 5) worden beschreven in Figuur 1 c.
- HEK293T cellen met Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 gemiddeld met 10% FCS cultuur en zes gerechten van 10 cm (2 x 106 cellen per schotel) voorbereiden op de volgende transfectie procedure.
- Voor Transfectie per schotel, bereiden 500 µL van het mengsel met inbegrip van 20 µL van het transfectiereagens in DMEM met een PRRL-GFP vector (5 µg)12 en twee lentivirale verpakking plasmiden, zoals pCMV-VSV-G (1 µg) en pCMV-dR8.2 dvpr (5 µg), in een steriele 1,5 mL microtube. Houd het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten en vervolgens bedekken op elk van de 10-cm schotels en hen Incubeer gedurende 18 h.
- Verwijderen van het medium, voeg 5 mL van vers 10% FCS-RPMI 1640 medium aan elk gerecht en laat staan gedurende 24 uur.
- Het geconditioneerde medium van elk gerecht in een tube van 50 mL centrifuge verzamelen en opslaan van een totaal van 30 mL van het medium bij 4 ° C's nachts. Voeg 5 mL van de verse RPMI 1640 op elk gerecht en laat staan gedurende 24 uur.
- Het geconditioneerde medium van elk gerecht in een tube van 50 mL centrifuge en blijven, in totaal, 30 mL van het medium op ijs verzamelen. Gooi vervolgens de cellen.
- 60 mL van het medium (uit stap 5.4-5.5) wordt gefiltreerd door een 0,45 µm filter te verwijderen van de cellen en deze hoeveelheid verdelen in twaalf 5 mL polypropyleen centrifuge buizen voor ultracentrifugatie.
- Te concentreren virus, centrifugeer ze met behulp van een swingende emmer rotor (Zie Tabel van materialen) 85,327 x g gedurende 1,5 uur bij 4 ° C.
- Onmiddellijk verwijderen van het medium. Voor het oplossen van de geconcentreerde virus pellet, plaats van 250 µL van de nutriënt Ham mengsel F-12 (F12) / DMEM medium zonder FCS in elk van de twaalf buizen en onderhouden bij 4 ° C's nachts. Merk op dat het virus pellet is vaak onzichtbaar.
- Pipetteer zachtjes het medium voor het verzamelen van 3 mL van de geconcentreerde 5 x GFP lentivirus voorraad, in totaal, vermoedelijk met inbegrip van de lentivirale deeltjes GFP met 10 transducing8 -eenheden per mL (TU/mL). Sla de twaalf 1,5 mL slangen (inclusief 250 µL per buis) onder steriele omstandigheden bij-80 ° C gedurende maximaal een jaar. Veel kleine porties van de oorspronkelijke oplossing om te voorkomen dat meerdere freeze-dooi cycli voor te bereiden.
6. etikettering van CRC Organoid cellen met GFP lentivirale deeltjes gekweekte op kunstmatige extracellulaire Matrix
Experimentele procedures voor de etikettering van de CRC organoid cellen met GFP lentivirus (stap 6) worden beschreven in Figuur 1 c.
- De CRC organoids bereid in stap 4.6 te groeien zonder interferentie voor 7-10 dagen en te oogsten hen mechanisch met behulp van een steriele cel schraper ze dan vervolgens overbrengen naar een 1,5 mL microtube toestaan.
Opmerking: De groei van CRC organoids in cultuur hangt af van de aard van de oorspronkelijke tumoren van patiënten. Vermijd overmatige groei van de CRC organoids, door hen bij 60-70% samenvloeiing voorafgaand aan de overdracht met een onderlinge splitsingsverhouding van 1:2, op een nieuwe kunstmatige extracellulaire matrix beklede 12-well bord. - Centrifugeer het microtube gedurende 3 minuten op 1.400 x g, het kweekmedium verwijderen en oplossen van de cel pellet in 500 µL van PBS door zacht te onttrekken.
- Centrifugeer het microtube gedurende 3 minuten op 1.400 x g en elimineren van PBS.
- Om zich te distantiëren van het aanhangend CRC organoids, voeg 500 µL van een mobiele-detachement oplossing van Proteolytische en collagenolytic enzymen naar de cel pellet in de buis en meng het door zacht te onttrekken. Vervolgens laat de buizen te vestigen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Pipetteer heel voorzichtig de celsuspensie met een extra 500 µL van 1% FCS-DMEM meerdere malen in een 1,5 mL microtube aan ongeveer distantiëren van de cellen. Generatie van afzonderlijke cellen van de CRC organoids door harde pipetteren vermindert aanzienlijk levensvatbaarheid van de cellen. Het is dus essentieel om de massa van cellen visueel waarneembaar in de celsuspensie door heel zachtjes in een 1,5 mL microtube pipetteren.
- De celsuspensie gedurende 3 minuten op 1.400 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Lossen van de cel pellet met een mengsel van de 100 µL van 5 x GFP lentivirus voorraad (> 108 TU/mL) en 400 µL van de CRC organoid voedingsbodem in een 1,5 mL microtube door zacht te onttrekken aan te passen aan een concentratie van 5 x 10,5 losgekoppeld tumorcellen per 500 µL . Gebruik een hemocytometer voor het tellen van het aantal tumorcellen, met inbegrip van afzonderlijke cellen en groepen van cellen in de celsuspensie, zoals eerder beschreven (stap 4.3).
- Bereiden een kunstmatige extracellulaire matrix beklede 12-well plaat, zoals beschreven in stap 4.2. Vervolgens plaatst u 500 µL van de celsuspensie bereid in stap 6.7 op de plaat en laat het gedurende 18 uur bij 37 ° C onder 5% CO2.
- Het verzamelen van het medium met de zwevende cellen los van de kunstmatige extracellulaire matrix beklede plaat in een tube van 1,5 mL centrifugeren. Centrifugeer het bij 1.400 x g en vervolgens Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 70 µL van kunstmatige extracellulaire matrix op ijs.
- Het vergroten van de levensvatbaarheid van de cellen van de CRC, bedekken de tumor cel-bevattende kunstmatige extracellulaire matrix op de tumor organoids gekoppeld aan de kunstmatige extracellulaire matrix beklede 12-well plaat, zoals beschreven in stap 4.5. Volgende, Incubeer de plaat gedurende 30 min. in een 37 ° C, 5% CO2 incubator stollen de kunstmatige extracellulaire matrix coating en vervolgens cultuur het met 1 mL van het CRC organoid kweekmedium met 1% FCS bij 37 ° C onder 5% CO2.
- 3 dagen na infectie onder een fluorescentie Microscoop te bevestigen van bijna 100% GFP positiviteit als gevolg van het gebruik van een hoge titer van lentivirale deeltjes (Zie figuur 2A) de cellen worden nageleefd.
- Cultuur de CRC organoids voor periodes van 7-10 dagen uit te breiden van de celgroei vóór injectie in ontvangende muizen.
7. generatie van metastasen door GFP-geëtiketteerden CRC Organoids in ontvangende muizen
Experimentele procedures voor generatie van metastasen met behulp van het GFP-gelabelde CRC organoids (stap 7) worden beschreven in Figuur 1 c.
- Om zich te distantiëren van het GFP-geëtiketteerden CRC organoids in de celsuspensie, oogst hen mechanisch met behulp van een steriele cel schraper en ze vervolgens overbrengen naar een 1,5 mL microtube, zoals eerder beschreven (stap 6.1).
- Centrifugeer het microtube gedurende 3 minuten op 1.400 x g, het kweekmedium verwijderen en oplossen van de cel pellet in 500 µL van PBS door zacht te onttrekken.
- Centrifugeer het microtube gedurende 3 minuten op 1.400 x g en elimineren van PBS.
- Overlay 500 µL van de mobiele-detachement oplossing op de cel pellet in de buis en meng het door zacht te onttrekken. Vervolgens laat het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur enzymatisch verwerpen het aanhangend CRC organoids, zoals eerder beschreven (stap 6.4).
- Pipetteer heel voorzichtig de celsuspensie met een extra 500 µL van 1% FCS-DMEM meerdere malen in een 1,5 mL microtube aan ongeveer distantiëren van de cellen, zoals eerder beschreven (stap 6.5). Generatie van afzonderlijke cellen van de CRC organoids door harde pipetteren vermindert aanzienlijk levensvatbaarheid van de cellen. Dus, laat de massa van cellen visueel waarneembaar in de celsuspensie door heel zachtjes in een 1,5 mL microtube pipetteren.
- De celsuspensie gedurende 3 minuten op 1.400 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie.
-
Om een spontane metastase muismodel van CRC PDXs:
- Bereid een celsuspensie, met inbegrip van 5 x 105 cellen in 50 µL van PBS met 50% kunstmatige extracellulaire matrix per muis. De opschorting op ijs vóór gebruik te handhaven. Gebruik een hemocytometer voor het tellen van de kankercellen, zoals aangegeven in stap 4.3.
- Anesthetize van een muis met Isofluraan inhalatie met behulp van het kleine dierlijke inademing verdoving apparaat en desinfecteren van de huid met 70% ethanol, zoals aangegeven in stap 1.6.
- Plaats de muis NOG in een liggende positie op de laboratorium-Bank. Pak de rectale mucosa met een steriel pincet en trek het voorzichtig uit de anus. Vervolgens onmiddellijk het injecteren van de celsuspensie bereid in stap 7.7.1 in de rectale submucosa van de muis met een injectiespuit (Maat breinaald: 22 G). Routinematig, worden 4 – 6 muizen per groep gebruikt om de resultaten te evalueren.
-
Om een model van de experimentele metastase van CRC PDXs:
- Bereid een celsuspensie van de CRC organoid met inbegrip van 4 x 104 cellen in 50 µL van PBS per muis. De opschorting op ijs vóór gebruik te handhaven. Gebruik een hemocytometer voor het tellen van de kankercellen (stap 4.3).
- Anesthetize van een muis met Isofluraan inhalatie met behulp van het kleine dierlijke inademing verdoving apparaat en desinfecteren van de huid met 70% ethanol, zoals aangegeven in stap 1.6.
- Plaats de narcose NOG muis in een liggend op de Bank laboratorium. Maken een kleine snede in het onderste gedeelte van de linkerflank en dan snijd het buikvlies om zorgvuldig de milt met behulp van steriele schaar en pincet bloot te stellen. Begrijpen van het vetweefsel, gekoppeld aan de milt met een steriel pincet en langzaam 50 µL van de celsuspensie (opgesteld zoals hierboven, stap 8.1) te injecteren in de milt. Er zeker van zijn dat de celsuspensie op passende wijze wordt geïnjecteerd zonder uiterlijke lekkage, van de milt. Routinematig, worden 4 muizen per groep gebruikt om de resultaten te evalueren.
- Plaats alle muizen op een warme pad na de operatie en een sternale ligfiets positie handhaven totdat voldoende bewustzijn is hersteld, zoals beschreven in stap 1.11. Zodra de muizen hebben volledig hersteld, terugsturen naar hun thuis kooien. Voorkom predatie en laat niet fokken met dieren niet bediende in de dezelfde kooi.
- Sutuur (geologie) lekkage controleren en te bevestigen dat de muizen in leven, in de chirurgisch behandelde groep, de volgende dag zijn. Controleer de muizen op tekenen van ziekte en maatregel tumor maten, remklauwen, in alle muizen eenmaal per week in dienst.
- Observeren muizen om spontane metastase (voor periodes van maximaal 2,5 maanden) en experimentele metastase (1 maand) te detecteren na injectie.
- Offeren de muizen via de narcose en cervicale dislocatie op de aangegeven dagen. Ontleden primaire tumoren en verschillende weefsels, met inbegrip van de lever en de longen. Plaats de ontleed tumoren en organen in 5 mL ijskoud PBS op een 10 cm petrischaal en sla deze op het ijs.
- U wilt opsporen GFP-positieve CRC organoid cellen, observeren de ontleed weefsels onder een stereo-fluorescentie Microscoop. Verwerven van beelden met een CCD-camera en voor te bereiden met behulp van standaard beeldverwerking software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een primair colorectaal adenocarcinoom gediagnosticeerd als matig gedifferentieerd had operatief zijn gereseceerd van een 76-jarige vrouw met TNM classificatie, fase IIIa, gevolgd door postoperatieve chemotherapie. De primaire CRC cellen immunohistochemisch gekleurd positief voor carcino-antigeen, Ki-67, pan-cytokeratin en E-cadherine. Stukken van de resected tumor waren ook subcutaan ingeplant NOG muizen voor het genereren van de dikke darm PDX-model. CRC organoid cellen werden vervolgens gewonnen voor weefselkweek van de dikke darm PDX die subcutaan had ontwikkeld in deze muizen. De CRC organoids aankonden consequent meercellige clusters te vormen tijdens een aantal passages over kunstmatige extracellulaire matrix. Als de tumor organoids histologisch en genetisch het karakter van primaire tumoren van patiënten5,6 weerspiegelen, hebben we geprobeerd te ontwikkelen een muismodel waardoor in vivo detectie van CRC organoid cellen met hoge gevoeligheid tijdens metastatische verspreiding. Om dit te bereiken, waren CRC organoids besmet met GFP lentivirus, daardoor resulterend in bijna alle organoids tonen zeer heldere GFP (figuur 2A). Deze organoids waren dan geïnjecteerd orthotopically en intrasplenically in secundaire NOG muizen voorafgaand aan opsporing van GFP-positieve cellen in verre organen onder een fluorescentie Microscoop. We waargenomen de vorming van GFP-positieve primaire tumoren op de site van de orthotopic in alle vier muizen onderzocht (figuur 2B, links). Bovendien bleken de microscopische uitzaaiingen in de longen van drie van de vier muizen onderzocht op 2,5 maanden na orthotopic injecties (figuur 2B, midden). Bovendien is lever metastasen werden waargenomen in reactie op intrasplenic injectie in alle vier muizen onderzocht op 1 maand na de injecties (figuur 2B, rechts).
Samen genomen, deze bevindingen wijzen erop dat met een hoge resolutie GFP fluorescentie op PDX-afgeleide CRC organoid cellen maakt de hun ontdekking in zowel spontane micrometastasen alsmede experimenteel, ontwikkeld in verre organen, wanneer de ontvanger binnengebracht muizen. Deze hoge gevoeligheid detectie van de verspreiden PDX-afgeleide CRC organoids in vivo biedt ook een veelzijdig model niet alleen voor de studie van de biologie van uitzaaiing van de tumor, maar ook voor het ontwikkelen van gerichte therapieën in de preklinische instelling.
Figuur 1: schematische weergave van de generatie van metastasen door de CRC PDX-afgeleide organoids aangeduid met GFP lentivirus in NOG muizen. (A) het implanteren van kleine stukjes van het CRC weefsel subcutaan in NOG muizen (stap 1). Het CRC weefsel chirurgisch ontleed uit de patiënt werd in stukjes gesneden en subcutaan ingeplant NOG muizen. s.c.: onderhuidse implantatie. (B) generatie van CRC organoids losgekoppeld van PDXs (stap 2 – 4). De ontwikkelde CRC xenografts waren gehakt (stap 2) en overgebracht in een tube van 15 mL met het kweekmedium met inbegrip van collagenase (stap 3). Na incubatie met langzame agitatie was de CRC celsuspensie gefilterde (stap 3). Vervolgens werd de celsuspensie van de organoid in het CRC organoid medium zaadjes op een kunstmatige extracellulaire matrix beklede plaat en 's nachts geïncubeerd in een CO2 incubator (stap 4). De CRC organoid cellen gekoppeld aan de kunstmatige extracellulaire matrix waren ook bekleed met extra kunstmatige extracellulaire matrix en geïncubeerd in een CO2 incubator (stap 4). s.c.: onderhuidse implantatie. (C) generatie van CRC organoids getransduceerde door de lentivirale deeltjes GFP vóór injectie in ontvangende muizen (stap 5 – 7) in dienst. De lentivirale deeltjes van GFP werden gegenereerd op een hoge titer (stap 5). De CRC PDX-afgeleide organoids geteeld op kunstmatige extracellulaire matrix waren direct geoogst met een cel schraper en overgebracht in een microtube (stap 6). Na het centrifugeren was de cel pellet in PBS opnieuw geschorst. De celsuspensie was gecentrifugeerd en de cel pellet werd losgekoppeld. Vervolgens werd de CRC organoid celsuspensie geïncubeerd met GFP virus voorraad in het CRC organoid kweekmedium op de kunstmatige extracellulaire matrix beklede plaat overnachting in een CO2 incubator (stap 6). De CRC organoid cellen gekoppeld aan de kunstmatige extracellulaire matrix waren bedekt met extra kunstmatige extracellulaire matrix en geïncubeerd in een CO2 incubator te stollen de kunstmatige extracellulaire matrix coating (stap 6). De CRC organoids werden vervolgens gekweekt voor periodes van 7-10 dagen uit te breiden van de celgroei (stap 6). Ontwikkeling van een model van spontane metastase, waren de gedissocieerde 5 x 105 CRC organoid cellen voorzien van GFP geschorst in 50 µL van PBS met 50% kunstmatige extracellulaire matrix orthotopically geïnjecteerd in NOG muizen (stap 7). Voor het genereren van een experimentele metastase-model, waren 4 x 104 CRC organoid cellen voorzien van GFP in 50 µL van PBS geïnjecteerd intrasplenically in NOG muizen (stap 7). o.t.: orthotopic injectie, i.s.: intrasplenic injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: met hoge resolutie van GFP visualisatie gedetecteerd gekweekte GFP-geëtiketteerden CRC organoids, primaire tumoren en micrometastasen. (A) bijna 100% van de gekweekte CRC organoids GFP positief zijn. De beelden werden gemaakt met behulp van een stereo-fluorescentie Microscoop. Schaal bar = 250 µm. (B) GFP-positiviteit in de primaire tumor en micrometastasen in de longen en de lever. De gedissocieerde GFP-uiten CRC organoid celsuspensie werd geïnjecteerd in de rectale submucosa (o.t. inj.) van NOG muizen. De meerderheid van de tumorcellen worden weergegeven als positief voor GFP in de primaire tumor. GFP-positieve micrometastasen koloniseren de longen (aangegeven met een pijl), worden ook weergegeven. Bovendien GFP-positieve micrometastasen worden gedetecteerd in de lever (aangegeven met een pijl), wanneer de celsuspensie (i.s. inj.) intrasplenically werd geïnjecteerd in muizen. Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de CRC PDX-model heeft wijd uitgeoefend te bestuderen van de groei van de primaire tumor, of dit model is ook van toepassing op het onderzoek naar uitzaaiing van de tumor is niet nog is volledig opgehelderd. Spontane uitzaaiingen waren ook nauwelijks waarneembaar in de lever en longen van verschillende gerapporteerde dubbelpunt PDX modellen4,10. U wilt opsporen micrometastasen met hoge gevoeligheid, ontwikkelden we een protocol voor transducing van GFP lentivirale deeltjes in PDX-afgeleide CRC organoids voorafgaand aan hun orthotopic en intraveneuze injecties in ontvangende muizen. Van de nota konden we om te laten zien dat deze methode kan zeer gevoelige detectie van CRC organoid afkomstige micrometastasen, vorming van zowel spontaan en experimenteel, in verre organen.
Kritische stappen binnen het protocol bevatten handhaven intact sferoïde vorming zonder inductie van anoikis op de kunstmatige extracellulaire matrix door zachtjes de CRC organoids pipetteren tijdens de passaging serie. De voorbereiding van hoge titer lentivirus deeltjes geconcentreerd door ultracentrifugatie is ook belangrijk voor het bereiken van de bijna 100% GFP positiviteit van CRC organoids. Bovendien, is het aanbevolen dat het GFP-geëtiketteerden CRC organoids in ontvangende muizen binnen 10-14 dagen worden ingespoten. Buitensporig lange perioden voor uitbreiding van de CRC organoids na infectie kunnen selectie van zwak GFP-uiten organoids gunst.
De injectie van CRC organoids in de rectale submucosa van NOG muizen toonde hun metastatische verspreiding in de longen, hoewel niet in de lever, vermoedelijk door de vena cava inferior. Voor het genereren van lever metastasen spontaan, zou de injectie van CRC organoids in de dikke darm met laparotomie vereist13.
Merk op dat de incidentie van B-cel lymfomen bij gelegenheid is toename van immunodeficiëntie muizen NOG geïmplanteerd met weefsel, met inbegrip van lymfocyten, besmet met Epstein-Barr-oncovirus, van menselijke patiënten14. Daarom is het redelijk om aan te bevelen dat of de opkomende tumoren zijn afkomstig uit de geïmplanteerde menselijke CRC worden bepaald door het uitvoeren van immunohistochemistry met behulp van menselijke CRC cel markers, zoals carcino antigeen en cytokeratin 20.
We onderzochten de CRC organoids afgeleid van slechts één patiënt, zou meer monsters van grotere aantallen patiënten moeten worden onderzocht om te generaliseren van onze bevindingen in de toekomst. Als de geïmplanteerde PDX-afgeleide CRC organoids Toon minimale groei op de orthotopic site en zelden formulier metastasen op verre locaties, onderzoekers worden aangemoedigd om te overwegen uitpakken CRC organoids uit verschillende patiënt-afgeleide PDXs.
De zeer gevoelige detectie van GFP-label micrometastasis met deze methode bereikt moedigt ons niet alleen om andere te onderzoeken verschillende biologische problemen met betrekking tot de overgang van micrometastasis naar macrometastasis, vorming van de stromale niche voor gemetastaseerde kolonisatie en de verwerving van medicamenteuze resistentie, maar ook om te evalueren van de efficacies van nieuwe anti-kanker medicijnen door gebruik te maken van PDX-dragende dieren als preklinische modellen.
GFP gebaseerde FACS-sortering van levende CRC organoids geëxtraheerd uit primaire en verre sites heeft ook het potentieel om één cel-gebaseerde onderzoeken van de gen-expressies, evenals de epigenetische en metabolomic profielen, van een tumor. Dergelijke bevindingen kunnen ook leiden tot opheldering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan metastatische verspreiding van de CRC organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen potentiële conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Juntendo Universiteit Young Investigator Award (2013, 2014 en 2015) Y.O., het gezamenlijke Project Award (2013 en 2014) naar K. M., en verleent in-steun voor wetenschappelijkonderzoek van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en Technologie-, Japan (16K 15625 aan Y. K. en 16K 15598 aan M.G.). Wij zijn vooral dankbaar voor alle leden van de fac. van de chirurgie van de Coloproctological en moleculaire pathologie voor nuttige discussies en technische ondersteuning. Wij danken ook Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu Universiteit Schoolof geneeskunde) en Dr Hideki Kitajima (Internationale Universiteit van gezondheid en welzijn) voor gulle technische begeleiding in de chirurgische procedures voor orthotopic implantatie in muizen en Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) voor technisch advies over het uitvoeren van de tumor organoid cultuur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
