Summary
Чтобы разрешить высокочувствительный обнаружения распространения человека колоректального рака (CRC) клетки колонизацию тканей, мы здесь показать протокол для эффективного трансдукции зеленого флуоресцентного белка (ГФП) лентивирусные частиц в PDX-производные CRC органоид клетки перед их введением в получателей мышей, с стерео флуоресценции микроскопические наблюдения.
Abstract
Несмотря на текущие достижения в лечении человека колоректального рака (CRC) несколько радикального лечения эффективны для поздних стадиях CRC. Для преодоления этой клинической проблемой, опухоли ксенотрансплантата мыши модели с помощью давно человека рак клеточных линий и многие трансгенные мыши, которые были разработаны модели с опухолями как доклинических моделей. Они частично имитировать функции человека карциномы, но часто не удается повторить ключевые аспекты человеческого злокачественных опухолей, включая вторжения и метастаз. Таким образом альтернативные модели, которые лучше представляют злокачественные прогрессии в человека CRC давно ждали.
Здесь мы покажем поколения опухоли пациента производные ксенотрасплантатов (PDXs) путем подкожной имплантации небольших фрагментов CRC, хирургически расчлененный от пациента. Толстой PDXs развивать и histopathologically напоминают CRC в пациента. Однако несколько спонтанных микрометастазы обнаруживаются в обычных сечения пострадавших отдаленные органы в PDX модели. Для облегчения обнаружения метастазов распространения в отдаленные органы, мы извлекали органоид клетки опухоли из PDXs толстой кишки в культуре и инфицированных GFP человека до инъекции в высоко иммунодефицитных NOD/Ши ТКИД IL2Rγзначение null (Нагель) мышах. Orthotopically вводят PDX-производные CRC органоид клетки последовательно положительные формы первичной опухоли для GFP получателей мышей. Кроме того спонтанно развивающихся micrometastatic, которые особенно колоний, выражая GFP обнаруживаются в легких этих мышей микроскопии флуоресцирования. Кроме того intrasplenic инъекции CRC organoids часто производит печеночная колонизации. Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о GFP-помечены PDX-производные CRC органоид клетки, чтобы быть визуально обнаружить во время многоэтапный процесс называют Каскад вторжения метастазы. Описанные протоколы включают в себя создание PDXs человека CRC и 3D культуры соответствующего CRC органоид клетки преобразованы GFP лентивирусные частицами.
Introduction
Колоректальный рак (КПР) является второй ведущей причиной рака смертей во всем мире1. Недостаточный отклик к обычной терапии пациентов с продвинутой стадии болезни показывает неэффективность попытки радикально вылечить ОЦР. Разработать более эффективные терапевтические подходы, были созданы различные модели доклинических мыши рака, которые имитируют характеристики ОЦР. Различные линии клетки CRC широко используются для создания ксенотрасплантатов опухоль из-за их удобство и простота манипуляции. Однако, долгосрочные культуры рак клеточных линий, часто вызывает выбор уникальных клеточных популяций, которые довольно пролиферативной при условии конкретной культуры, что приводит ненадежные результаты и решающее значение ограничения в доклинических наркотиков развития.
Не будучи культивировали в пробирке, пациент производные опухоли ксенотрасплантатов (PDXs) также генерируются имплантации в животных моделях тканях человека CRC, хирургически расчлененный от больных2,3,4. PDXs широко признаются как изложив основные Гистопатологические особенности и генетические изменения первоначально в опухоли пациентов, из которых они были получены. Кроме того пациент производные опухоли organoids состоит из опухолевых клеток, кластеры были созданы культуры условиях 3D, которые тесно имитировать биологических свойств оригинальной опухоли5,6. Эти опухоли organoids также применялись к высок объём наркотиков скрининг, тем самым позволяя персонализированной терапии разработаны5. Однако, заметно гетерогенных CRC населения предполагается присутствовать в опухоль массы. Особое CRC население может выборочно размножаться и расширить в ходе в vivo и in vitro серии проходы PDX и опухоли organoids, соответственно. Это также может позволить общие профили выражение гена и РПИ/генетический статус пострадавших ОЦР для изменения, результате чего минимальное сходство с родительского КПР.
Пациент производные CRC organoids и те, извлеченные из доброкачественные человека Колон, спроектированы для гавани, что комбинации онкогенных мутаций также были использованы для изучения отличительными чертами человека опухолевых клеток, подтверждается прорастание опухоли и метастазов 6,,78,9. Однако очень низкий уровень заболеваемости спонтанное метастазов, вытекающие из ортотопическая имплантации пациент производные КПР в иммунодефицитных мышей, затрудняет изучение многоэтапный процесс вторжения метастаз Каскад, который включает местные вторжение, intravasation, транспорт в кровоток, кровоподтек и колонизации отдаленные органы4,10. Micrometastasis как представлены опухолевых клеток осаждения ≤2 мм, образованный пациента производные organoids CRC, часто игнорировались гистопатологические анализа разделов от пострадавших в отдаленные органы в экспериментальной мыши модели. Визуализация спонтанное микрометастазы был также минимальным в естественных условиях из-за сложности эффективного введения флуоресцентных маркеров в органоид клетки опухоли до их введения в получателей мышей. В этом исследовании, мы разработали протокол эффективно передают GFP человека в PDX-производные CRC органоид клетки в 3D культуре до инъекции в получателей мышей и позволить высокочувствительный обнаружения, используя стерео флуоресцентной микроскопии, из их Колонизация различных органов в форме микрометастазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Пациент условии письменного информированного согласия, и проект был одобрен Комитет по этике исследований факультета Juntendo университета. Мышь эксперименты были также одобрены животное Комитет по этике исследований факультета медицины Juntendo.
1. Создание CRC PDXs иммунодефицитных мышей
Экспериментальные методы для создания CRC PDXs (шаг 1) изложены на рисунке 1A.
- Подготовьте основной ткани CRC сразу после хирургической резекции опухоли пациента.
- Мыть основной ткани CRC, нежный агитации несколько раз в 30 мл ледяной стерильные фосфата буфер солевой раствор (PBS) в 50 мл Конические трубки и держать его на льду.
- Место ткани на чашку Петри 10 см, с использованием стерильных пинцетов, удаления некротических областей так широко, как можно использовать стерильные ножницы и вырезать твердые опухоли тканей на мелкие кусочки (5 x 5 x 5 мм3 в размер) используя стерильные лезвия бритвы.
Примечание: Некротическая районы часто белее, мягче и более рыхлая, чем в окружающих районах. - Место мелкие кусочки опухоли с помощью стерильных пинцетов в 2 мл ледяной стерильные PBS на пластине 6-хорошо.
- Порода 6 week-old IL2Rγ КИВНУЛ/Ши ТКИД null (Нагель) высоко иммунодефицитных мышей бесплатно условиях зародышей–свободные и конкретного возбудителя–.
- Анестезировать мышей с изофлюрановая ингаляции с использованием малых животных ингаляционной анестезии устройства и дезинфекции кожи с 70% этиловом спирте. Заверить нормальной скорости и глубины дыхания и отсутствие мыс щепотку рефлекс для надлежащего анестезии. Ветеринар мазь на глазах является вариант, чтобы предотвратить глазные сухости под наркозом.
- Простерилизуйте все хирургические инструменты, с помощью стерилизации сухим теплом и затем использовать эти инструменты для выполнения всех процедур для предотвращения раневые инфекции в получателей мышей.
- Место наркотизированных мышь в положении лежа на скамейке лаборатории. Сделайте небольшой надрез на нижней части правого и левого бока получателей мыши для создания подкожной карманы для имплантации ткани стерильными ножницами. Заботиться не протыкайте перитонеальной мембраной. Там должно быть немного кровотечение с этой процедурой.
- Аккуратно опустите выше подготовленные фрагменты опухоли в 50 мкл искусственных внеклеточного матрикса и имплантировать их в нижней части правой и левой подкожной карманов.
- Шов надрез с раной клипы в мышей, хирургических процедур. Убедитесь, что имплантированных опухолевых тканей расположены на некотором расстоянии от разрез под кожу.
Примечание: В соответствии с минимизации хирургических процедур, не для лечения послеоперационных болей и инфекции осуществлялось в этом исследовании. - Поместите курсор мыши на теплые площадку и поддерживать грудинного лежа позиции до тех пор, пока достаточно сознание восстанавливается. После того, как полностью восстановленные и способны сидеть на всех четырех лапах, мышей могут быть возвращены в их дома клетки. Чтобы предотвратить насекомых, не позволяют разведения с неоперированных животных в той же клетке.
- Проверка на герметичность швов и подтвердите, что мыши находятся в стабильном состоянии на следующий день, в группе хирургического лечение. Проверьте мышь для признаков болезни и измерить размер опухоли в каждой мыши, раз в неделю, используя суппортов.
2. рассечение CRC PDXs от мышей
Экспериментальные методы для рассечения CRC PDXs (шаг 2) изложены в рисунке 1B.
- Разрешить опухоли расти подкожно3 ~ 1 см в размер, который обычно занимает около 1-3 месяца.
- Анестезировать мышь с изофлюрановая ингаляции с использованием малых животных ингаляционной анестезии устройства и дезинфекции кожи с 70% этиловом спирте.
- Поместите курсор мыши в положении лежа на скамейке лаборатории. Надрезать кожу, разоблачить опухоли и аккуратно отсоединить кожу от опухоли с помощью стерильными ножницами. После удаления опухоли, поместите его на 10 см Петри и удалите любые грубо некротические регионы от опухоли, затем ополосните дважды с 5 мл ФСБ.
Примечание: Некротическая районы часто белее, мягче и более рыхлая, чем в окружающих районах. -
Место опухоли на льду и разделить его одинаково на по крайней мере 4 части для различных приложений, включая 1 CRC органоид культуры, 2) трансплантации в вторичной мышей, 3) гистологическом и 4) замораживания и хранения фрагментов опухоли.
- Для генерации CRC organoids место твердых опухолевой ткани на чашку Петри 6 см, содержащие 1 мл стерильного PBS. Держите ткани на льду до обработки (шаг 3).
- Создать модель PDX для человека CRC, проход свежие PDXs CRC в вторичной мышь. Вырезать опухолевой ткани на мелкие кусочки (5 x 5 x 5 мм3 в размер) используя стерильные лезвия и мягко погрузите эти фрагменты тканей в 50 мкл искусственных внеклеточного матрикса. Затем имплантировать эти фрагменты в нижней части правой и левой подкожной карманов NOG мыши, как описано в шаге 1.8 – 1.11.
- Для гистологического анализа исправить образцы в 5 мл нейтрального буферизации формалина 10% в 15 мл Конические трубки при комнатной температуре в течение 2 дней.
- Для криоконсервирования опухолевой ткани мелко нарезать (5 x 5 x 5 мм3 в размер) и мягко погрузите образцы в 500 мкл замораживания раствора в 1-1,5 мл пробирок cryovial клеток. Затем перенесите трубки в морозильной камере-80 ° C.
3. Извлечение PDXs в суспензии клеток для CRC органоид культуры
Экспериментальные методы для диссоциации CRC PDXs (шаг 3) изложены в рисунке 1B.
- Место выше опухоли (шаг 2.4.1) подготовленные фрагменты на 10 см Петри.
- Фарш фрагменты, используя стерильные лезвия и передачи их в 15 мл конические трубка, содержащая 8 мл 10% плода телячьей сыворотки (FCS)-средний Дульбекко изменение орла (DMEM) с 80 мкл акций фермент коллагеназа (см. Таблицу материалы).
- Плотно закройте трубку и заверните крышку с парафина для предотвращения утечки. Чтобы отделить фарш опухоли фрагменты в суспензии клеток, агитировать его мягко в течение 2 ч при 37 ° C. Обратите внимание, что по-прежнему будет много фрагментов непереваренных ткани, оставаясь в трубе.
- Центрифуга для трубки на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Разрешить Пелле ячейки, используя 10 мл 10% FCS-DMEM сделать суспензию клеток.
- Для устранения мусора непереваренных ткани, фильтрации суспензии клеток, дважды с помощью стрейнер клеток 40 мкм на 50 мл Конические трубки. Затем центрифуги потока через на 300 x g 5 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и держать гранул на льду.
4. поколение Organoids CRC, культивируемых на искусственных внеклеточная матрица
Экспериментальные методы для CRC органоид культуры PDXs толстой кишки (шаг 4) изложены в рисунке 1B.
- Создание питательной среды, подходит для PDX-производные CRC organoids (см. Таблицу материалы, «CRC органоид питательной среды») используя СМИ, описанных ранее для человека Колон organoids11.
- Применить 150 мкл искусственных внеклеточного матрикса (см. Таблицу материалы) на также на 12-ну тарелку на льду и затем Инкубируйте 30-60 минут при 37 ° C, 5% CO2 инкубатора для закрепления гели.
- Приостановите клетки гранулы из шага 3.5 с CRC органоид питательной среды (от шага 4.1) с 5% FCS для обеспечения перестройки 3 x 105 клеток/мл. Затем семена 1 мл среды на искусственных внеклеточная матрица покрытием пластину подготовлен на шаге 4.2. и инкубировать на ночь при 37 ° C под 5% CO2. Используйте для подсчета количества опухолевых клеток, включая отдельные ячейки и многоклеточных кластеры (группы адэрентных клеток) в суспензию клеток Горяева.
Примечание: 5% FCS используется для утоления остаточного Ферментативная активность коллагеназы в этом исследовании. - Тщательно собирать питательной среды, включая плавучий клетки, которые отсоединены от искусственных внеклеточная матрица покрытием плиты, в 1,5 мл центрифуга трубки на следующий день и центрифуги на 1400 x g за 5 мин. Затем удалить супернатант и вновь приостановить гранулы в 70 мкл искусственных внеклеточной матрицы на льду.
- Чтобы повысить жизнеспособность клеток CRC, наложение опухолевых клеток содержащих искусственные внеклеточного матрикса на опухоль органоид клетки придают искусственной внеклеточная матрица покрытием пластину и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C, 5% CO2 инкубатора для закрепления Покрытие искусственным внеклеточного матрикса. Затем, проинкубируйте его с 1 мл раствора CRC органоид клетки питательной среды с 1% FCS при 37 ° C в под 5% CO2.
- Изменение культуры среднего каждый второй день. Как CRC organoids заполнить среды, может возникнуть необходимость изменить носитель ежедневно.
5. поколение и обогащения GFP лентивирусные частиц
Экспериментальные методы для генерации и обогащения GFP лентивирусные частиц (шаг 5) изложены в Рисунок 1 c.
- Культура клетки HEK293T с Roswell парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 средних содержащий 10% FCS и готовят блюда шести 10 см (2 x 106 клеток за блюдо) для выполнения следующей процедуры transfection.
- Трансфекция за блюдо Подготовьте 500 мкл смеси, включая 20 мкл Реагента трансфекции в среде DMEM с PRRL-GFP вектор (5 мкг)12 и два лентивирусные упаковки плазмид, например pCMV-VSV-G (1 мкг) и pCMV-dR8.2 dvpr (5 мкг), в стерильной 1,5 мл Микропробирка. Держать смесь при комнатной температуре в течение 20 мин, наложить на каждую из блюд 10см и проинкубируйте 18 h.
- Удалите носитель, добавить 5 мл свежего 10% FCS-RPMI 1640 среды в каждое блюдо и оставить стоя за 24 ч.
- Собирать с кондиционерами среднего от каждого блюдо в 50 мл пластиковых пробирок и хранить в общей сложности 30 мл среды при температуре 4 ° C на ночь. Добавьте 5 мл свежего RPMI 1640 на каждое блюдо и оставить стоя за 24 ч.
- Соберите с кондиционерами среднего от каждого блюдо в 50 мл пластиковых пробирок и держать, в целом, 30 мл среды на льду. Затем отбросить клетки.
- Фильтр 60 мл средства (от шага 5.4-5.5) через 0.45 мкм фильтр для удаления клеток и разделить это количество на двенадцать 5 мл полипропиленовые пробирок для ultracentrifugation.
- Концентрацию вируса, их с помощью поворотной ведро ротора центрифуги (см. Таблицу материалы) на 85,327 x g для 1,5 ч при 4 ° C.
- Немедленно удалите среды. Для устранения концентрированной вирус Пелле, место 250 мкл Ham питательной смеси F-12 (F12) / среде DMEM без FCS в каждой из двенадцати трубки и поддерживать его на 4 ° C на ночь. Обратите внимание, что вирус Пелле часто является невидимым.
- Аккуратно Пипетка средство для сбора 3 мл концентрированной 5 x GFP Лентивирусы акций, в общей сложности, предположительно включая GFP лентивирусные частиц с 108 преобразования единиц / мл (TU/мл). Затем Храните двенадцать 1.5 мл пробирок (в том числе 250 мкл в трубку) в стерильных условиях при температуре-80 ° C для до одного года. Подготовка многих небольших аликвоты оригинальные решения, чтобы избежать нескольких циклов оттаивания замораживание–.
6. Маркировка CRC органоид клетки с GFP лентивирусные частицами, культивируемых на искусственных внеклеточная матрица
Экспериментальные методы для маркировки CRC органоид клетки с GFP человека (шаг 6) изложены в Рисунок 1 c.
- Разрешить organoids CRC, подготовленную на этапе 4.6 расти без вмешательства для 7-10 дней и убирать механическим скребком стерильные ячейки и затем передать их в 1,5 мл микропробирок.
Примечание: Рост organoids CRC в культуре зависит от характера первоначально опухоли у пациентов. Избегайте разрастание CRC organoids, поддерживая их при впадении в 60 – 70% до передачи в соотношении 1:2 Сплит на новых искусственных внеклеточная матрица покрытием 12-ну пластину. - Центрифуга Микропробирка 3 мин на 1400 x g, удалите питательной среды и разрешить Пелле клеток в 500 мкл PBS нежным нажатием.
- Центрифуга Микропробирка 3 мин на 1400 x g и ликвидации PBS.
- Чтобы отделить адэрентных organoids CRC, 500 мкл раствора клетки отряд протеолитических и collagenolytic ферментов в ячейку пеллет в пробке и смешайте его нежным нажатием. Затем оставьте трубы поселиться за 10 мин при комнатной температуре.
- Очень аккуратно Пипетка суспензию клеток с дополнительных 500 мкл 1% FCS-DMEM несколько раз в 1,5 мл микропробирок примерно не присоединяться клетки. Поколение единичных клеток от CRC organoids от суровых закупорить заметно сокращает жизнеспособность клеток. Таким образом важно оставить массы клеток визуально обнаружить в суспензии клеток, очень мягко дозирование в 1,5 мл микропробирок.
- Центрифуга суспензию клеток на 3 мин на 1400 x g и удалить супернатант.
- Разрешить Пелле клеток со смесью 100 мкл 5 x GFP Лентивирусы акций (> 108 ту/мл) и 400 мкл CRC органоид питательной среды в 1,5 мл микропробирок, нежный нажав приспособиться к концентрации 5 x 105 отделить опухолевых клеток в 500 мкл . Используйте Горяева для подсчета количества опухолевых клеток, включая отдельные ячейки и группы клеток в суспензии клеток, как описано выше (шаг 4.3).
- Подготовка искусственных внеклеточная матрица покрытием 12-ну пластины, как описано в шаге 4.2. Затем, место 500 мкл суспензии клеток, подготовленный на шаге 6,7 на плите и оставить его на 18 ч при 37 ° C под 5% CO2.
- Соберите носитель с плавающей клетки, отделен от искусственных внеклеточная матрица покрытием пластину в 1,5 мл трубку центрифугирования. Центрифуги на 1400 x g и затем удалить супернатант и вновь приостановить гранулы в 70 мкл искусственных внеклеточной матрицы на льду.
- Чтобы повысить жизнеспособность клеток CRC, наложение опухолевых клеток содержащих искусственные внеклеточного матрикса на опухоль organoids придает искусственного внеклеточная матрица покрытием 12-ну пластину, как описано в шаге 4.5. Далее, инкубировать пластину на 30 минут при 37 ° C, 5% CO2 инкубатора затвердеть покрытие искусственных внеклеточного матрикса и затем культуры его с 1 мл раствора CRC органоид питательной среды с 1% FCS при 37 ° C в менее 5% CO2.
- Наблюдать за клетки на 3 дней после инфицирования под микроскопом флуоресценции для подтверждения почти 100% GFP позитивность благодаря использованию высокого титра лентивирусные частиц (см. рис. 2а).
- Культура CRC organoids для периодов 7 – 10 дней, чтобы расширить рост клеток до инъекции в получателей мышей.
7. поколение метастазов, GFP-меченых CRC Organoids получателей мышей
Экспериментальные методы для генерации метастазов, с использованием GFP-помечены CRC organoids (шаг 7) изложены в Рисунок 1 c.
- Чтобы отделить organoids GFP-меченых CRC в суспензии клеток, убирать механическим скребком стерильные клеток и перенести их в 1,5 мл микропробирок, как описано выше (шаг 6.1).
- Центрифуга Микропробирка 3 мин на 1400 x g, удалить питательной среды и разрешить Пелле клеток в 500 мкл PBS нежным нажатием.
- Центрифуга Микропробирка 3 мин на 1400 x g и ликвидации PBS.
- Наложение 500 мкл клетки отряд раствор на клетки гранул в трубе и смешайте его нежным нажатием. Затем оставьте смесь стоя за 10 мин при комнатной температуре для ферментативно отмежеваться адэрентных organoids CRC, как описано выше (шаг 6.4).
- Очень аккуратно Пипетка суспензию клеток с дополнительных 500 мкл 1% FCS-DMEM несколько раз в 1,5 мл микропробирок примерно не присоединяться клетки, как описано выше (шаг 6.5). Поколение единичных клеток от CRC organoids от суровых закупорить заметно сокращает жизнеспособность клеток. Таким образом оставьте массы клеток визуально обнаружить в суспензии клеток, очень мягко дозирование в 1,5 мл микропробирок.
- Центрифуга суспензию клеток на 3 мин на 1400 x g и удалить супернатант.
-
Создать модель мыши спонтанное метастазов CRC PDXs:
- Готовят суспензию клеток, включая клетки 5 x 105 в 50 мкл PBS с 50% искусственных внеклеточная матрица мыши. Поддерживать подвеска на льду перед использованием. Для подсчета раковые клетки, как указано в шаге 4.3 Используйте Горяева.
- Анестезировать мышь с изофлюрановая ингаляции с использованием малых животных ингаляционной анестезии устройства и дезинфекции кожи с 70% этанола, как указано в шаге 1.6.
- Поместите курсор мыши нагель в лежачем положении на лабораторном столе. Возьмите слизистую оболочку прямой кишки с стерильным пинцетом и осторожно вытащите его из ануса. Затем, сразу же инъекционные суспензии клеток, подготовленную на этапе 7.7.1 в ректальных подслизистой мыши, с помощью шприца (игла размер: 22 G). Регулярно 4 – 6 мышей каждой группы используются для оценки результатов.
-
Создать модель экспериментального метастазов CRC PDXs:
- Готовят суспензию клеток органоид КПР, включая 4 х 104 клетки в 50 мкл PBS на мышь. Поддерживать подвеска на льду перед использованием. Используйте Горяева для подсчета раковые клетки (шаг 4.3).
- Анестезировать мышь с изофлюрановая ингаляции с использованием малых животных ингаляционной анестезии устройства и дезинфекции кожи с 70% этанола, как указано в шаге 1.6.
- Место наркотизированных NOG мышь в положении лежа на скамейке лаборатории. Сделать небольшой надрез в нижней части левого фланга, а затем вырезать брюшины подвергать тщательно селезенки, используя стерильные ножницы и щипчики. Понять жировой ткани, прилагается к селезенке стерильным пинцетом, а затем медленно вдохнуть 50 мкл суспензии клеток (подготовлен. как указано выше, шаг 8.1) в селезенке. Будьте уверены, что суспензию клеток надлежащим образом вводится без утечки наружу, от хандры. Обычно 4 мышей каждой группы используются для оценки результатов.
- Поместите все мыши на площадку теплой после операции и поддерживать в грудной лежачем положении до тех пор, пока достаточно сознание восстанавливается, как описано в шаге 1.11. Как только мышей полностью выздоровели, вернуть их домой клетки. Чтобы предотвратить насекомых, не позволяют разведения с неоперированных животных в той же клетке.
- Проверка на герметичность швов и подтвердите, что мышей живы, в группе хирургического лечение, следующий день. Проверьте мышь для признаков болезни и мера размеров опухоли, используя суппортов, у всех мышей один раз в неделю.
- Соблюдайте мышей для обнаружения спонтанное метастазов (сроком до 2,5 месяцев) и экспериментальных метастазов (1 месяц) после инъекции.
- Пожертвуйте мышей через анестезии и шейки матки дислокации в указанные дни. Вскрыть первичной опухоли и различных тканей, включая печень и легкие. Расчлененный опухоли и органов в 5 мл ледяной PBS на 10 см Петри и хранить их на льду.
- Чтобы обнаружить GFP-позитивных CRC органоид клетки, наблюдать расчлененных тканей под микроскопом стерео флуоресценции. Получение изображений с камеры CCD и подготовить, с помощью стандартного программного обеспечения обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первичной кишки аденокарциномы, диагноз как умеренно дифференцированная хирургически резецируется от 76-летняя женщина с TNM классификации, этап IIIa, следуют послеоперационной химиотерапии. Основной immunohistochemically клетки CRC витражи позитивные раково-эмбрионального антигена, Ki-67, Пан Цитокератины и E-Кадгерины. Кусочки резекции опухоли были также подкожно имплантируется в NOG мышей для создания модели PDX Колон. CRC органоид клетки затем извлекали для культуры ткани от PDX толстой кишки, который разработал подкожно в этих мышей. CRC organoids были способны постоянно формирования многоклеточного кластеров во время серии проходы на искусственных внеклеточного матрикса. Как опухоль organoids гистологически и генетически отражают характер первичной опухоли от больных5,6, мы попытались разработать модель мыши, которая позволила бы в естественных условиях обнаружения CRC органоид клетки с высокой чувствительностью во время распространения метастазов. Для достижения этой цели, были инфицированы CRC organoids с GFP человека, в результате чего почти все organoids показаны очень яркие GFP (рисунок 2A). Эти organoids были затем вводят orthotopically и intrasplenically в вторичной NOG мышей до обнаружения GFP-положительных клеток в отдаленных органах под флуоресцентным микроскопом. Мы наблюдали образование GFP-позитивных первичной опухоли на сайте ортотопическая все четыре мышей изучены (Рисунок 2B, слева). Кроме того были найдены микроскопические метастазы в легких три из четырех мышей, рассмотрены на 2,5 месяца после ортотопическая инъекции (Рисунок 2Б, в середине). Кроме того в ответ на intrasplenic инъекций во всех четырех мышей, рассмотрены на 1 месяц после инъекции (Рисунок 2Б, право) наблюдались метастазов в печени.
Вместе взятые, эти результаты показывают, что высоким разрешением GFP флуоресцирования на PDX-производные CRC органоид клетки позволяет их обнаружения в спонтанной микрометастазы и разработанные экспериментально, в отдаленных органах, когда введена в получателя мыши. Это обнаружение высок чувствительности в распространении PDX-производные CRC organoids в естественных условиях также предлагает универсальные модели не только для изучения биологии метастазов опухоли, но и для разработки целевой терапии в доклинических условиях.
Рисунок 1: Схематическое представление поколения метастазов, organoids PDX-производные CRC, помечены GFP человека в NOG мышей. (A) имплантации небольших кусков ткани CRC подкожно в NOG мышей (шаг 1). CRC ткани, хирургически расчлененный от пациента было разрезать на куски и подкожно имплантируется в NOG мышей. с.к.: подкожной имплантации. (B) поколения CRC organoids отделен от PDXs (шаг 2 – 4). Развитые ксенотрасплантатов CRC были фарша (шаг 2) и переведены в 15 мл, содержащие питательной среды, включая коллагеназы (шаг 3). После инкубации с медленным агитации суспензию клеток CRC был отфильтрованных (шаг 3). Затем органоид суспензию клеток в среде органоид CRC был посеян на искусственных внеклеточная матрица покрытием пластину и инкубированы всю ночь в CO2 инкубатора (шаг 4). CRC органоид клетки придают искусственной внеклеточного матрикса были также покрыты дополнительные искусственные внеклеточного матрикса и инкубировали в CO2 инкубатора (шаг 4). с.к.: подкожной имплантации. (C) поколения CRC organoids преобразованы GFP лентивирусные частицами перед использованием инъекций в получателей мышей (шаг 5 – 7). GFP лентивирусные частицы были получены на высокий титр (шаг 5). Organoids PDX-производные CRC, выращенных на искусственных внеклеточного матрикса были непосредственно собирают с скребок клетки и переведены Микропробирка (шаг 6). После центрифугирования Пелле клеток было вновь приостановлено в PBS. Центрифугировали суспензию клеток и клеток Пелле была отделена. Затем CRC органоид клетки подвеска была инкубировали с GFP вирус акций в CRC органоид питательной среды на искусственных внеклеточная матрица покрытием пластины на ночь в CO2 инкубатора (шаг 6). CRC органоид клетки придают искусственной внеклеточного матрикса были покрыты дополнительные искусственные внеклеточного матрикса и инкубировали в инкубатор CO2 закрепить покрытие искусственных внеклеточного матрикса (шаг 6). CRC organoids были затем культивировали в течение 7 – 10 дней расширить рост клеток (шаг 6). Для разработки модели спонтанного метастазов, диссоциированных помечены GFP приостановлено в 50 мкл PBS с 50% искусственных внеклеточная матрица 5 x 105 CRC органоид клетки вводили orthotopically в NOG мышей (шаг 7). Создать модель экспериментального метастазов, 4 x 104 КПР органоид клетки помечены GFP в 50 мкл PBS вводили intrasplenically в NOG мышей (шаг 7). о.т: инъекций ортотопическая, и.с.: intrasplenic инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: визуализации высокого разрешения GFP, обнаруженные в культивированный organoids GFP-меченых КПР, первичной опухоли и микрометастазы. (A) почти 100% культивируемых CRC organoids являются GFP положительный. Изображения были получены с помощью стерео флуоресцентным микроскопом. Шкалы бар = 250 мкм. (B) GFP-ым в первичной опухоли и микрометастазы в легких и печени. Суспензию клеток органоид диссоциированных GFP-выражая CRC был введен в ректальных подслизистой (inj. о.т.) NOG мышей. Показано, что большинство клеток опухоли быть положительным для гена GFP в первичной опухоли. Также отображаются GFP-позитивных микрометастазы колонизировать легких (указано стрелкой). Кроме того, обнаруживаются микрометастазы GFP-положительным в печени (указано стрелкой), когда суспензию клеток intrasplenically вводили (inj. и.с.) мышах. Шкалы бар = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя модель CRC PDX широко применяются для изучения роста первичной опухоли, ли эта модель также применима к расследованию метастазов опухоли не еще не выяснен полностью. Спонтанное метастазы были также едва обнаружено в печени и легких различных сообщил Колон PDX модели4,10. Чтобы обнаружить микрометастазы с высокой чувствительностью, мы разработали протокол для преобразователя GFP лентивирусные частиц в PDX-производные CRC organoids до их ортотопическая и внутривенных инъекций в получателей мышей. Следует отметить мы смогли показать, что этот метод позволяет высокочувствительный обнаружения CRC органоид производные микрометастазы, образуя оба спонтанно и экспериментально, в отдаленных органах.
Важнейшие шаги в рамках Протокола включают поддержание нетронутыми сфероида формирования без индукции anoikis на искусственных внеклеточного матрикса, нежно закупорить CRC organoids во время passaging серии. Подготовка высокого титра антител человека частиц сосредоточены ultracentrifugation также имеет важное значение для достижения почти 100% GFP положительность CRC organoids. Кроме того рекомендуется, что GFP-меченых CRC organoids вводиться в течение 10-14 дней в получателей мышей. Чрезмерно длительных периодов для расширения CRC organoids после инфекции может пользу выбор слабо GFP-выражая organoids.
Инъекции CRC organoids в ректальных подслизистой NOG мышей показало их распространения метастазов в легкие, хотя и не в печени, предположительно через нижней полой вены. Для создания метастазов в печени спонтанно, инъекции CRC organoids в толстую кишку с лапаротомия бы необходимые13.
Обратите внимание, что B-клеточные лимфомы является по случаю рост в NOG иммунодефицитных мышей имплантируются с тканей, включая лимфоцитов, инфицированных Онковирус Эпштейн-Барр, от человека пациентов14. Поэтому целесообразно рекомендовать, что ли формирующейся опухоли возникают от имплантированных человека КПР определены выполняя иммуногистохимии с помощью человека CRC клеток маркеров, такие как раково-эмбрионального антигена и Цитокератины 20.
Как мы исследовали organoids CRC, производный от только одного пациента, больше образцов из большего количества пациентов необходимо изучить обобщить наши выводы в будущем. Если имплантированного PDX-производные CRC organoids показывают минимальный рост на сайте ортотопическая и редко форме метастаз в отдаленных местах, следователи предлагается рассмотреть вопрос извлечения CRC organoids из разных пациента производные PDXs.
Высокочувствительный обнаружения GFP-меченых micrometastasis, достигнутые с помощью этого метода призывает нас не только для дальнейшего расследования ряд нерешенных биологических вопросов, касающихся перехода от micrometastasis к macrometastasis, формирование стромальные ниша для метастатической колонизации и приобретение лекарственной устойчивости, но и оценить недостатки роман противораковых препаратов, используя PDX-подшипник животных как доклинических моделей.
GFP-сортировка на основе СУИМ-жизни organoids CRC, извлеченные из основного и удаленных сайтов также имеет потенциал, чтобы позволить одной ячейки на основе экзаменов выражения гена, а также эпигеномные и Метаболомные профили, опухоли. Такие выводы вполне может привести к прояснению молекулярных механизмов, лежащих в основе метастатического распространение CRC organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не потенциальные конфликты интересов раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана на Juntendo университета молодой следователь премии (2013, 2014 и 2015) лет, совместный проект премию (2013 и 2014) к. м. и предоставляет в помощь для научных исследований от министерства образования, культуры, спорта, науки и Технологии, Япония (16K 15625 до Y. K. и 16K 15598 для м.г.). Мы особенно благодарны всем членам Кафедра нашего хирургии и молекулярной патологии для полезных обсуждений и технической поддержки. Мы также благодарим Доктор Хироюки конно (Хамамацу университета Schoolof медицины) и доктор Хидеки Китадзима (Международный университет здравоохранения и социального обеспечения) за щедрые техническое руководство в хирургических процедур для имплантации ортотопическая в мышах и др. Бегемот (центр рака Тиба) Yoshitaka для технических консультаций по вопросам выполнения культуры органоид опухоли.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
