Summary
Здесь мы описываем протокол для выполнения Чистерна magna катетеризации (CMc), минимально инвазивная способ доставить трассировщиков, субстратов и сигнальных молекул в спинномозговой жидкости (СМЖ). В сочетании с различными визуализации формы, CMc позволяет glymphatic системы и оценки динамики спинномозговой жидкости, а также мозг всей доставки различных соединений.
Abstract
Чистерна magna катетеризации (CMc)-это простая процедура, которая обеспечивает прямой доступ к спинномозговой жидкости (CSF) без оперативного повреждения черепа или паренхимы мозга. В наркотизированных грызунов воздействия твердой мозговой оболочки, тупым диссекция шеи мышц позволяет вставлять канюли в Чистерна magna (см). Канюля, состоящий либо тонкой иглой скошенный или боросиликатное капилляров, прилагается через трубку в полиэтилен (PE) к шприцу. С помощью насоса шприца, молекулы могут затем быть введен контролируемой скоростью непосредственно в см, которая непрерывно с субарахноидальное пространство. Из субарахноидального пространства мы можем проследить потоки CSF конвективный поток в периваскулярной пространство вокруг проникающих артериол, где происходит обмен вещества с межклеточной жидкости (ISF). CMc может выполняться для острой инъекции сразу после операции, или хронический имплантации, с более поздних инъекции в наркотизированных или просыпаются, свободно перемещающихся грызунов. Количественный трассирующими распределения в паренхиме мозга может осуществляться эпифлуоресцентного, 2-Фотон микроскопии и магнитно-резонансная томография (МРТ), в зависимости от физико химических свойств вводят молекул. Таким образом CMc в сочетании с различными методами визуализации предлагает мощный инструмент для оценки системы glymphatic и динамики ФГО и функции. Кроме того CMc может использоваться в качестве канала для быстрого, мозг всей доставки сигнальной молекулы и метаболизма субстратов, которые иначе не могли пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).
Introduction
Спинномозговой жидкости (CSF) ванны центральной нервной системы (ЦНС) в желудочковой системе и вдоль субарахноидального пространства, анатомически определенного пространства в континууме с желудочков, который окружает мозг и спинной мозг. Одна из основных функций спинномозговой жидкости является предоставить маршрут для оформления метаболитов и растворенных веществ из паренхимы мозга. Распродажа облегчается через недавно обнаружили glymphatic системы1, аналоговый периферийных лимфатической системы мозга. Здесь мы описать и обсудить Чистерна magna катетеризации (CMc), минимально инвазивный метод для прямой доставки молекул в спинномозговой жидкости. CMc является основным методом для изучения функции glymphatic. Кроме того CMc может также применяться для изучения динамики Ликвора и быстрый, мозг всей доставки-крови мозга барьера (ГЭБ) проницаемых молекул в паренхимы мозга, вдоль периваскулярные пространства.
CMc подвиги физиологических принципов динамики движения спинномозговой жидкости через ЦНС доставить помечены трассирующими молекул или наркотиков в СМЖ заполнить пространство Чистерна magna (см). Молекулы вводят через канюлю, имплантируется в Атлантическо затылочной дурального мембранного покрытия, что молекулы см. затем перевозится ФГО объемного потока в паренхиме мозга через пространство paravascular1. Трассирующими или контраст агент, вводят через CMc следует движение CSF, которая позволяет оценивать движение Ликвора и glymphatic приток путем количественного определения уровней интенсивности помечены молекул, которые вводят паренхимы мозга. CMc совместим с различные методы обработки изображений, включая эпифлуоресцентного, 2-Фотон микроскопии и магнитно-резонансная томография (МРТ). Кроме того, эта оценка может быть выполнена как в естественных условиях или ex vivo. Главное CMc позволяет для визуализации системы glymphatic под наркозом или во время естественного сна, а также в awake, свободно движущихся животных.
CMc методика может использоваться для изучения различных аспектов динамики жидкости в спинномозговой жидкости, но оказалась особенно полезной для изучения системы glymphatic. Glymphatic активность диски конвективный поток спинномозговой жидкости из пространства periarterial каналам воды Аквапорин-4 (AQP-4), которые на привязи в мембране Астроцитарная сосудов упаковка endfeet. Конвективный поток позволяет обмена Ликвора и межклеточной жидкости (ISF) в пределах паренхимы мозга. CSF/ISF, содержащие метаболические отходы и растворенных веществ затем удаляется из паренхимы мозга через2,perivenous в пространстве3. В конечном счете CSF/ISF достигает периферии через недавно описан дурального лимфатические сосуды4,5. Системы glymphatic было показано, имеют решающее значение для обезвреживания вредных отходов метаболитов например амилоид β-2. Кроме того Распродажа glymphatic нарушается в старения6, после черепно-мозговой травмы7и в животных моделях диабета8 и9болезни Альцгеймера. В частности glymphatic деятельность является государством зависимых, значительно выше активности во время сна или анестезии по сравнению с бодрствования1. Действительно осознающие молодняка экспонат наибольшая активность glymphatic. Таким образом экспериментально количественная оценка деятельности glymphatic имеет решающее значение при изучении ее роль в здоровье и болезни.
Несколько исследований были рассмотрены ФГО динамики и ее обмена с межклеточной жидкости (ISF) в паренхиме мозга. Однако, методы, которыми помечены молекулы доставляются довольно инвазивными, вызывая повреждение паренхимы мозга и изменения в внутричерепного давления (ИКП) (см. Обзор10). Некоторые примеры внутрижелудочкового или intraparenchymal инъекции, которые включают краниотомии или бурение Берр отверстие в черепе. Было показано, что эти процедуры изменить ПМС, тем самым нарушая glymphatic функция2. Кроме того такие инвазивные методы вызывают astrogliosis и увеличить иммунореактивности AQP-4 в районе повреждения паренхимы мозга и его окрестности11,12. Как астроциты и AQP-4 являются ключевыми элементами системы glymphatic, CMc является методом выбора для своих исследований. Основные преимущества CMc по сравнению с более инвазивных процедур являются поддержание нетронутыми паренхимы черепа и головного мозга, избегая ICP изменения и astrogliosis, соответственно. Таким образом CMc в сочетании с различными инструментами обработки изображений открывает широкий спектр возможностей для изучения не только glymphatic системы, но и динамику и механизмы потока жидкости в гомеостаза, а также в животных моделях неврологических заболеваний.
Чистерна magna катетеризации (CMc) процедура позволяет легко и прямой доступ к спинномозговой жидкости (СМЖ). Путем инъекций различных молекул (например люминесцентные Индикаторы, МРТ контрастного вещества) экспериментатора может отслеживать их движение в одном купе ФГО и оценить деятельность системы glymphatic. Следующий протокол описывает как острый CMc, для инъекций сразу после операции и хронические имплантации канюля, в которой животное оправится от хирургической процедуры для более поздних инъекций. Наиболее важное различие между острой и хронической имплантации, что хронические Имплантация позволяет для изучения деятельности glymphatic проснулся мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были исполнены в соответствии с Европейской директивой 2010/63/ЕС для исследований на животных и были одобрены Советом экспериментов животных под датским министерством окружающей среды и продуктов питания (2015-15-0201-00535).
1. процедура для катетеризации
- Канюля подготовка
Примечание: Не прикасайтесь канюля с нестерильные перчатки.- Разорвать скошенный металлический наконечник 30G Стоматологические иглы с помощью иглодержателя.
- Использование иглодержателя, подготовить канюли, вставив скошенный металлический наконечник (примерно 0,3 см) в длину 30 см PE10 трубы (полиэтиленовые трубки 0,024" OD х 0.011" ID) заполнены с Фаго (126 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 1,25 мм2PO NaH4 , 2 мм MgSO4, 2 мм CaCl2, глюкоза 10 мм, 26 мм NaHCO3; рН 7,4 когда газом с 95% O2 и 5% CO2).
- Промойте катетер фаго с помощью 1 мл шприца с иглой 30G (30 G x ½" 0,3 x 12).
-
Хирургическая процедура
Примечание: Хронический катетеризации см позволяет животных, чтобы оправиться от хирургической процедуры. СМ инъекции производятся на следующий день после имплантации канюли и, главное, может быть выполнена в наркотизированных или просыпаются животные. Поскольку это операция восстановления, процедуры должны осуществляться в стерильных условиях.- Весят мыши (C57BL/6JRj, обоих полов, 8 недель) и анестезировать смесью кетамина и ксилазина (100 мг/кг; 10 мг/кг, соответственно) через инъекции внутрибрюшинного (и.п.). При необходимости, redose мыши с половину дозы кетамина (50 мг/кг) в ходе хирургической процедуры. Кроме того для хронических катетеризации, анестезировать мыши, поместив его в камеру индукции изофлюрановая в 2,5-3% изофлюрановая, в около 1 Л/мин O2. В этом случае используйте носовой конус для поддержания анестезии изофлюрановая на 1,5-2% всей операции.
- Когда мыс щепотку рефлексы прекратить, и дыхание становится медленный и стабильный, поместите животное в Стереотаксическая рама грелку.
- Примените глазная мазь. Повторяйте во время операции, когда это необходимо.
- Брить головы и шеи мыши, удаление меха и стерилизовать открытые участки кожи сначала с спиртом и затем два раза с хлоргексидином (0,5%) или раствор йода (2%). Повторите еще два раза стерилизации.
Примечание: Измените хирургические Пелерина для удаления мусора и волос после бритья. Затем драпировка животное, чтобы защитить поле стерильным. - Для хронического катетеризации, администрировать 0,5 - 1 мл лидокаина/бупивакаин (1 мг/мл и 0,25 мг/мл, соответственно) подкожно (с.к.) на сайте разрез. Администрировать бупренорфин (0,05 мг/кг; s.c.) для послеоперационного обезболивания.
- Исправьте мышь в стереотаксической рамы. После обеспечения фиксации, либо intraural или скуловой дуги Наклоните голову немного так, что она образует угол 120 ° к корпусу (Рисунок 1E).
- Найдите часть черепа, выступающие сразу над мышцы шеи - затылочной гребень. Поднимите вышележащих кожи, используя пинцет и вырезать миндаля формы кусок кожи примерно 1 см вдоль средней линии. Использование ватных тампонов или глаз Спирс для управления любой полученный кровотечения.
- С помощью гребня затылочной качестве точки отсчета, тяните за исключением поверхностных соединительной ткани подвергать ниже мышцы шеи.
- Отдельных мышц в средней линии, тщательно запустив щипцы вниз в середине разрез сайта в передней и задней оси. С парой Изогнутый пинцет в каждой руке Присоединяйтесь к советы в середине нижней части черепа и тянуть мышцы сторону.
Примечание: Это следует подвергать см, которая появляется в виде крошечных Превернутый треугольник, изложенные выше мозжечка и продолговатого мозга ниже, позади полупрозрачного дурального мембраны (рис. 1B и 1 C). - С помощью хирургического глаз копье или ватным тампоном, протрите дурального мембраны, охватывающих см.
-
Включение канюли в см
- Удаления канюли из фаго заполненный шприц, сохраняя иглой 30G, прилагается к задней части трубы.
- Прикрепите иглой 30G к дистиллированной водой 100 мкл шприц подключен к шприцевой насос.
- Вставьте канюлю пузырек воздуха приблизительно 1 см, сняв воздуха с помощью насоса шприца.
- С помощью шприцевый насос, снять 12 мкл желаемого ФГО трассировщика в канюлю.
- Возьмите канюля, заполнены с ФГО трассировщик, возле трубы покрыты игла с Изогнутый пинцет в доминирующей руке. Средний палец руки недоминирующих на панели уха противоположной стороны и стабильна для последующего использования в качестве отдыха канюли.
- Вставьте канюлю с углом 45° по отношению к мыши голову, проходя в центр см, определены его треугольной аспект сквозь Дура. Избегайте любого проникновения мозжечка или Продолговатый мозг. Убедитесь, что игла вводится только на глубину 1-2 мм, то есть до точки, где рельеф полностью под Дура. Релиз пинцет, держа канюли и пусть отдыхают с стороны недоминирующей канюли.
Примечание: Срезанный конец Стоматологические иглы потребует применения некоторых сил для прокалывания дурального мембраны, охватывающих см. - При необходимости, высушите любой утечки CSF после проникновения с помощью хирургического глаз копье или хлопок мазки.
- Капли 2-3 капли Цианакрилатный клей на дурального мембраны, окружающие канюли. Добавьте каплю клея ускоритель вылечить клей немедленно. Обложка, череп и игла с смесью стоматологического цемента (примерно 0,5 мг) и Цианакрилатный клей (3-5 капель). Сразу же после этого примените капли клея ускоритель вылечить.
- Для хронической катетеризации вырезать трубки (оставляя примерно 2-3 см, придает канюли) и запечатать его с хирургического шва сохранить внутричерепного давления (ИКП) уровнях, путем предотвращения утечки CSF через трубку.
- Для хронической катетеризации управлять carprofen (5 мг/кг; с.к.)
- Для хронической катетеризации поместите курсор мыши в клетке, держа его за грелку для поддержания температуры тела до тех пор, пока животное полностью оправился от анестезии.
Примечание: Животные должны быть отдельно размещены в их клетках заверить, что катетер остается неизменным. Убедитесь, что нос ясно постельных принадлежностей, поместив указатель мыши на бумажное полотенце или другой твердый субстрат.
Примечание: Следующий день, когда животные оправился от хирургической процедуры, выполняемые для вставки канюля, они могут быть введены с ФГО трассировщики. Для инъекций под наркозом, администрировать смесь кетамина/Ксилазина (100 мг/кг; 10 мг/кг, соответственно; и.п.) и выполните шаги, описанные в разделе 2. Для инъекций в спать животных перейдите к раздел 3.
2. инъекции Трейсеры спинномозговой жидкости через острые имплантированных см канюли в наркотизированных животных
Примечание: Для инъекций Трейсеры спинномозговой жидкости через острые имплантированных см канюли в наркотизированных животных, сразу же после шага 8 из предыдущего раздела, перейдите к ФГО трассирующими инъекции как описано ниже.
- С помощью шприцевый насос, запустите инъекции в см ФГО Трейсеры со скоростью 1 мкл/мин за 5 или 10 минут, что приводит в общем объеме 5 мкл или 10 мкл, соответственно. В конце инъекции позволяют трассировщик спинномозговой жидкости циркулировать по всему мозгу для 30 минут с ненарушенных канюли.
- После 30 мин вырезать трубки подключены к канюля (около 4 см расстояние от кончика иглы) и запечатать его конец с помощью хирургического шва.
- При глубокой анестезии усыпить животных путем обезглавливания. Быстро анализировать мозга и исправить ткани путем погружения в параформальдегида 4% (PFA) разводят в фосфатный буфер (PBS; 0.01M; рН 7,4) ночь (o/n) при 4 ° C.
3. инъекции Трейсеры спинномозговой жидкости через хронически имплантированных см канюли в Awake животных
- С помощью насоса шприца, разделить 7 мкл или 12 мкл желаемого ФГО трассировщика в канюли, состоит из приблизительно 30 см PE10 труб с скошенный стоматологический наконечник 0,5 см.
- Нежно сдерживать животного и сократить приблизительно на 1 см придает канюля трубки.
- Все еще под мягкий запретительных, быстро соединить канюля, заполнены с ФГО трассировщик для см имплантированных канюли.
- С помощью насоса шприца, запустите инъекции в Трейсеры см ФГО в размере 1 мкл Inject 7 мкл/мин или 12 мкл, для достижения окончательный объем спинномозговой жидкости вводят трассирующими 5 мкл или 10 мкл, таким образом компенсируя фаго, оставшиеся в имплантированных канюли. В конце инъекции позволяют трассировщик спинномозговой жидкости циркулировать по всему мозгу для 30 минут с ненарушенных канюли. Гарантировать, что трубы остается прилагаемый периоды инъекций и циркуляции.
- В конце времени циркуляции Ликвора трассирующими переходите к эвтаназии, обезглавливание, заверив, что животное глубоко под наркозом. Быстро анализировать мозга и исправить ткани путем погружения в параформальдегида 4% (PFA) разводят в фосфатный буфер (PBS; 0.01M; рН 7,4) ночь (o/n) при 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После фиксации мышей или крыс в стереотаксической рамы мышцы шеи, вокруг области затылочных гребень тупо расчлененный подвергать Чистерна magna (см). Треугольная структура см легко распознается между хвостовой частью мозжечка и продолговатого мозга (рис. 1а-1 C). Канюля 1-2 мм вставляется см, слегка пирсинг Атлантическо затылочной мембраны (рис. 1 d). Дура мембрана является жесткой структуры и вставки канюли улучшается, наклоняя голова животного на 120° относительно тела. С помощью ТНВД по-разному помечены молекулы затем вводят в Чистерна magna контролируемой скоростью (Рисунок 1E). После перерыва для циркуляции Ликвора трассирующими умерщвлены животных. Мозг тщательно расчлененный и исправлены путем погружения в 4% PFA o/n при 4 ° C. Виды мозги заготавливаемым от CM-инъекции грызунов макроскопических спинной показывают распределение Трейсеры ФГО в субарахноидальное цистерны мозжечка, в обонятельные луковицы и в paravascular пространстве вдоль средней мозговой артерии (MCAs) (Рисунок 1F ). В брюшной части мозга макроскопической мнения показывают распределение трассирующими ФГО вдоль круг Уиллис (рис. 1 g). Гистологические срезы CM-вводят мозги далее показывают распределение paravascular индикаторов в пределах паренхимы мозга. Мышей, вводят под наркозом (рис. 1 H) (или во время естественного сна, см1) показывают значительное увеличение в трассировщик распределения паренхимы мозга по сравнению с мышей вводили пока спит и свободно движущихся в их дома клетке (Рисунок 1I).
Рисунок 1: инъекции Трейсеры в Чистерна magna. (A) Схематический обзор мыши головы и мозга, расположения Чистерна magna (см) по отношению к мозга и черепа структур. Микрофотография (B) подвергаются см после того, как окружающие мышцы шеи было тупо расчлененные и толкнул в стороны. (C) увеличение области изображен в B (черный прямоугольник), показаны Перевернутый треугольная структура см (пунктирная линия) и ее расположение относительно окружающих структур, т.е. затылочная гребень, мозжечок и продолговатого мозга. (D) Микрофотография канюля, вставляется в CM. (E) схема боковой вид мыши фиксированный головы, слегка наклонена под углом 120 ° относительно тела. Врезные пунктирный прямоугольник с разделителями области показывает схема парасагиттальных представление схемы представления парасагиттальных мозга мыши с канюля, вставляется в см, изложенные в э. Шприц, который соединен к ТНВД, используется для доставки Трейсеры спинномозговой жидкости или контрастного вещества в см через трубку, подключенных к тонкой иглой 30G. Представитель образы всей мыши мозга в 30 мин после окончания инъекции см с трассирующими флуоресцентные, видно из спинной (F) и брюшной аспекты (G) . (H, I,) Представитель корональных мозга секции counterstained с DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole; 1 мкг/мл в PBS) мышах, вводят с ФГО Трейсеры в см под наркотизированных (H) и бодрствования, (I), 30 мин после окончания инъекции см со скоростью 1 мкл/мин 5 мкл объем смеси конъюгата овальбумина AF647 (О.А., 45kDa; 2% в фаго) и декстран FITC конъюгата (DEX, 3kDa; 2% в фаго). Масштаб баров, 5 мм для B, C, F, G; 2 мм для D и 500 мкм, H, I. Cb, мозжечка; СМ, magna Чистерна; CTX, коры; и OB, обонятельные луковицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представили протокол, который описывает подробные процедуры для катетеризации magna Чистерна (CMc), который предлагает простой способ доставить обозначенных молекул в отсеке CSF. CMc позволяет последующих визуализации динамики ФГО, как в естественных условиях , так и ex vivo, используя различные механизмы обработки изображений или гистологии.
Одним из главных преимуществ CMc техники заключается в его прямой доступ в субарахноидальное пространство без необходимости подвергать мозга путем краниотомии. Не требуя черепной окна или проникновения паренхимы мозга с кончиком иглы, CMc позволяет доставки молекул в отсеке Ликвора и оценка системы glymphatic минимально инвазивной процедурой, с только краткий помеха внутричерепного давления (ИКП).
В частности, инъекции в см ниже по течению от основных источников ФГО, сосудистое plexi, расположенный в желудочковой системе (боковой, третьего и четвертого желудочка). От боковых желудочков, CSF потоки с третьего желудочка через внутрижелудочкового отверстий (отверстия Монро) и третьего-четвертого желудочка через мозговой водопровод (Акведук Сильвиус) ствола мозга и спинного мозга (обзор в3 ). Спинномозговой жидкости достигает субарахноидальное пространство через CM течет через средний диафрагмы (или отверстие Мажанди), и таким образом CMc инъекции обойти весь желудочковой системы. Однако хотя это может быть проблематичным в некоторых моделях ЦСЖ/ISF динамики через желудочков, прямого впрыска в желудочках Трейсеры требует инвазивных хирургических процедур, таких как сверление отверстий Берр в windows черепа и применение желудочков инъекции существенно нарушить МСП13. Аналогичным образом давление впрыска Трейсеры в субарахноидальное пространство13,14 в наших руках отменяет потока ЦСЖ Трейсеры вдоль paravascular пространства. В противоположность этому даже несмотря на то, что CMc влечет за собой прокол дурального мембраны, ПМС только временно возмущенных и быстро восстановленный2.
С помощью CMc, glymphatic активность может быть измерена наркотизированных животных после острой CMc, а также в спать животных, наблюдения за 24-часовой восстановительный период после имплантации канюли. Острый CMc подходит для комбинации с 2-фотонных изображений, которая предоставляет подробную информацию о glymphatic деятельности в пределах коры на глубину примерно 200 мкм1,2. Важно отметить, что острая CMc также дает преимущество поддержки беспристрастной МРТ исследования, где трассирующими распределения следует динамически, относительно отдельных исходных изображений, приобретенных до начала ФГО трассирующими инъекций15, 16 , 17. для МРТ, Стоматологические иглы, используемые для CMc должны быть заменены боросиликатное капиллярные (примерно 1 см длины, диаметра кончика приблизительно 20 мкм) прилагается к ПЭ трубы.
В отличие от острого катетеризации хронические CMc позволяет экспериментатору для выполнения ФГО трассирующими инъекций в животных во время естественного сна или под наркозом, а так же в Пробудитесь, свободно перемещающихся животных. Это является решающим фактором, поскольку glymphatic деятельность весьма зависит от состояния; трассирующими приток в паренхиме гораздо больше животных, которые были введены под наркозом или спит, чем у животных, которые были вложены в awake состоянии1. Кроме того животные с хронически имплантированных канюля могут получить ФГО трассирующими их дома клетке, таким образом минимизируя отягощающих факторов из-за последствий стресса и возбуждение на glymphatic активность. Для хронической инъекции под наркозом, смесь кетамина/Ксилазина (100 мг/кг; 10 мг/кг, соответственно) рекомендуется. Изофлюрановая в концентрациях выше 1,5% вызывает отек мозга и не повысить активность glymphatic, по сравнению с проснулся состояние1. Обратите внимание, что после имплантации CMc, животные должны быть один размещенный, для того чтобы обеспечить что CMc имплантированных животных не повредят канюля друг от друга. Кроме того поскольку хронического вживления CMc это хирургическая процедура восстановления, она должна быть выполнена в стерильных условиях и животные должны получать послеоперационное анальгетиков.
Важно отметить, что CMc может использоваться как метод для доставки Трейсеры ФГО в мышей и крыс, с минимальными изменениями в протоколе. Соответствующие анестетиков доза должна управляться и максимальный объем спинномозговой жидкости трассировщик, который вводится в крыс составляет 30 мкл, вследствие различий в размере желудочков и субарахноидального пространства между двумя видами.
Несмотря на свою простоту процедурного некоторые обучения и практики требуется для экспериментатора успешно выполнять CMc. Так как см варьируется в размерах между видами и отдельных животных, желательно практике признания его структуры. Практикующих процедуру, используя синий Эванс (2% в фаго) позволяет экспериментатору для подтверждения правильного иглы. Иногда судно будет располагаться непосредственно в срединной см, после чего иглу следует вставить рядом с корабля, но как можно ближе к средней линии. Эти случаи следует отметить, для последующего подтверждения, что Трейсеры распределяются равномерно, несмотря на размещение-центр кончик иглы. Важно отметить, что Атлантическо затылочной мембраны, охватывающих см механически груб, и достаточное давление должно применяться к вставить кончик среза иглы. Однако важно, что давление не позволяет погрузиться кончик иглы в Продолговатый мозг и мозжечок. Для облегчения вставки иглы в см, глава животных должна быть наклонена вниз под углом 120 ° относительно тела, который тянется мембраны. Важно отметить, что следует проявлять осторожность, чтобы не препятствовать дыхания по этой головы сгибания. Если кончик иглы следует ввести мозжечка, Трейсеры будет сохраняться в тканях и не распространять на протяжении субарахноидальное пространство. Повреждение мозга часто со смертельным исходом, в то время как в прострации и общие аномалии в поведении животных может привести к повреждению мозжечка в хронический cannulations. Чтобы свести к минимуму риск возникновения этой ситуации, можно использовать иглы с меньшей длиной фаски.
При перемещении мышцы в области шеи, которая охватывает Дура мембраны для вставки канюли в см, кровотечение может произойти. Ватные тампоны могут использоваться для поглощения кровотечение, но в качестве альтернативы могут применяться хлорного раствора. Хлорида железа имеет гемостатический эффект18, а также вызывает жесткости мышц шеи, вокруг места разреза, тем самым помогая получить правильные вставки иглы в см. железа хлорид также сушит вне черепа и дурального мембраны, представляющих лучше поверхности для склеивания канюли. Для CMc применяют 1-2 капли раствора хлорида железа (10%) (примерно 1 мл) в хлопка тампон и тыкать мышцы шеи и затылочной гребень. Однако актуальные хлорного возможно может проникать через мембрану в спинномозговой жидкости, с неизвестными последствиями на мозг гомеостаза. Если использование хлорида железа является предметом озабоченности, один вместо этого можно использовать ретракторы рану держать открытыми на сайте разрез. Осторожного удаления ретракторы раны после применения Цианакрилатный клей предотвращает случайное вложение на сайте разрез.
CMc является простым и воспроизводимые процедуры доставить молекулы непосредственно в отсеке CSF. Так как CMc является малоинвазивной, он является предпочтительным методом для визуализации glymphatic системы и могут быть объединены с различных изображений механизмов например эпифлуоресцентного и 2-Фотон микроскопии или МРТ. Таким образом CMc представляет собой прекрасный инструмент для исследования динамики жидкости, а именно Ликвора и СБИ, а также жидкости просвета мозга. Благодаря макроскопических охвата системы glymphatic CMc имеет потенциал, чтобы быть использованы для доставки молекул мозга широкий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Ново Нордиск фонд и Национальный институт неврологических нарушений и инсульта, NINDS/низ (м.н.). A.L.R.X. и S.H-R являются получателями докторантура стипендий и PhD стипендии от фонда компании «Лундбек», соответственно.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , Under Revi (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE--the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
