Summary
Her beskriver vi en protokol for at udføre cisterna magna cannulation (CMc), en minimalt invasiv måde at levere røbestoffer, substrater og signalering molekyler i cerebrospinalvæske (CSF). Kombineret med forskellige billeddiagnostiske modaliteter, muliggør CMc glymphatic system samt CSF dynamics vurdering og hjerne-wide levering af forskellige forbindelser.
Abstract
Cisterna magna cannulation (CMc) er en enkel procedure, der muliggør direkte adgang til cerebrospinalvæske (CSF) uden udløsende skader på kraniet og hjernen parenkym. I bedøvede gnavere, eksponering af dura mater af stump dissektion af nakkemusklerne gør det muligt for indsættelse af en kanyle i cisterna magna (CM). Kanyle, der består enten af en fin skrå nål eller borosilicate kapillær, er knyttet via en polyethylen (PE) rør til en sprøjte. Ved hjælp af en sprøjte pumpe, kan molekyler derefter blive injiceret til kontrollerede priser direkte i CM, som er sammenhængende med subarachnoidale rum. Fra subarachnoidale rum, kan vi spore CSF strømme af konvektive flow i perivascular plads omkring gennemtrængende arterioler, hvor opløste udveksling med den interstitielle væske (ISF) opstår. CMc kan udføres akut injektioner umiddelbart efter operationen, eller kronisk implantation, med senere injektion i bedøvede eller vågen, frit flytte gnavere. Kvantitering af tracer fordeling i hjernen parenkym kan udføres af epifluorescensmikroskop, 2-foton mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MR), afhængigt af de fysisk-kemiske egenskaber af de injicerede molekyler. Således tilbyder CMc sammenholdt med forskellige Billeddannende teknikker et stærkt værktøj til vurdering af glymphatic system og CSF dynamik og funktion. Derudover kan CMc udnyttes som en kanal for hurtig, hjerne-wide levering af signalering molekyler og metaboliske substrater, der ellers ikke kunne krydse blod-hjerne barrieren (BBB).
Introduction
Cerebrospinalvæske (CSF) bader det centrale nervesystem (CNS) i hele den ventrikulære systemet og langs de subarachnoidale rum, et anatomisk defineret plads i kontinuum med hjertekamrene, der omgiver hjernen og rygmarven. En af de vigtigste funktioner af CSF er at skabe en rute for clearance af metabolitter og opløste stoffer fra hjernen parenkym. Clearance lettes via det nyligt opdagede glymphatic system1, hjernen analog til det perifere lymfesystemet. Heri, vi beskrive og diskutere cisterna magna cannulation (CMc), en minimalt invasiv metode for den direkte levering af molekyler i EFSR'EN. CMc er den vigtigste metode til at studere funktionen glymphatic. CMc kan desuden også anvendes til studiet af CSF dynamics og en hurtig, hjerne-wide levering af ikke-blod-hjerne barrieren (BBB) gennemtrængelig molekyler i hjernen parenkym, langs perivascular pladsen.
CMc udnytter fysiologiske principper af CSF bevægelse dynamikken gennem CNS levere mærket tracer molekyler eller narkotika ind i CSF-fyldte rummet cisterna Magna (CM). Molekyler er injiceres gennem en kanyle implanteres i den atlanto-occipital dural membran dækker CM. molekyler transporteres derefter af CSF bulk flow til hjernen parenkym via paravascular plads1. Tracer eller kontrast agent injiceret via CMc følger flytning af CSF, hvilket giver mulighed for vurdering af CSF bevægelse og glymphatic tilstrømning af kvantificere intensitet niveauer af mærket molekyler, som angiver hjernen parenkym. CMc er kompatibel med forskellige Billeddannende teknikker herunder epifluorescensmikroskop, 2-foton mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MR). Denne vurdering kan også udføres både i vivo eller ex vivo. Vigtigere, CMc giver mulighed for visualisering af glymphatic systemet under anæstesi eller under naturlig søvn og vågen, frit bevægelige dyr.
CMc teknik kan udnyttes til at studere forskellige aspekter af fluid dynamik i EFSR'EN, men har vist sig for at være særdeles nyttigt for at studere glymphatic system. Glymphatic aktivitet drev den konvektive strømmen af CSF fra periarterial plads via aquaporin-4 (AQP-4) vandkanaler, som er bundet i membranen af astrocytic kar-indpakning endfeet. Den konvektive flow muliggør udveksling af CSF og interstitiel væske (ISF) i hjernen parenkym. CSF/ISF indeholdende metaboliske affald og opløste stoffer er derefter fjernet fra hjernen parenkym via perivenous plads2,3. I sidste ende, når CSF/ISF periferi via for nylig beskrevet dural lymfekar4,5. Glymphatic system har vist afgørende for regnskabsafslutningen for skadelige affald metabolitter som amyloid-β2. Yderligere, glymphatic clearance er nedsat i aging6, efter traumatisk hjerne skade7, og i dyremodeller for diabetes8 og Alzheimers sygdom9. Især, er glymphatic aktivitet staten afhængige, viser betydeligt højere aktivitet under søvn eller anæstesi i forhold til vågenhed1. Ja, unge bedøvede dyr udviser den højeste glymphatic aktivitet. Eksperimentelle kvantificering af glymphatic aktivitet er således kritisk, når man studerer sin rolle i sundhed og sygdom.
Flere undersøgelser har behandlet CSF dynamik og dets omstigning til interstitiel væske (ISF) i hjernen parenkym. Metoderne af der mærkede molekyler er leveret er dog snarere invasive, udløser hjernen parenkym skader og ændringer i den intrakranielt tryk (ICP) (Se anmeld10). Nogle eksempler er intraventrikulært eller intraparenchymal injektioner, som involverer kraniotomi eller boring af en burr hul i kraniet. Disse procedurer har vist sig at ændre ICP, dermed forstyrre glymphatic funktion2. Også sådanne invasive metoder, der fremkalde astrogliosis og øge AQP-4 immunoreactivity i hjernen parenkym beskadiget område og dets omgivelser11,12. Astrocytter og AQP-4 er centrale elementer i glymphatic systemet, er CMc den foretrukne metode for sine undersøgelser. De store fordele ved CMc i forhold til mere invasive procedurer er opretholdelse af en intakt kraniet og hjernen parenkym, undgå ICP ombygninger og astrogliosis, henholdsvis. Således åbner CMc sammenholdt med forskellige afbildningsværktøjer for en bred vifte af muligheder for at studere ikke blot glymphatic systemet, men også dynamikken og mekanismer af flydende flow i homøostase, såvel som i dyremodeller for neurologiske sygdomme.
Cisterna magna cannulation (CMc) procedure giver nem og direkte adgang til cerebrospinalvæske (CSF). Ved indblæsning af forskellige molekyler (fx fluorescerende sporstoffer, MR-kontrastmidler) kan eksperimentatoren spore deres bevægelser inden for CSF rum og vurdere aktiviteten af glymphatic systemet. Følgende protokol beskriver både den akutte CMc, for injektioner umiddelbart efter operationen, og kronisk implantation af kanyle, hvori dyret genindvinder fra den kirurgiske procedure for en senere injektion. Den vigtigste forskel mellem akut og kronisk implantation er, at den kroniske implantation giver mulighed for undersøgelse af glymphatic aktivitet i vågen mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer er udført i overensstemmelse med det europæiske direktiv 2010/63/EU til dyreforskning og var godkendt af Rådets dyret forsøg under Ministeriet for miljø og fødevarer (2015-15-0201-00535).
1. proceduren for Cannulation
- Kanyle forberedelse
Bemærk: Undgå at røre kanylen med ikke-sterile handsker.- Afbryde den skrå metal spidsen af en 30G dental needle ved hjælp af en nål holder.
- Ved hjælp af en nål holder, forberede kanylen ved at indsætte den skrå metalspids (ca. 0,3 cm) i en 30 cm længde af PE10 rør (polyethylen slanger 0,024" OD x 0.011" ID) fyldt med aCSF (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4 , 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM glukose, 26 mM NaHCO3; pH 7,4 når gasset med 95% O2 og 5% CO2).
- Skyl kanylen med aCSF ved hjælp af en 1 mL sprøjten udstyret med en 30G nål (30 G x ½" 0,3 x 12).
-
Kirurgisk procedure
Bemærk: Den kroniske CM cannulation tillader dyr at tilbagesøge den kirurgiske procedure. CM injektioner foretages dagen efter kanyle implantation og vigtigere, kan udføres i enten bedøvede eller vågen dyr. Da dette er en opsving operation, foretages procedurer ud under sterile forhold.- Vejer mus (C57BL/6JRj, begge køn, 8 uger) og bedøver den med en blanding af ketamin og xylazin (100 mg/kg, 10 mg/kg, henholdsvis) via intraperitoneal (i.p.) injektion. Hvis det er nødvendigt, redose mus med en halv dosis af ketamin (50 mg/kg) i løbet af den kirurgiske procedure. Alternativt, for kronisk cannulation, bedøver musen ved at placere det i en isofluran induktion kammer på 2,5-3% isofluran, i ca. 1 L/min O2. I dette tilfælde bruge en næsen kegle til at opretholde isofluran anæstesi på 1,5-2% i hele operationen.
- Når tå knivspids reflekser ophører, og åndedræt bliver langsom og støt, placere dyret i et stereotaxisk ramme over en varmepude.
- Anvende oftalmologiske salve. Gentag under operationen når det er nødvendigt.
- Barbering hoved og hals af musen, Fjern skind og sterilisere eksponeret hud først med en spritserviet og derefter to gange med klorhexidin (0,5%) eller jodopløsning (2%). Gentag sterilisation to gange mere.
Bemærk: Ændre den kirurgiske drapere for at fjerne snavs og hår efter barbering. Derefter drapere dyret for at beskytte det sterile felt. - For den kroniske cannulation, administrere 0,5 - 1 ml lidokain/bupivacaine (1 mg/ml og 0,25 mg/ml, henholdsvis) subkutant (s.c.) på webstedet indsnit. Administrere buprenorphin (0,05 mg/kg, s.c.) til post-kirurgiske analgesi.
- Fix musen i stereotaxisk rammen. Efter at sikre fiksering, enten intraural eller den zygomatic svangen, vippe hovedet lidt så det danner en vinkel på 120° til kroppen (figur 1E).
- Finde del af kraniet, udstående umiddelbart over nakkemuskler - occipital crest. Løft den overliggende hud med en pincet, og skære en mandel formede stykke hud på ca 1 cm langs midterlinjen. Brug bomuld svaberprøver eller øjet spyd til at kontrollere eventuelle deraf følgende blødning.
- Brug den occipital crest som et referencepunkt, trække fra hinanden overfladiske bindevæv at eksponere nakkemuskler nedenfor.
- Adskille musklerne på midterlinjen af omhyggeligt kører pincet ned i midten af webstedet indsnit i anterior-til-posterior akse. Med et par buet pincet i hver hånd, Deltag tips i midten nær bunden af kraniet og trække muskler til side.
Bemærk: Dette bør udsætte CM, der vises som en lille trekant, skitseret af lillehjernen ovenfor og medulla nedenfor, bag de gennemsigtige dural membran (figur 1B og 1 C). - Ved hjælp af en kirurgisk øje spyd eller bomuldsklud, tør den dural membran, der dækker CM.
-
Indsættelse af kanylen i CM
- Fjerne kanylen fra den aCSF-fyldt sprøjte, holde 30G nålen knyttet til den bageste ende af slangen.
- Tillægge en destilleret vand-fyldte 100 µL sprøjte tilsluttet en sprøjten pumpe 30G kanyle.
- Indsæt en luftboble i ca. 1 cm i kanylen ved at trække luft ved hjælp af en sprøjten pumpe.
- Ved hjælp af en sprøjte pumpe, hæve 12 μl af ønskede CSF sporstof ind i kanylen.
- Forstå kanyle, fyldt med CSF tracer, nær tube-dækket nålen med et par buet pincet holdt i den dominerende hånd. Hvile den midterste finger af ikke-dominerende hånd på linjen øre af den modsatte side og holde det fast til senere brug som en hvile for kanylen.
- Indsæt kanylen i en vinkel på 45° i forhold til musen hovedet, passerer ind i midten af CM, identificeret ved dens trekantede aspekt set gennem dura. Undgå enhver indtrængen af cerebellum og medulla. Sikre, at nålen er kun sat til en dybde af 1-2 mm, dvs til det punkt hvor facet er helt under dura. Frigive pincet holding kanylen, og lad kanylen hvile på ikke-dominerende hånd.
Bemærk: Den skrå ende dental nåle vil kræve anvendelse af nogle kraft til at gennembore det dural membran, der dækker CM. - Hvis det er nødvendigt, tørre ud alle CSF lække ved penetration ved hjælp af en kirurgisk øje spyd eller bomuld svaberprøver.
- Drop 2-3 dråber ren lim på de dural membran omgiver kanylen. Tilføj en dråbe lim accelerator til at kurere limen straks. Dække kraniet og nål med en blanding af dental cement (ca 0,5 mg) og ren lim (3-5 dråber). Umiddelbart efter, anvende en dråbe lim accelerator til at helbrede.
- For kronisk cannulation, skæres slange (forlader ca 2-3 cm knyttet til kanylen) og forsegle det med en kirurgisk weld at bevare intrakranielt tryk (ICP) niveauer, ved at forhindre CSF lækage gennem slangen.
- For kronisk cannulation, administrere carprofen (5 mg/kg, s.c.)
- For kronisk cannulation, skal du placere musen i et bur, holder det over en varmepude til at opretholde kropstemperaturen, indtil dyret er fuldt tilbagebetalt fra anæstesi.
Bemærk: Dyrene skal placeres enkeltvis i deres bure at forsikre, at kanylen forbliver intakt. Sikre, at næsen er ryddet for sengetøj ved at placere musen på et stykke køkkenrulle eller andet fast underlag.
Bemærk: Den følgende dag, hvor dyr er kommet fra den kirurgiske procedure udføres for kanyle indsættelse, de kan blive injiceret med CSF røbestoffer. Injektionsvæske under bedøvelse, administrere en blanding af ketamin/xylazin (100 mg/kg, 10 mg/kg, henholdsvis; i.p.) og Fortsæt til trin, der beskrives i afsnit 2. Til injektion i vågen dyr, gå til afsnit 3.
2. indsprøjtning af CSF røbestoffer via akut implanterede CM kanyle i bedøvede dyr
Bemærk: Til injektion af CSF røbestoffer via akut implanterede CM kanyle i bedøvede dyr, umiddelbart efter skridt 8 fra forrige afsnit, videre til CSF tracer injektion, som beskrevet nedenfor.
- Ved hjælp af en sprøjte pumpen starte indsprøjtning i CM af CSF røbestoffer med en hastighed på 1 μL/min i 5 eller 10 min., hvilket resulterer i en samlet maengde paa 5 µL eller 10 µL, henholdsvis. Tillad CSF sporstof til at cirkulere i hele hjernen for 30 min med kanyle uforstyrret for enden af injektion.
- Efter 30 min, skære slangen forbundet at kanylen (ca 4 cm afstand fra needle-tip) og forsegle sin afslutning ved hjælp af en kirurgisk svejsningen.
- Under dyb anæstesi, aflive dyret ved halshugning. Hurtigt dissekere hjernen og løse væv ved nedsænkning i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) fortyndet i fosfatbufferet saltopløsning (PBS; 0.01M, pH 7,4) overnatning (o/n) på 4 ° C.
3. indsprøjtning af CSF røbestoffer via kronisk implanteret CM kanyle i vågen dyr
- Ved hjælp af en sprøjte pumpe, trække 7 µL eller 12 µl af ønskede CSF sporstof ind i en kanyle, der består af ca 30 cm af PE10 slangen med en skrå dental needle spids på 0,5 cm.
- Forsigtigt dy dyret og skære ca 1 cm af slangen knyttet til kanylen.
- Stadig under blid fastholdende, hurtigt forbinde kanylen fyldt med CSF sporstof til CM implanteret kanyle.
- Ved hjælp af en sprøjte pumpe, starter indsprøjtning i CM af CSF røbestoffer med en hastighed på 1 µL/min. injicere 7 µL eller 12 µL, at opnå en endelige mængden af CSF injiceres tracer 5 µL eller 10 µL, således kompensere aCSF tilbage i de implanterede kanyle. Tillad CSF sporstof til at cirkulere i hele hjernen for 30 min med kanyle uforstyrret for enden af injektion. Sikre, at slangen forbliver vedlagte injektion og omsætning perioder.
- Lade eutanasi ved halshugning, forsikrede, at dyret er dybt bedøvede enden af CSF tracer omsætning tid. Hurtigt dissekere hjernen og løse væv ved nedsænkning i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) fortyndet i fosfatbufferet saltopløsning (PBS; 0.01M, pH 7,4) overnatning (o/n) på 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter fiksering af mus eller rotter i et stereotaxisk ramme, er halsen musklerne omkring regionen occipital crest ligefremt dissekeret for at udsætte cisterna magna (CM). Den trekantede struktur af CM genkendes let mellem den caudale del af lillehjernen og medulla (figur 1A-1 C). Kanylen indsættes 1-2 mm i CM af forsigtigt piercing atlanto-occipital membran (fig. 1 d). Dura membranen er en hård struktur og indsættelse af kanylen er forbedret ved at vippe det animalske hovedet af en 120° i forhold til kroppen. Ved hjælp af en indsprøjtningspumpe, er anderledes mærket molekyler derefter sprøjtet ind i cisterna magna til kontrollerede priser (figur 1E). Efter et interval til at tillade CSF tracer omsætning, er dyrene aflivet. Hjernen er omhyggeligt dissekeret og fast ved nedsænkning i 4% PFA o/n ved 4 ° C. Makroskopisk dorsale udsigt over hjerner høstet fra CM-indsprøjtning gnavere viser fordelingen af CSF røbestoffer i subaraknoid cisterner af lillehjernen, olfaktoriske pære og paravascular plads langs den midterste cerebrale arterier (MCAs) (figur 1F ). I den ventrale del af hjernen viser makroskopisk udsigt CSF tracer distribution langs kredsen af Willis (figur 1 g). Histologiske sektioner af CM-indsprøjtning hjerner yderligere afsløre paravascular fordelingen af røbestoffer i hjernen parenkym. Mus injiceres under anæstesi (figur 1 H) (eller under naturlig søvn, se1) viser en bemærkelsesværdig stigning i tracer fordeling i hjernen parenkym i forhold til musene injiceret mens vågen og frit bevægelige i deres hjem bur (figur 1I).
Figur 1: injektion af røbestoffer i cisterna magna. (A) skematisk oversigt over musen hovedet og hjernen viser placeringen af cisterna magna (CM) i forhold til hjernen og kranie strukturer. (B) Photomicrograph af udsatte CM efter de omkringliggende nakkemuskler har været rent ud dissekeret og skubbede til siderne. (C) højere forstørrelse af området afbildet i B (sort rektangel), viser inverteret trekantede struktur CM (stiplet linje) og dens placering i forhold til de omkringliggende strukturer, dvs occipital crest, cerebellum og medulla. (D) fotomikrografi af kanylen indsættes i CM. (E) ordning af den laterale opfattelse af mus fast hoved, lidt på skrå i en vinkel på 120 ° i forhold til kroppen. Inset stiplet rektangel afgrænset område viser ordningen af en parasagittal Se parasagittal udsigt over musen hjernen med kanylen indsættes i fælles håndbog, som skitseret i E. En sprøjte, som er koblet til en indsprøjtningspumpe, der bruges til at levere CSF røbestoffer eller kontrastmidler i CM gennem et rør forbundet til en fin 30G nål. Repræsentative billeder af en hel mus hjerne på 30 min efter slutningen af CM injektion med et fluorescerende tracer set fra den dorsale (F) , og ventrale (G) aspekter. (H, I) Repræsentative koronale hjernen sektioner counterstained med DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, 1 µg/mL i PBS) af musene injiceret med CSF røbestoffer i CM under bedøvede (H) og vågenhed, (I), 30 min efter slutningen af CM injektion med en hastighed på 1 µL/min i en 5 µL volumen af en blanding af ægalbumin-AF647 konjugat (OA, 45kDa, 2% i aCSF) og dextran-FITC-konjugat (DEX, 3kDa, 2% i aCSF). Skala barer, 5 mm for B, C, F, G; 2 mm for D og 500 µm til H, I. Cb, lillehjernen; CM, cisterna magna; Ctx, cortex; og OB, olfaktoriske pære. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har præsenteret en protokol, der beskriver en detaljeret procedure for cisterna magna cannulation (CMc), som tilbyder en enkel metode til at levere mærket molekyler til CSF rum. CMc tillader den efterfølgende visualisering af CSF dynamics, både i vivo og ex vivo, ved hjælp af forskellige billeddiagnostiske modaliteter eller histologi.
En af de vigtigste fordele ved CMc teknik ligger i direkte adgang til den subarachnoidale rum uden at udsætte hjernen ved kraniotomi. Ved ikke at kræve en kraniel vindue eller penetration af hjernen parenkym med en nål-spids, tillader CMc levering af molekyler i CSF rum og evaluering af systemet til glymphatic af en minimalt invasiv procedure, med kun kort forstyrrelse af intrakranielt tryk (ICP).
Især, injektion i fælles håndbog er downstream af de vigtigste kilder til CSF, plexus plexi beliggende i den ventrikulære systemet (lateral, tredje og fjerde hjertekamrene). Fra de laterale ventrikler, CSF strømme til den tredje ventrikel via de intraventrikulært foramina (foramen af Monro) og fra tredje til fjerde hjertekamrene via cerebral akvædukt (akvædukten af Sylvius) til hjernestammen og rygmarven (gennemgik i3 ). CSF når subaraknoid rummet via CM af strømmer gennem den mediane blænde (eller foramen af Magendie), og dermed CMc injektioner omgå hele ventrikulære systemet. Men selvom det kan være problematisk i nogle modeller af CSF/ISF dynamics gennem hjertekamrene, direkte indsprøjtning af røbestoffer i hjertekamrene kræver invasive kirurgiske procedurer såsom boring af burr huller i vinduerne kraniet, og anvendelsen af ventrikulær injektioner forstyrre væsentligt ICP13. Ligeledes afskaffer pres injektion af røbestoffer i subaraknoid plads13,14 i vores hænder flux af CSF røbestoffer langs paravascular pladsen. I modsætning hertil, selvom CMc indebærer punktering af dural membran, ICP er kun forbigående foruroliget og er hurtigt restaureret2.
Ved hjælp af CMc, kan glymphatic aktivitet måles i bedøvede dyr efter akut CMc samt i vågen dyr, observere en 24-timers tilbagebetalingsperioden efter kanyle implantation. Akut CMc er velegnet til kombination med 2-foton imaging, som indeholder detaljerede oplysninger om glymphatic aktivitet i cortex til en dybde af ca. 200 µm1,2. Vigtigere, frembyder akut CMc også fordelen, at støtte til upartiske Mr undersøgelser, hvor tracer distribution er fulgt dynamisk, i forhold til et individuelt billede erhvervet før indledningen af CSF tracer injektion15, 16 , 17. for Mr, dental nålen bruges til CMc bør erstattes af en borosilicate kapillær (ca 1 cm længde, tip diameter af ca. 20 µm) knyttet til PE rør.
I modsætning til akut cannulation tillader kronisk CMc eksperimentatoren at udføre CSF tracer injektion i dyr under naturlig søvn eller under bedøvelse, såvel som i vågen, frit flytte dyr. Dette er en afgørende faktor, da glymphatic aktivitet er meget stat-afhængige; Tracer tilstrømning til parenkym er meget større i dyr, der blev sprøjtet under bedøvelse eller i søvn end i dyr, der blev injiceret i vågen tilstand1. Derudover kan dyr med en kronisk implanterede kanyle modtage CSF tracer i deres hjem bur, hvilket minimerer konfunderende faktorer på grund af virkningerne af stress og ophidselse på glymphatic aktivitet. For kronisk injektioner under anæstesi, en blanding af ketamin/xylazin (100 mg/kg, 10 mg/kg, henholdsvis) anbefales. Isofluran ved koncentrationer over 1,5% inducerer hjernen hævelse og øge ikke glymphatic aktivitet i forhold til vågen tilstand1. Bemærk, at efter CMc implantation, dyr bør være enkelt har til huse, for at sikre, at CMc implanteret dyr ikke vil beskadige kanylen af hinanden. Også, da CMc kronisk implantation er en kirurgisk procedure, inddrivelse, det bør udføres under sterile forhold og dyr bør modtage under analgetika.
Vigtigere, kan CMc bruges som en metode til at levere CSF røbestoffer i mus og rotter, med minimale ændringer til protokollen. Passende anesthetics dosis bør administreres og den maksimale lydstyrke af CSF tracer, der sprøjtes i rotter er 30 µL, på grund af forskelle i størrelsen af ventrikel og subarachnoidale rum mellem de to arter.
Trods sin proceduremæssige enkelhed er nogle uddannelse og praksis nødvendig for eksperimentatoren at held udføre CMc. Da CM varierer i størrelse mellem arter og enkelte dyr, er det tilrådeligt at praktisere anerkendelse af dets struktur. Øve procedure ved hjælp af Evans blå (2% i aCSF) tillader eksperimentatoren at bekræfte korrekte nål indsættelse. Lejlighedsvis, skal et fartøj placeres direkte på midterlinjen af CM, hvorefter nålen skal indsættes ved siden af skibet, men så tæt som muligt til midterlinjen. Disse tilfælde bemærkes for senere bekræftelse at røbestoffer er jævnt fordelt, trods den off-center placering af nålen tip. Vigtigere, den atlanto-occipital membran, der dækker CM er mekanisk hård, og tilstrækkeligt pres bør anvendes for at indsætte skrå nål-spidsen. Det er imidlertid afgørende, at den pression, ikke medfører kaster needle-tip i medulla eller lillehjernen. For at lette nål indsættelse i fælles håndbog, skal lederen af dyr vippes nedad i en vinkel på 120° i forhold til kroppen, som strækker sig til membranen. Vigtigere, Vær forsigtig ikke at hindre respiration af denne hoved fleksion. Hvis nålen tip bør indtaste lillehjernen, røbestoffer bevares i vævet og undlader at distribuere hele subarachnoidale rum. Skader til medulla er ofte dødelig, lillehjernen skader i kronisk cannulations kan medføre udmattelse og generelle abnormiteter i dyrenes adfærd. For at minimere risikoen for denne eventualitet, kan nåle med en mindre facet længde bruges.
Når du flytter musklerne i halsregionen, der dækker dura membran for at indsætte kanylen i fælles håndbog, kan blødning forekomme. Bomuld svaberprøver kan bruges til at absorbere den blødning, men alternativt ferrichloridopløsning løsning kan anvendes. Ferrichloridopløsning har en hæmostatisk effekt18, og udløser også stivhed af nakkemuskler omkring indsnit stedet, hvilket bidrager til at opnå korrekte indsættelse af nålen i CM. Ferric chlorid også tørrer ud af kraniet og dural membran, præsentere bedre overflader for vedhæftning af kanylen. For CMc, Påfør 1-2 dråber af ferrichloridopløsning opløsning (10%) (ca. 1 mL) til en bomuld svaber og ising nakkemusklerne og occipital crest. Dog kan aktuelt ferrichloridopløsning eventuelt sive gennem membranen i CSF, med ukendte virkninger på hjernen homøostase. Hvis brugen af ferrichloridopløsning er anledning til bekymring, kan man i stedet bruge sår retraktorer for at holde åbne webstedet indsnit. Omhyggelig fjernelse af sår retraktorer efter anvender ren lim undgår utilsigtet vedhæftet fil til webstedet indsnit.
CMc er en simpel og reproducerbar procedure at levere molekyler direkte ind i CSF rum. Da CMc er minimalt invasiv, det er den foretrukne metode for visualisering af glymphatic-systemet og kan kombineres med forskellige Billeddannende modaliteter som epifluorescensmikroskop og 2-foton mikroskopi eller Mr. CMc udgør således, et fantastisk værktøj for undersøgelser af fluid dynamik, nemlig CSF og ISF, og også af hjernen væske clearance. På grund af den makroskopiske dækning af glymphatic systemet har CMc potentiale til at blive brugt til at levere molekyler hjerne-dækkende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Novo Nordisk Fonden og nationale Institut for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. og Lizettes-R er modtagere af en postdoc stipendium og et PhD legat fra Lundbeckfonden, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , Under Revi (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE--the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
