Summary
ここチステルナ マグナ カニュレーション (CMc)、脳脊髄液 (CSF) にトレーサー、基板、シグナル分子を提供する低侵襲の方法を実行するプロトコルについて述べる。別の画像診断装置と組み合わせると、CMc が glymphatic システム、CSF のダイナミクス評価、様々 な化合物の脳全体で配信できます。
Abstract
チステルナ マグナ カニュレーション (CMc) は、頭蓋骨や脳実質への手術損傷なし脳脊髄液 (CSF) への直接アクセスを可能にする簡単な手順です。麻酔をかけられた齧歯動物、首の筋肉の鈍的切離による硬膜の露出槽 (CM) にカニューレを挿入ことができます。ベベル針またはホウケイ酸ガラス キャピラリーのいずれかで構成された、カニューレは、注射器にポリエチレン (PE) 管経由で添付されます。シリンジ ポンプを使用すると、分子を挿入できます制御率では、くも膜下腔と連続 CM に直接。くも膜下腔から我々 は間質液 (ISF) と溶質の交流が発生する貫通細動脈の周りの血管周囲スペースに対流に CSF フラックスを追跡できます。CMc または実行できますすぐに術後急性の注射のため慢性的な注入、麻酔で目を覚まし、以降のインジェクションの齧歯動物を自由に移動します。磁気共鳴画像 (MRI)、注入された分子の物理化学的特性によって、2 光子顕微鏡落射蛍光脳実質におけるトレーサー分布の定量が可能です。このように、様々 なイメージング技術と組み合わせて CMc は、glymphatic システムと髄液循環動態とその機能の評価のための強力なツールを提供しています。さらに、シグナル伝達分子と血液脳関門 (BBB) をそれ以外の場合はクロスができませんでした代謝基質の脳全体に高速配信するための導管として CMc を活用することができます。
Introduction
脳脊髄液 (CSF) は、心室システム全体と解剖学的に定義された領域を連続で、脳室と脳や脊髄をとりまく、くも膜下のスペースに沿って、中枢神経系 (CNS) を浴びる。CSF の主な機能の 1 つは代謝と脳実質からの溶質のクリアランスのためのルートを提供するためにです。クリアランスは、最近発見された glymphatic システム1、末梢のリンパ系にアナログ脳を介して促進されます。ここで、我々 説明し、チステルナ マグナ カニュレーション (CMc) 低侵襲法 CSF 中に分子の直接配信します。CMc は、glymphatic 関数を勉強するため重要なメソッドです。さらに、CMc は、髄液循環動態の研究と血管周囲のスペースに沿って、脳実質に非血液脳関門 (BBB) を透過性分子の脳全体に高速配信するためにも適用できます。
CMc 槽 (CM) の脳脊髄液で満たされた空間に標識トレーサー分子や薬を提供する中枢神経系を介して髄液循環運動動態の生理学的原則を悪用します。分子は、cm 分子は paravascular スペース1を介して脳実質に CSF 一括流れによってそれから運ばれる環椎後頭骨硬膜膜屋根に注入カニューレによって挿入されます。CMc によって挿入されたトレーサーまたはコントラストのエージェントにより CSF の動きと glymphatic 流入の評価、脳実質が入力された分子の強度レベルを定量化することで脳脊髄液の動きに追従します。CMc は、落射蛍光、2 光子の顕微鏡検査、磁気共鳴画像 (MRI) などさまざまなイメージング技術と互換性が。また、この評価をすることができます体内または体外で実行します。重要なは、CMc は、麻酔下でまたは自然な睡眠中にだけでなく、目を覚まし、自由に移動する動物の glymphatic システムの可視化のためことができます。
CMc 手法が CSF における流体力学のさまざまな側面を研究することが出来、glymphatic システムを学ぶために特に有用であると証明しました。Glymphatic 活動は終足血管折り返しアストロ サイトの膜に繋留するアクアポリン 4 (アクアポリン 4) 水路を介して動脈領域から脳脊髄液の対流をドライブします。対流の流れにより、髄液と脳実質内の間質液 (ISF) のインターチェンジ。CSF/ISF 代謝廃棄物や溶質を含むが静脈スペース2,3を介して脳実質から削除されます。最終的には、CSF/ISF 最近記述されていた硬膜リンパ管4,5を介して周囲に達する。Glymphatic システムは、アミロイド β2など有害な廃棄物代謝物質のクリアランスのため重要な示されています。さらに、glymphatic のクリアランスは加齢で6、外傷性脳傷害7後、糖尿病8 、9アルツハイマー病の動物モデルにおける障害者です。特に、glymphatic の活動は状態に依存しない、睡眠や覚醒1と比較すると麻酔中に有意に高い活性を示すです。確かに、若い麻酔下の動物は、最高の glymphatic 活動を展示します。したがって、健康と病気におけるその役割を勉強するとき、glymphatic 活動の実験の定量化は重要です。
いくつかの研究は、髄液循環動態と脳実質内に間質液 (ISF) とその交流に対処しています。ただし、標識分子を配信する方法、むしろ侵略的、脳実質の損傷、頭蓋内の圧力 (ICP) の変更をトリガー (を参照してください10を確認)。いくつかの例が脳や頭蓋骨に穴の開頭術やぎざぎざの掘削を伴うクモ膜注射。ICP、glymphatic 関数2をこうして中断することを変更するこれらの手順を示されています。また、このような侵襲的方法アストログリオーシスを誘発して脳実質損傷領域とその周辺11,12アクアポリン 4 免疫反応性を高めます。アストロ サイトとアクアポリン 4 は glymphatic システムの重要な要素である、CMc、その研究で選択の方法です。CMc より侵襲的処置と比較しての主な利点は、そのまま頭蓋骨と脳実質、ICP の変化とアストログリオーシス、それぞれ回避のメンテナンスです。したがって、glymphatic システムだけでなく、ダイナミクスを研究する可能性の広い範囲との恒常性だけでなく、神経疾患の動物モデルにおける流れのメカニズムのさまざまなイメージング ツールと組み合わせて内の CMc を開きます。
チステルナ マグナ カニュレーション (CMc) プロシージャは、脳脊髄液 (CSF) への直接アクセスをできます。異なる分子 (例えば蛍光トレーサー、MRI 造影剤) を注入することにより実験者は CSF コンパートメント内の動きを追跡し、glymphatic システムのアクティビティを評価することがことができます。次のプロトコルでは、注射、手術と動物が後で注入の手術から回復するカニューレの慢性注入直後のため、両方急性 CMc について説明します。急性および慢性の移植の最も重要な違いは、慢性的な注入が覚醒マウス glymphatic 活動の研究のためにできることです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべてのプロシージャは動物の研究のためヨーロッパの指令 2010年/63/EU に従って行われ、デンマーク環境や食品 (2015-15-0201-00535) 省の下で動物実験委員会によって承認されました。
1. カテーテル留置の手順
- カニューレの準備
注: は、非滅菌手袋でカニューレを触れないでください。- ニードル ホルダーを使用して 30 G 歯科針の斜めの金属チップを断ちます。
- PE10 の 30 cm の長さに斜めの金属チップ (約 0.3 cm) を挿入して、カニューレを準備針ホルダーを使用して満ちているアプライド (126 mM NaCl、KCl、2.5 mM 1.25 mM NaH2PO4管 (ポリエチレン管 0.024"0.011" ID x 外径)、2 mM MgSO4、2 mM CaCl2、10 mM グルコース、26 mM NaHCO3;pH 7.4 95% O2と 5% CO2毒ガスされるとき)。
- 1 mL 注射器 30 G 針 (30 x ½"0.3 x 12) 装備を使用してアプライドでカニューレをフラッシュします。
-
手術の手順
注: 慢性 CM 穿刺は、手術から回復する動物を使用できます。CM 注射注入カニューレを次の日と、重要なは、麻酔下または目がさめている動物で実行できます。これは、回復手術は、プロシージャは生殖不能の条件の下で実施必要があります。- マウス (C57BL/6JRj、男女ともに、8 週間) の重量を量るし、ケタミン ・ キシラジンの混合麻酔 (100 mg/kg; 10 mg/kg、それぞれ) 腹腔注入を介して。必要に応じて、手術中にケタミン (50 mg/kg) の半分の用量とマウスを redose します。また、慢性的な穿刺 1 L/min O2年頃に 2.5 〜 3% イソフルランにイソフルラン誘導室にそれを置くことによってマウスを麻酔します。この場合、イソフルラン麻酔手術中 1.5-2% を維持するために鼻の円錐形を使用します。
- つま先ピンチは中止、反射神経し、呼吸がゆっくりと着実な加熱パッドの上固定フレームに動物を配置します。
- 眼軟膏を塗る。術中必要に応じて繰り返します。
- マウスの頭頸部を剃る、毛皮を削除し、アルコール綿棒とクロルヘキシジン (0.5%) とヨウ素溶液 (2%)、2 回最初の皮膚露出部を消毒します。滅菌 2 回以上を繰り返します。
注: は、シェービング後の残骸と髪を削除する手術用ドレープを変更します。滅菌フィールドを保護するために動物をドレープします。 - 慢性カニューレの管理 0.5 - 1 ml リドカイン/ブピバカイン (1 mg/ml と 0.25 mg/ml、それぞれ) 皮下皮下切開部位で。手術後の鎮痛のためブプレノルフィン (0.05 mg/kg; サウスカロライナ) を管理します。
- 脳定位固定装置のフレームで、マウスを修正します。固定、いずれかの intraural を確認した後、頬骨弓は、(図 1E) 体を 120 ° の角度を形成するように頭を少し傾斜しています。
- 首の筋肉 - 後頭稜上すぐに突き出た頭蓋骨の一部を見つけます。ピンセットのペアを使用して穿刺部位の皮膚を持ち上げて、正中線に沿って約 1 センチの皮のアーモンド形部分をカットします。任意の結果出血コントロールのための槍を目または綿棒を使用します。
- 後頭稜を基準点として使用して、抜く際以下の首の筋肉を公開する表在性の結合組織。
- 慎重に鉗子を実行する前後に軸に切開部位の真ん中で正中線で筋肉を区切ります。それぞれの手でカーブタイプ鉗子のペア、頭蓋骨の下部中央のヒントに参加、脇の筋肉を引っ張る。
注: これは枠は上小脳や半透明の硬膜 (図 1 b と 1 C) の後ろに、下延髄小さな逆三角形として表示される CM を公開してください。 - 眼科手術の槍や綿棒を使用して、CM を覆う硬膜の膜を拭いてください。
-
CM にカニューレを挿入
- アプライドで満たされた注射器、チューブの後端に取り付けられた 30 G 針を維持するからカニューレを削除します。
- 30 G の針を蒸留した水で満たされた 100 μ L 注射器シリンジ ポンプに接続に接続します。
- シリンジ ポンプの援助が付いている空気を撤回することによって約 1 cm の空気の泡をカニューレに挿入します。
- シリンジ ポンプを使用すると、カニューレに必要な CSF のトレーサーの 12 μ L を撤回します。
- 支配的な手にピンセットのペアを持つチューブに覆われた針近くの CSF トレーサーでいっぱい、カニューレを把握します。反対側の耳バー非利き手の中指を置き、カニューレの残りの部分として後で使用できる安定した握り。
- 硬膜を通して見たその三角の側面によって識別される CM のセンターに渡すマウスの頭に対して 45 ° の角度でカニューレを挿入します。小脳や延髄の任意の侵入を防ぐ。すなわちベベルが硬膜下に完全ですポイントに 1-2 mm の深さに針を挿入しのみことを確認します。ピンセット、カニューレを保持を解放し、カニューレの非支配的な手に残りの部分。
注: 歯科用針の角度付き端部 CM を覆う硬膜の膜を貫通するいくつかの力のアプリケーションが必要になります。 - 必要に応じて、眼科手術の槍や綿の綿棒を使っての侵入時に任意の CSF の漏出を乾かします。
- カニューレを取り巻く硬膜にシアノアクリ レート系接着剤の 2 〜 3 滴をドロップします。接着剤をすぐに硬化する接着剤アクセラレータのドロップを追加します。頭蓋骨と針歯科用セメント (約 0.5 mg) とシアノアクリ レート系接着剤 (3-5 滴) の混合物をカバーします。直後、治すため接着剤アクセラレータの滴を適用します。
- 慢性カニュレーション (カニューレに接続されている約 2-3 cm を残して) チューブをカット、チューブ内の髄液漏出を防止することにより頭蓋内の圧力 (ICP) レベルを保持する外科的溶接でそれを封印します。
- 慢性的なカニューレの管理カルプロフェン (5 mg/kg; サウスカロライナ)
- 慢性的なカニュレーション動物が麻酔から完全に回復するまでは、体温を維持するために加熱パッドの上にそれを維持、ケージ内マウスを配置します。
注: 動物は、単独でカニューレがそのまま残ることを保証するために檻の中で収容される必要があります。ペーパー タオルまたは他の固体基板上にマウスを置くことによって、鼻の寝具の明確なことを確認します。
注: とき動物はカニューレを挿入するための外科的手術から回復した、次の日は、彼らすることができますを注入する CSF トレーサー。麻酔注入の管理ケタミン ・ キシラジンの混合物 (100 mg/kg; 10 mg/kg、それぞれ i. p.)、セクション2で説明されている手順に進みます。目がさめている動物の注入、セクション3に進みます。
2. 麻酔下の動物の急性移植 CM カニューレを介して CSF トレーサー注入
注: 下記のとおり手順、前のセクションから 8 後すぐに麻酔下の動物の急性移植 CM カニューレを介して CSF トレーサーの注入のため CSF トレーサー注入法に進んでください。
- シリンジ ポンプを使用すると、それぞれ 10 μ L、5 μ L の総ボリュームの結果 5 または 10 分の 1 の μ L/分の速度で CSF の CM トレーサー注入を開始します。注入の終わり平静のカニューレと 30 分のため脳を循環する髄液トレーサーを許可します。
- 30 分後カニューレ (針の先端から約 4 cm 距離) に接続されているチューブをカットし、手術の溶接を使用してその端をシールします。
- 深麻酔下で斬罪に動物を安楽死させます。すぐに脳を解剖、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 浸漬によって組織を修正 (PBS; 0.01M; pH 7.4) 4 ° C で一晩 (o/n)
3. 目がさめている動物で CM の慢性的な注入カニューレを介して CSF トレーサー注入
- シリンジ ポンプを使用すると、0.5 cm のベベル歯科針の先端で PE10 チューブ約 30 cm から成るカニューレに 7 μ L または 12 μ l 必要な CSF のトレーサーを撤回します。
- ゆっくり動物を抑制し、カニューレに接続されているチューブを約 1 cm のカットします。
- 穏やかな抑制の下にまだすぐに満ちている CM 注入カニューレに CSF トレーサー カニューレに接続します。
- シリンジ ポンプを使用すると、1 μ L/分注入 7 μ L の割合で CM の CSF トレーサー注入を開始または CSF の最終的なボリュームを達成するために、12 μ L 注入注入カニューレに残ってアプライドが相殺 10 μ L、5 μ L のトレーサー。注入の終わり平静のカニューレと 30 分のため脳を循環する髄液トレーサーを許可します。注入と循環の期間の間に、管が添付されていることを確認します。
- CSF トレーサー循環時間の終わりには、斬首、動物に麻酔が深くかかることを保証で安楽死に進みます。すぐに脳を解剖、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 浸漬によって組織を修正 (PBS; 0.01M; pH 7.4) 4 ° C で一晩 (o/n)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
脳定位固定装置のフレームのラットやマウスの固定時に後頭稜付近の首の筋肉は槽 (CM) を公開する解剖ぶっきらぼう。CM の三角形の構造は、小脳の尾側部分と髄質 (図 1 a-1 C) 容易に認識されます。カニューレは、優しくピアス環椎後頭膜 (図 1) で、1-2 mm を CM に挿入されます。硬膜はタフな構造とカニューレの挿入が 120 ° 身体との関係によって動物の頭部を傾けることによって向上します。注入ポンプを用いて、異なるラベルの分子は制御率 (図 1E) の槽にそれから注入されます。CSF のトレーサーの循環を許可する間隔をおいて、動物を安楽死させてください。脳は慎重に解剖し、PFA o/n 4 ° C で 4% 浸漬によって固定CM 注入齧歯動物から採取した脳の巨視的背景色 CSF トレーサーの分布を示すは、小脳のクモ膜下の水槽、嗅球および中間の大脳動脈 (岩国) (図 1 階に沿って paravascular スペース).脳の腹側の部分では、巨視的なビューは、ウィリス動脈輪 (図 1) に沿って CSF トレーサー分布を示します。さらに CM 挿入の脳組織切片 paravascular 脳実質内トレーサー分布を明らかにします。投与麻酔 (図 1 H) (またはを参照してください1、自然睡眠中に) 顕著の増加を示す投与マウスと比較して脳実質にトレーサー分布で目を覚まし、自由に移動しながらホーム ケージ (図1I)。
図 1: 槽へのトレーサー注入。(A) マウスの頭と脳と頭蓋の構造に関連して槽 (CM) の位置を示す脳の図式的な概観。(B)公開された CM 周囲の首の筋肉の解剖ではっきりと、側面にプッシュした後の顕微鏡写真です。(C) CM (破線) と周囲の構造、すなわち後頭稜、小脳、延髄に関連してその場所の逆三角形の構造を示す B (黒四角形) に描かれている領域の高倍率。(D) cm (E)方式マウス固定ヘッドの側面図の挿入カニューレのただし少し身体との関係の 120 ° の角度で傾いています。破線の四角形のはめ込みで区切られた領域を示しますマウス脳の矢状ビューの矢状ビュー方式のスキーム、CM 挿入カニューレ e. に記載されています。噴射ポンプに結合された注射器を使用して、30 G 針に接続されている管を通って CM に CSF トレーサーまたは造影剤を提供します。CM 背(F) 、 (G)の腹側側面から見た蛍光トレーサー注入終了後 30 分で全体のマウス脳の代表的なイメージ。(H、I)代表的なコロナの脳のセクションが DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole; 1 μ g/mL の PBS で) CSF トレーサー [麻酔 (H) と覚醒 (I) CM 注入の終わりの後の 30 分 CM に 5 μ L の 1 μ L/分の速度で投与したマウスと counterstained卵白アルブミン AF647 共役 (OA、45kDa; アプライドで 2%) とデキストラン FITC 共役 (デックス、3kDa; アプライドで 2%) の混合物の量。尺度バー、B、C、F、G の 5 mmD、H、i. Cb、小脳; 500 μ m 2 mmCM、槽;Ctx、皮質;や OB の嗅球。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々 はチステルナ マグナ カニュレーション (CMc)、CSF のコンパートメントに標識分子を配布する簡単な方法を提供するための詳細な手順を説明するプロトコルを提案しました。CMc では、髄液循環動態、体内と体外では、異なる画像モダリティや組織を使用しての両方の後続の可視化ことができます。
CMc 技術の主な利点の 1 つは、開頭して脳を公開することがなくくも膜下腔への直接アクセスにあります。頭蓋のウィンドウまたは針の先端と脳実質の浸透を要求しない、CMc により CSF のコンパートメントに分子の配信と glymphatic システムの評価の短い障害の低侵襲頭蓋内の圧力 (ICP)。
特に、CM への注入は脳脊髄液は、脳室系にある脈絡のプレキシの主な情報源の下流 (横、3 番目と 4 番目の脳室)。側脳室、心室孔 (モンロー孔) 経由で第三脳室に脳脊髄液の流れと脳幹や脊髄 (3 の見直しに中脳水道 (シルビウス水道橋) 経由で 3-4 脳室から).CSF によって中央の開口部 (またはマジャンディ孔) を流れる CM 経由でくも膜下腔に達すると、CMc の注射が心室システム全体を迂回します。しかし、心室へのトレーサーの直接注入心室を通じて CSF/ISF ダイナミクスの一部のモデルに問題があるかもしれませんが、頭蓋骨 windows でのアプリケーションのバリの穴の掘削など侵襲的な外科的処置が必要です。心室の注射には、ICP13実質的に中断されます。同様に、私たちの手でくも膜下腔13,14へトレーサーを注入し圧力は、paravascular スペースに沿って CSF トレーサーのフラックスを廃止します。対照的に、CMc は、硬膜の穿刺を伴いますにもかかわらず ICP はのみ一過性の摂動、迅速に復元された2。
CMc を用いた急性 CMc 後麻酔下の動物だけでなく、目がさめている動物、カニューレ注入時に 24 時間の回復期間を観察 glymphatic 活動が測定できます。急性の CMc は、2 光子イメージング、約 200 μ m1,2の深さに皮質内の glymphatic 活動について詳細な情報を提供するとの組み合わせに適しています。重要なは、急性の CMc も CSF トレーサー注入15,の開始前に取得した個々 のベースライン イメージを基準でのトレーサー分布の動的の続く公平の MRI 研究をサポートするメリットを提供します。16,17.、ホウケイ酸キャピラリー (約 1 cm の長さ、約 20 μ m の先端径) PE 管に接続されている MRI は、CMc の使用歯科針置き換える必要があります。
急性カニュレーションと対照をなして慢性 CMc で目を覚ましと同様、自然な睡眠中や麻酔下で動物の CSF トレーサー注入法を実行する実験者は、動物を自由に移動ができます。これは重要な要因で glymphatic 活動は高い状態に依存します。実質にトレーサー流入が多く麻酔を注入した動物の大きいまたは目がさめている状態1に注入された動物より眠りに就く。さらに、慢性的な注入カニューレを持つ動物で受信できます CSF トレーサー ホーム ケージ、交絡要因のストレスと glymphatic 活動における覚醒の影響を最小限に抑える。ケタミン ・ キシラジンの混合物、麻酔下で慢性的な注射用 (100 mg/kg; 10 mg/kg、それぞれ) をお勧めします。1.5% 以上の濃度イソフルラン脳腫脹を誘発し、目がさめている状態1と比較して glymphatic 活動を高めない。CMc を注入した動物では、お互いのカニューレを損傷しないことを保証するために、CMc 注入後、動物を 1 つする必要があります注意が収容されています。また、CMc の慢性的な注入は回復手術なので生殖不能の条件の下で実行する必要があります、動物は永久歯の鎮痛薬を受け取る必要があります。
重要なは、CMc は、プロトコルに最小限の変更で、ラット、マウスの CSF トレーサーを提供する方法として使用できます。適切な麻酔用量を投与すべきし、ラットに注入される CSF トレーサーの最大音量は 30 μ L、心室、くも膜下のスペースのサイズの違いの 2 種から。
その手続きのシンプルさにもかかわらずいくつかの訓練と実践は CMc を正常に実行する実験者に必要です。CM は、種と個々 の動物の間にサイズが異なりますので、その構造の認識を練習することをお勧めします。エバンス ブルー (アプライドの 2%) を使用して手順を実践すると、正しい針の挿入を確認する実験者ことができます。時折、針を血管に隣接して挿入するとすぐが、正中線にできるだけ近い容器に、CM の正中線に直接位置してなります。針の先端の中心から外れて配置にもかかわらず、トレーサーを均等に分散、後の確認のため、このような場合は注意してください。重要なは、CM を覆う環椎後頭膜は機械的に厳しい、ベベル針の先端を挿入に十分な圧力を適用します。ただし、髄質または小脳に針の先端を突っ込むで適用される圧力が発生しないことが重要です。CM への針挿入を容易にするには、動物の頭は、膜を伸ばす体を基準にして 120 ° の角度で下方傾斜する必要があります。重要なは、この頭の屈曲によって呼吸を妨げないため用心を取られるべき。針の先端は、小脳を入力する必要があります、トレーサーの組織で保持されます、くも膜下腔全体に配布する失敗します。小脳損傷慢性深くすべての残と動物の行動の一般的な異常が発生することができます、髄質への損傷は頻繁に致命的です。この不測の事態の危険性を最小限に抑えるために面取り長さが短い針を使用できます。
CM にカニューレを挿入する硬膜をカバーする頸部で筋肉を移動する場合に、出血が発生します。出血を吸収するため綿棒を使用できますが、また、塩化第二鉄溶液を適用ことができます。塩化第二鉄は、18で止血効果、また cm 鉄塩化物も乾く頭蓋骨と硬膜の膜に針の正しい挿入の入手を助けるため切開部位の周り首の筋肉の硬直、トリガーカニューレの密着性の良い面を提示します。CMc、塩化第二鉄溶液 (10%) の 1 〜 2 滴を適用されます。(約 1 mL) に綿の綿棒し、首の筋肉、後頭稜を軽くたたきます。ただし、塩化第二鉄局所可能性がありますおそらく浸透膜を通して脳のホメオスタシスに未知の影響で、CSF。塩化第二鉄使用の懸念の問題ですが、切開部位を開かせる傷リトラクターを代わりに使用 1 つことができます。シアノアクリ レート系接着剤を適用した後傷リトラクターを慎重に除去は、切開サイトに不用意な添付ファイルを回避できます。
CMc は、CSF のコンパートメントに直接分子を提供する簡単かつ再現可能な手順です。CMc は低侵襲なので、glymphatic システムの可視化の優先方法は、落射蛍光と 2 光子顕微鏡や MRI など異なる画像モダリティと組み合わせることができます。したがって、CMc 研究流体力学、すなわち、CSF と ISF、また脳液クリアランスのための素晴らしいツールを表します。Glymphatic システムのマクロスコ ピックの取材のため CMc 分子脳全体を提供するために使用する可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NINDS/NIH (m. n.) ノボ ノルディスク財団と国立研究所の神経疾患や脳卒中、によって支えられました。A.L.R.X. と S.H R ポスドク親睦とルンドベック財団から博士課程奨学金の受取人は、それぞれ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , Under Revi (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE--the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
