Summary
여기는 시스테 마그나 cannulation (CMc), 뇌 척추 액체 (CSF)에 추적기, 기판 및 신호 분자를 제공 하는 최소 침 습 방법을 수행 하는 프로토콜에 설명 합니다. 다른 이미지 형식으로 결합, CMc glymphatic 시스템 및 CSF 역학 평가 뿐만 아니라 다양 한 화합물의 두뇌 전체 배달 수 있습니다.
Abstract
시스테 마그나 cannulation (CMc) 두개골 또는 뇌 실질에 요원 손상 없이 뇌 척추 액체 (CSF)에 직접 액세스할 수 있게 하는 간단한 절차 이다. 마 취 설치류, 목 근육의 무딘 해 부에 의해 dura mater의 노출 시스테 마그나 (CM)에 정 맥의 삽입을 허용합니다. 구성 좋은 비스듬한 바늘 또는 모 세관, 붕 정 주사기에 폴 리 에틸렌 (PE) 관을 통해 붙어 있다. 주사기 펌프를 사용 하 여, 분자 수 다음 주입 제어 속도에서 거미 막 밑 공간으로 연속은 CM에 직접. 거미 막 밑 공간에서 우리 중간 액체로 (ISF) 용 질 교환 발생 관통 arterioles, 주위 혈관 주위 공간으로 대류 흐름에 의해 CSF 플럭스를 추적할 수 있습니다. CMc 수행할 수 있습니다 수술 직후 급성 주사 또는 마 취 또는 깨어 나중 주입으로 만성 이식 설치류를 자유롭게 이동. Epifluorescence, 2-광자 현미경 검사 법, 그리고 삽입 된 분자의 physico-화학 특성에 따라 자기 공명 영상 (MRI), 뇌 실질에 추적 프로그램 배포의 정량을 수행할 수 있습니다. 따라서, 다양 한 이미징 기술 함께에서 CMc glymphatic 시스템 및 CSF 역동성 및 기능 평가 위한 강력한 도구를 제공합니다. 또한, CMc 신호 분자와 달리 혈액 뇌 장벽 (BBB)를 교차 하지 수 대사 기판의 빠르고, 뇌 전체 배달에 대 한 도관으로 활용할 수 있습니다.
Introduction
뇌 척추 액체 (CSF) 심 실 시스템 전체와는 해부학 정의 공간에서 연속체에 심, 두뇌 및 척수를 둘러싸는 거미 막 밑 공간에 따라 중앙 신경 시스템 (CNS)를 목욕. CSF의 주요 기능 중 하나는 대사와 뇌 실질에서 용액의 클리어런스에 대 한 경로 제공 것입니다. 클리어런스는 최근에 발견 된 glymphatic 시스템1, 뇌 주변 림프 시스템에 아날로그를 통해 촉진 된다. 여기, 우리가 설명 하 고 시스테 마그나 cannulation (CMc), CSF에 분자의 직접 배달 하는 최소 침 습 방법을 토론. CMc는 glymphatic 함수를 공부 하는 주요 방법입니다. CSF 역학 연구 및 혈관 주위 공간에 따라 뇌 실질에 비 혈액 뇌 장벽 (BBB) 침투성 분자의 빠르고, 뇌 전체 배달 또한, CMc의 적용할 수도 있습니다.
CMc는 시스테 마그나 (CM)의 CSF 가득한 공간으로 레이블이 지정 된 추적 분자 또는 마약을 제공 하는 CNS 통해 CSF 운동 역학의 생리 적 원리를 이용 한다. 분자는 CM. 분자 다음 CSF 대량 흐름 paravascular 공간1를 통해 뇌 실질에 의해 실행 된다 atlanto-후 두 경 막 막 덮 음에 이식 정 맥을 통해 주입 됩니다. CMc를 통해 주입 하는 추적 프로그램 또는 대비 에이전트 뇌 실질 입력 레이블된 분자의 강도 레벨을 측정 하 여 CSF 운동 및 glymphatic 유입의 평가 허용 CSF의 움직임을 다음과 같습니다. CMc 다른 이미징 기술로 epifluorescence, 2-광자 현미경 검사 법, 자기 공명 영상 (MRI)와 호환 됩니다. 또한,이 평가 될 수 있다 vivo에서 또는 비보 전을 수행. 중요 한 것은, CMc에서 마 취 또는 자연 수 면 중 뿐만 아니라 깨어 있는, 자유롭게 움직이는 동물에 glymphatic 시스템의 시각화 할 수 있습니다.
CMc 기술은 유체 역학, CSF에서의 다양 한 측면을 공부 하는 이용 될 수 있다 하지만 glymphatic 시스템을 공부 하는 데 특히 유용 것을 입증 했다. Glymphatic 활동 astrocytic 관 포장 endfeet의 막에 닿는 aquaporin-4 (AQP-4) 물 채널을 통해 periarterial 공간에서 CSF의 대류 흐름을 드라이브. 대류 흐름 CSF와 뇌 실질 내의 간 질 성 액체 (ISF)의 교환 수 있습니다. CSF/ISF 신진 대사 폐기물 및 용액을 포함 하는 perivenous 공간2,3를 통해 뇌 실질에서 다음 제거 됩니다. 궁극적으로, CSF/ISF 최근 설명된 듀 럴 림프 혈관4,5를 통해 주변에 도달합니다. Glymphatic 시스템은 아 밀 로이드 β2와 같은 유해한 폐기물 대사 산물의 정리를 위한 중요 한 보였다. 또한, glymphatic 클리어런스 장애인 당뇨병8 및9알 츠 하이 머 병 동물 모델에서 노화6, 외상 성 뇌 부상7, 후에 이다. 특히, glymphatic 활동은 종속, 또는 깨어1에 비해 마 취 중 상당히 높은 활동을 보여주는 상태. 실제로, 젊은 마 취 동물 가장 높은 glymphatic 활동을 전시 한다. 따라서, glymphatic 활동의 실험 부 량이 건강과 질병에서의 역할을 공부 하는 경우 중요 합니다.
여러 연구 결과 CSF 역동성 및 뇌 실질에 중간 액체로 (ISF)의 교환 언급. 그러나, 레이블이 분자 전달 되는 메서드는 오히려 침략, 트리거링 뇌 실질 손상 intracranial 압력 (ICP)에 변화 (참조10검토). 몇 가지 예는 intraventricular 또는 intraparenchymal 주사 craniotomy 또는 한 버의 시추를 포함 두개골에 구멍. 이러한 절차 변경 ICP, 따라서 glymphatic 함수2방해 하 보였다. 또한, 이러한 침략 방법 astrogliosis을 유발 하 고 뇌 실질 손상 된 지역 및 그 주변11,12AQP-4 immunoreactivity를 증가. 이다, AQP-4 glymphatic 시스템의 핵심 요소는, CMc는 그것의 연구에 대 한 선택의 방법입니다. 더 많은 침략 적 절차에 비해 CMc의 주요 이점은, ICP 변경 및 astrogliosis, 각각 피하는 그대로 두개골과 뇌 실질의 유지 이다. 따라서, 다른 이미징 도구와 함께에서 CMc glymphatic 시스템 뿐 아니라 역학을 공부 하는 가능성의 광범위 및 신경 질환의 동물 모델에서 뿐만 아니라 항상성, 유체 흐름의 메커니즘에 대 한 열립니다.
시스테 마그나 cannulation (CMc) 절차는 뇌 척추 액체 (CSF)에 간단 하 고 직접 액세스할 수 있습니다. 다른 분자 (예: 형광 추적기, MRI 조 영제) 주입 하 여는 실험 CSF 구획 내의 그들의 움직임을 추적 하 고 glymphatic 시스템의 활동을 평가할 수 있습니다. 다음 프로토콜 모두 급성 CMc를, 수술, 그리고 동물이 나중 주입에 대 한 수술에서 복구 하는 정 만성 이식 직후 주사에 대해 설명 합니다. 급성과 만성 이식의 가장 중요 한 차이점은 만성 이식 깨어 쥐에 glymphatic 활동의 연구에 대 한 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 절차와 동물 연구를 위한 유럽 지침 2010/63/EU에 따라 수행 했다 덴마크어 정부 환경 및 음식 (2015-15-0201-00535)에서 동물 실험 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. Cannulation 절차
- 정 준비
참고: 비 멸 균 장갑과 정을 만지지 마십시오.- 30 G 치과 바늘 바늘 홀더를 사용 하 여의 경사진된 금속 팁을 끊다.
- PE10의 30의 cm 길이에 경사진된 금속 팁 (약 0.3 cm)를 삽입 하 여는 정 준비 바늘 홀더를 사용 하 여 튜빙 (폴 리 에틸렌 튜브 0.024"OD 0.011" ID x) 실제 (126 m m NaCl, 2.5 m m KCl, 1.25 m m NaH2포4 가득 2mm MgSO4, 2mm CaCl2, 포도 당 10 m m, 26 m m NaHCO3; 산도 95% O2 , 5% CO2기름 때 7.4).
- 30g 바늘 (30 G x ½"0.3 x 12) 장착 1 mL 주사기를 사용 하 여 실제와는 정을 플러시.
-
외과 절차
참고: 만성 CM cannulation 수술에서 회복 하기 위해 동물을 수 있습니다. CM 주사는 정 맥 주입 다음 날 고, 중요 한 것은, 마 취 또는 깨어 동물에서 수행할 수 있습니다. 이 복구 수술 이므로, 절차 무 균 조건 하에서 실시 한다.- 마우스 (C57BL/6JRj, 남녀, 8 주) 무게와 마 취 제와 xylazine의 혼합물으로 anesthetize (100 mg/kg, 10mg/kg, 각각) 복 (i.p.) 주입을 통해. 필요한 경우 수술 중 마 취 제 (50 mg/kg)의 절반 복용량 마우스 redose. 또는, 만성 cannulation 대 1 L/min O2년경에 2.5-3 %isoflurane isoflurane 유도 챔버에 배치 하 여 마우스를 anesthetize. 이 경우에, 코 콘을 사용 하 여 수술에 걸쳐 1.5-2%에서 isoflurane 마 취를 유지.
- 발가락 핀치 중단, 반사 때 호흡은 느리고 꾸준한 난방 패드 stereotaxic 프레임에 동물을 배치 합니다.
- 안과 연 고를 적용 합니다. 필요할 때마다 수술 하는 동안 반복 합니다.
- 머리와 목의 마우스를 면도 하십시오, 모피, 제거 하 고 알콜 면봉 및 액체 (0.5%) 또는 요오드 용액 (2%)와 두 번 다음 먼저 노출 된 피부를 소독. 살 균 두 번 더 반복 합니다.
참고: 면도 후 파편과 머리를 제거 하는 수술 드 레이프를 변경 합니다. 다음 살 균 필드를 보호 하기 위해 동물을 드러 워 진. - 만성 cannulation에 0.5-1 ml lidocaine/bupivacaine 관리 (1 mg/ml 및 0.25 mg/ml, 각각) 피하 (사우스 캐롤라이나) 절 개 사이트에. 수술 후 진통에 대 한 buprenorphine (0.05 mg/kg, 사우스 캐롤라이나)를 관리 합니다.
- Stereotaxic 프레임에 마우스를 수정. 고정, 어느 intraural를 확인 한 후 또는 광대 아치에 의해, 틸트 머리 약간 (그림 1E) 본문에 120 °의 각도 형성 있도록.
- 목 근육-후 두도 머리 위에 바로 튀어나온 두개골의 일부를 찾을. Overlying 피부, 핀셋의 쌍을 사용 하 고는 중간에 따라 대략 1 cm의 피부는 아몬드 모양의 조각 잘라. 면봉을 사용 하거나 모든 결과 출혈을 제어 하는 스피어스 눈.
- 기준점으로 후 두도 머리를 사용 하 여, 떨어져 표면 결합 조직 노출 아래 목 근육을 당겨.
- 신중 하 게 절 개 사이트 이전 후부 축에서의 중간 아래로 집게를 실행 하 여는 중간에 근육을 구분 합니다. 각 손에 곡선된 집게의 쌍, 두개골의 아래쪽 중간에 팁을 가입 하 고 따로 근육을 당겨.
참고:이 위의 소 뇌 및 반투명 경 막 막 (그림 1B 및 1 C) 뒤에 아래, 모 수에 의해 제시 된 작은 역된 삼각형으로 표시 되는 CM를 표시 해야 합니다. - 수술 눈 창 또는 면 면봉을 사용 하 여 CM을 덮고 듀 럴 막 닦아.
-
CM에는 정 맥의 삽입
- 실제 채워진 주사기, 튜브의 끝부분에 부착 된 30g 바늘을 유지에서 정을 제거 합니다.
- 소 주 물 가득 100 µ L 주사기 주사기 펌프에 연결 된 30 G 바늘을 연결 합니다.
- 주사기 펌프의 원조로 공기 철수 여는 정에 약 1cm의 공기 방울이 삽입 합니다.
- 주사기 펌프를 사용 하는 정으로 원하는 CSF 추적 프로그램의 12 μ 철회.
- CSF 트레이 서 튜브 적용 바늘 지배적인 손에 개최 곡선된 핀셋 한 켤레와 함께 근처 가득 정을 파악. 반대 측의 귀 바에 비 지배적인 손의 가운데 손가락을 휴식을 정에 대 한 휴식으로는 나중에 사용에 대 한 꾸준한.
- 마우스 머리, CM, 경질을 통해 본 그 삼각형 측면으로 식별의 센터에 전달 기준으로 45 °의 각도 정을 삽입 합니다. 소 뇌 나 골 수의 어떤 침투를 하지 마십시오. 바늘만 1-2 m m, 즉 경사 전적으로 경질 아래 지점에의 깊이에 삽입 되었는지 확인 하십시오. 족집게는 정 들고 놓고 비 지배적인 손을 정 하자.
참고: 치과 바늘의 경사진된 끝 CM 취재 듀 럴 막 피어스 일부 세력의 응용 프로그램을 필요 합니다. - 필요한 경우 수술 눈 창 또는 면 면봉을 사용 하 여 침투 시 어떤 CSF 누출 떨어져 건조.
- 정을 둘러싼 경 막 막에 cyanoacrylate 접착제의 2-3 방울을 드롭. 접착제는 접착제를 즉시 치료 가속기의 한 방울을 추가 합니다. 두개골과 치과 시멘트 (약 0.5 m g), cyanoacrylate 접착제 (3-5 방울)의 혼합물으로 바늘을 커버. 후 즉시 접착제 가속기 치료를 한 방울을 적용 합니다.
- 만성 cannulation (대략 2-3 cm는 정 맥에 연결 된 떠나) 튜브를 잘라 고 튜브를 통해 CSF 누출을 방지 하 여 intracranial 압력 (ICP) 수준을 유지 하려면 수술 용접 함께 그것을 봉인.
- 만성 cannulation에 대 한 관리 carprofen (5 mg/kg, 사우스 캐롤라이나)
- 만성 cannulation 동물 완전히 마 취에서 회복 될 때까지 체온을 유지 하기 위해가 열 패드를 통해 그것을 유지 하는 것, 장에 마우스를 놓습니다.
참고: 동물 해야 될 단독에 보관 그들의 감 금 소는 정 그대로 남아 보장. 종이 타월 또는 다른 고체 기판에 마우스를 배치 하 여 코 침구의 명확한 인지 확인 합니다.
참고: 다음 날 때 동물 캐 뉼 러 삽입에 대 한 수행 수술에서 회복은, 그들은 주입 수 있습니다 CSF 추적기와 함께. 마 취 주입, 케 타 민/xylazine의 혼합물을 관리 (100 mg/kg, 10mg/kg, 각각; i.p.) 섹션 2에 설명 된 단계를 진행 하 고. 깨어 있는 동물에 주입, 섹션 3을 진행 합니다.
2. 마 취 동물에 급성 이식된 CM 정 통해 CSF 추적기의 주입
참고: 이전 섹션에서 8 단계 직후 마 취 동물에 급성 이식된 CM 정 통해 CSF 추적기의 주입을 위해 진행 CSF 추적 프로그램 삽입에 아래 설명 된 대로.
- 주사기 펌프를 사용 하 여 각각 5 µ L 또는 10 µ L의 총 볼륨의 결과 CM의 CSF 추적기 5 또는 10 분, 1 μ/분의 속도로 주입 시작. 주사의 끝에, CSF 추적 프로그램 그대로 정와 30 분 동안 뇌에 걸쳐 순환 수 있습니다.
- 30 분 후 정 (바늘 팁에서 약 4 cm 거리)에 연결 하는 튜브를 잘라내어 수술 용접을 사용 하 여 끝 인감.
- 깊은 마 취에서 잘린 여 동물을 안락사. 신속 하 게 뇌를 해 부 하 고 침수 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 인산 염 버퍼 식 염 수에 희석 하 여 조직 수정 (PBS, 0.01M, pH 7.4) 4 ° c.에 하룻밤 (o/n)
3. 깨어 있는 동물에서 만성 이식 CM 정 통해 CSF 추적기의 주입
- 주사기 펌프를 사용 하 여, 7 µ L 또는 원하는 CSF 추적 프로그램의 12 µ l 정 0.5 c m의 경사진된 치과 바늘 팁 PE10 배관의 대략 30 cm의 구성으로 철회 한다.
- 부드럽게 동물을 제 지는 정 맥에 연결 된 배관의 대략 1 cm의 잘라.
- 부드러운 접근 금지의 밑에 아직도 신속 하 게 이식 CM 정에 CSF 추적 프로그램으로 가득 정을 연결 합니다.
- 주사기 펌프를 사용 하 여 CM의 CSF 추적기 1 µ L/분 주사 7 µ L의 속도로 주입을 시작 하거나 12 µ L, CSF의 최종 볼륨을 달성 하기 위해 따라서 이식된 정에 남아 있는 실제 보상 5 µ L 또는 10 µ L의 트레이 서를 주입 합니다. 주사의 끝에, CSF 추적 프로그램 그대로 정와 30 분 동안 뇌에 걸쳐 순환 수 있습니다. 주입 및 순환 기간 동안 튜브 계속 연결 되어 확인 하십시오.
- CSF 추적 순환 시간의 끝에, 잘린, 동물 마 취 깊이 확보 하 여 안락사를 진행 합니다. 신속 하 게 뇌를 해 부 하 고 침수 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 인산 염 버퍼 식 염 수에 희석 하 여 조직 수정 (PBS, 0.01M, pH 7.4) 4 ° c.에 하룻밤 (o/n)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
쥐 또는 쥐 stereotaxic 프레임에서의 고정, 시 후 두도 머리 지역 목 근육은 퉁 명 스럽게 시스테 마그나 (CM)을 폭로 해 부. CM의 삼각형 구조는 소 뇌의 꼬리 부분과 모 (그림 1A-1 C) 사이 쉽게 인식 된다. 정은 부드럽게 atlanto 후 두 막 (그림 1D)를 관통 하 여 1-2 m m은 CM에 삽입 됩니다. 경질 막 힘든 구조 이며는 캐 뉼 러 삽입 본문에 관하여 120 °에 의해 동물 머리를 기울이기에 의해 향상 됩니다. 주입 펌프의 도움으로 다르게 분류 분자는 다음 제어 속도 (그림 1E)에서 시스테 마그나에 주입 됩니다. CSF 추적 순환 수 있도록 간격, 후 동물 안락사는. 뇌 신중 하 게 해 부하 고 PFA o/n 4 ° c.에 4%에 침수에 의해 고정 소 뇌의 거미 막 밑 cisterns, 후 각 전구 그리고 중간 대뇌 동맥 (MCAs) (그림 1 층에 따라 paravascular 공간 CM 주입 설치류에서 수확 하는 두뇌의 거시적인 등 보기 CSF 추적기의 분포를 표시 ). 두뇌의 복 부 부분에 거시적인 조회 (그림 1G) 윌리스의 원을 따라 CSF 추적 프로그램 배포를 보여줍니다. CM 주입 두뇌에 추가의 조직학 섹션 공개 뇌 실질 내 추적기의 paravascular 분포. 마우스 (또는 자연 수 면, 참조1중) 마 취 (그림 1 H) 주입 표시 놀라운 증가 주입 하는 쥐에 비해 뇌 실질에 추적 프로그램 배포에 깨어 있고 자유롭게 이동 하는 동안 그들의 가정 케이지 (그림에 1I).
그림 1: 시스테 마그나에 추적기의 주입. (A) 마우스 머리와 뇌 및 두개골 구조에 관하여 시스테 마그나 (CM)의 위치를 보여주는 두뇌의 도식 개요. (B) Photomicrograph 노출 cm 후 주변 목 근육 퉁 명 스럽게 해 부 및 양쪽에 밀어 되었습니다. 거꾸로 삼각형 구조 CM (파선)와 주변 구조, 즉 후 두도 머리, 소 뇌, 그리고 수 질에 관하여 그것의 위치를 보여주는 B (검은 사각형)에 묘사 된 지역 (C) 높은 확대. (D) Photomicrography CM. (E) 계획의 마우스 고정 머리의 측면 보기에 삽입 하는 정 맥의 시체에 관하여 120 °의 각도에서 약간 기울어져. 점선된 사각형의 인세트 구분 영역 표시 마우스 뇌의 parasagittal 보기 parasagittal 보기 구성표의 구성표 CM에 삽입 정 e.에 설명 된 대로 주사기 주입 펌프에 결합 되는 벌금 30 G 바늘에 연결 된 튜브를 통해 CM에 CSF 추적기 또는 대조 대리인을 제공 하는 데 사용 됩니다. 등 (F) 와 복 부 (G) 측면에서 본 형광 추적기와 CM 주입 후 30 분에 전체 마우스 뇌의 대표 이미지. (H, I,) CSF 추적기 마 취 (H) 및 깨어 (I), CM 주입 후 30 분에서 CM으로 5 µ L의 1 µ L/분의 속도로 주입 하는 쥐의 DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, PBS에서 1 µ g/mL)와 함께 대표적인 코로나 뇌 섹션 counterstained 볼륨 ovalbumin AF647 공액 (OA, 45kDa, 실제의 2%)와 dextran FITC 공액 (덱 스, 3kDa, 실제의 2%)의 혼합물의. 스케일 바, 5 m m B, C, F, G; 2 m m D 및 H, I. Cb, 소 뇌; 500 µ m CM, 시스테 마그나; Ctx, 피 질; 그리고 오늘, 후 각 전구입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 시스테 마그나 cannulation (CMc), CSF 구획에 레이블이 분자를 제공 하는 간단한 방법을 제공 합니다에 대 한 자세한 절차를 설명 하는 프로토콜을 제시 했습니다. CMc는 CSF 역동성, vivo에서 그리고 vivo, 전 다른 이미징 형식 또는 조직학을 사용 하 여 다음 시각화 수 있습니다.
CMc 기술의 주요 장점 중 하나는 craniotomy를 뇌를 노출 하지 않고도 거미 막 밑 공간에 직접 액세스에 놓여 있습니다. 으로 두개골 창 또는 바늘 팁 뇌 실질의 침투를 요구 하지 않는, CMc 허용 CSF 구획에 분자의 배달 및 glymphatic 시스템의 평가 간단한 소요의 최소한 침략 적 절차에 의해 intracranial 압력 (ICP)입니다.
특히, CM에 주입은 CSF, 심 실 시스템에 있는 맥락 막 plexi의 주요 근원의 다운스트림 (측면, 3, 4 심). 측면 심, intraventricular foramina 걸어가면 (구멍)을 통해 제 3 뇌 실에 CSF 흐름 및 대뇌 수도교 (Sylvius의 수도교) 뇌 줄기, 척수 (3에에서 검토를 통해 3 4 심 ). CSF 중간 조리개 (Magendie의 구멍)를 통해 흐르는 CM 통해 거미 막 밑 공간을 도달 하 고 따라서 CMc 주사 전체 심 실 시스템을 우회. 그러나,이 심 통해 CSF/ISF 역학의 일부 모델에서 문제가 될 수 있습니다, 직접 주입 추적기 심 필요 두개골 창과의 응용 프로그램에 버 구멍의 드릴링 등 침략 적 수술 과정 심 실 주사는 실질적으로 ICP13중단. 마찬가지로, 우리 손에 거미 막 밑 공간13,14 에 추적기의 압력 주입 paravascular 공간에 따라 CSF 추적기의 플럭스 말살. 대조적으로, 비록 CMc 수반 듀 럴 막의 펑크, ICP만 뚜렷이 교란 이며 신속 하 게 복원 된2.
CMc를 사용 하 여, glymphatic 활동 측정할 수 있습니다 급성 CMc, 후 마 취 동물에 뿐만 아니라 깨어 있는 동물, 정 맥 주입 시 24 시간 복구 기간을 관찰. 급성 CMc는 2-광자 이미징, 약 200 µ m1,2의 깊이 피 질 내에서 glymphatic 활동에 대 한 자세한 정보를 제공 된 조합에 대 한 적합 합니다. 중요 한 것은, 급성 CMc 또한 추적 프로그램 배포 CSF 추적 프로그램 주입15, 의 개시 전에 인수는 개별 기준 이미지에 상대적인 동적으로 따라는 편견된 MRI 연구 지원의 장점을 극합니다 16 , 17. MRI, 치과 바늘 CMc에 사용 되는 붕 규 산 모 세관 (약 1 ㎝ 길이, 약 20 µ m의 팁 직경) PE 튜브에 부착 된에 의해 대체 되어야 한다.
급성 cannulation 달리 만성 CMc 동물을 자유롭게 이동 하는 자연 수 면 중 또는 마 취, 동물에서 CSF 추적 프로그램 삽입을 수행 하 고 있는 깨어 있는, 실험을 수 있습니다. 이것은 중요 한 요소 때문에 glymphatic 활동은 높은 상태에 따라 다릅니다; 실질을 추적 프로그램 유입은 훨씬 큰 동물을 마 취 주입 했다 또는 깨어 있는 상태1에 주입 된 동물에서 보다 자 고. 또한, 동물 만성 이식된 정을 받을 수 있습니다 CSF 추적 새 장에 그들의 가정, 스트레스와 glymphatic 활동에 자극의 효과 인해 혼동 요인 최소화. 만성 주사 마 취, 마 취 제/xylazine의 혼합물에 대 한 (100 mg/kg, 10mg/kg, 각각) 것이 좋습니다. 1.5% 이상 농도에서 Isoflurane 뇌 붓기를 유도 하 고 깨어 있는 상태1에 비해 glymphatic 활동을 향상 되지 않습니다. 참고는 CMc 이식 후 동물 해야 단일 CMc 이식 동물 서로 정을 손상 하지 것입니다 보장 하기 위해 보관. 또한, CMc 만성 이식 복구 수술 이므로, 무 균 조건 하에서 수행 해야 하 고 동물 post-operational 진통제를 받아야 한다.
중요 한 것은, CMc는 마우스 뿐만 아니라 쥐, 프로토콜에 대 한 최소한의 수정으로 CSF 추적기를 제공 하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 적절 한 마 취약 복용량을 관리 해야 그리고 쥐에 주입 하는 CSF 추적의 최대 볼륨 30 µ L, 두 종족의 심 실 및 거미 막 밑 공간 크기 차이 때문.
절차적 단순에도 불구 하 고 일부 훈련과 연습은 CMc를 성공적으로 수행 하는 실험에 대 한 필요 합니다. CM 종와 개별 동물 크기에 따라 다릅니다, 그것은 구조의 인식 연습 좋습니다. 에반스 블루 (실제의 2%)를 사용 하 여 프로시저를 연습 정확한 바늘 삽입을 확인 하는 실험을 수 있습니다. 때때로, 선박 그러자 선박에 인접 한 바늘 삽입 해야 하지만 중간 선에 최대한 가까이 직접 CM의 중간에 위치 하 고 있을 것입니다. 이러한 경우, 바늘 팁의 중앙 위치에도 불구 하 고 고르게 추적기 배포 됩니다 이후 확인 지적 한다. 중요 한 것은, CM을 다루는 atlanto 후 두 막 기계적으로 힘든 이며 충분 한 압력 경사진된 바늘 팁 삽입에 적용 되어야 합니다. 그러나, 그것은 중요 한 적용 압력 바늘 팁 모 수 또는 소 뇌에 폭락에 되지는지 않습니다. CM에 바늘 삽입을 용이 하 동물의 머리 막 뻗어 시체를 기준으로 120 °의 각도에서 아래쪽으로 기울어져 되어야 한다. 중요 한 것은, 주의 취해야 한다 호흡 방해를 하지이 머리 굴곡에 의해. 바늘 팁 소 뇌를 입력 해야, 추적기는 조직에서 유지 될 것 이다 하 고 거미 막 밑 공간에 걸쳐 배포 하 실패. 반면 만성 cannulations의 소 뇌 손상 의식 및 동물의 행동에 일반적인 이상이 발생할 수 있습니다 손상 모 수 자주 치명적 이다. 이 사태의 위험을 최소화 하기 위해 작은 경사 길이 바늘을 사용할 수 있습니다.
CM에는 캐 뉼 러를 삽입 하는 경질 막 커버 목 지역에는 근육을 이동할 때 출혈이 발생할 수 있습니다. 면봉 출혈, 흡수 하는 데 사용 될 수 있지만 또는, 제 2 철 염화 물 해결책을 적용할 수 있습니다. 제 2 철 염화는 hemostatic 효과18고 또한 절 개 사이트는 CM. 제 2 철 염화 물 또한 두개골과 경 막 막 밖으로 건조에 바늘의 올바른 삽입을 얻을 수 있도록 따라서 목 근육의 뻣 제시는 정 맥의 접착을 위한 더 나은 표면. Cmc, 염화 제 2 철 용액 (10%)의 1-2 방울을 적용 (약 1 mL)에 목화 면봉와 목 근육과 후 두 크레스트 소량. 그러나, 국 소 제 2 철 염화 CSF, 두뇌 항상성에 알 수 없는 효과 막 통해 침투 가능성이 있습니다. 제 2 철 염화 물 사용의 관심사 인 경우에, 하나 대신 절 개 사이트에 뜨고 상처 견인 기를 사용할 수 있습니다. Cyanoacrylate 접착제를 적용 한 후 상처 브래킷으로의 주의 제거 절 개 사이트에 실수로 첨부 파일을 방지 합니다.
CMc 분자 CSF 구획에 직접 제공 하는 간단 하 고 재현성 절차 이다. CMc 최소한 침략 적 이기 때문에, glymphatic 시스템의 시각화에 대 한 선호 하는 방법 이며 다른 이미징 형식 epifluorescence 및 2 광자 현미경 또는 MRI와 같은 결합 될 수 있다. 따라서, CMc의 유체 역학, 즉 CSF와 ISF, 그리고 또한 뇌 유체 정리의 연구에 대 한 훌륭한 도구를 나타냅니다. Glymphatic 시스템의 거시적인 범위 때문에 CMc 분자 뇌 전체를 제공 하는 데 사용 될 수가 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 Novo Nordisk 기초 및 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기, NINDS/NIH (M.N.) 지원 되었다. A.L.R.X. 및 S.H R은 각각 박사 친교와 Lundbeck 재단에서 박사 학위 장학금 받는 사람.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , Under Revi (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE--the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
