שיטה זו נפתחים RNA מאפשר זיהוי המטרות RNA של RNA לונג ללא קידוד (lncRNA). על סמך הכלאה תוצרת בית, מעוצב תחושה אנטי DNA oligonucleotide הגששים הספציפי הזה lncRNA רקמות כראוי קבוע או שורת התאים, ביעילות מאפשר לכידת כל המטרות RNA של lncRNA.
זמן ללא קידוד RNA (lncRNA), אשר מהווים רצף נוקלאוטידים יותר מ-200 ללא מסגרת הקריאה מוגדר, שייך המשפחה של הרגולציה ללא קידוד RNA. למרות תפקודים ביולוגיים שלהם נשארים אינו מודע לקיומם, המספר של אלה lncRNAs עלה בהתמדה, עכשיו מעריכים כי בני אדם יכול להיות יותר מ-10,000 תעתיקים כזה. חלק מהם ידועים להיות מעורב חשוב מסלולים הרגולציה של ביטוי גנים אשר מתקיימים ברמת תעתיק, אלא גם על שלבים שונים של RNA co – ועם בגרות post-transcriptional. במקרים האחרונים, RNAs המיועדים מאת lncRNA חייב להיות מזוהה. זו הסיבה למה זה שימושי לפתח שיטה המאפשרת הזיהוי של RNAs הקשורים ישירות או בעקיפין עם lncRNA של עניין.
פרוטוקול זה, אשר היה בהשראת הפרוטוקולים שפורסמו בעבר ומאפשר את ניתוקה של lncRNA יחד עם רצפי כרומטין המשויכת שלה, הותאם להתיר את הבידוד של RNAs המשויך. אנחנו נקבע כי שני צעדים הם קריטיים עבור היעילות של פרוטוקול זה. הראשון הוא העיצוב של ספציפי תחושה אנטי DNA oligonucleotide הגששים מסוגלים hybridize כדי lncRNA עניין. למטרה זו, המבנה משני lncRNA היה שמנבאת ביואינפורמטיקה, תחושה אנטי oligonucleotide הגששים תוכננו עם משיכה חזקה עבור אזורים המציגים הסתברות נמוכה של זיווג בסיס פנימי. צעד קריטי השני של ההליך מסתמך על התנאים לשבועיים של רקמות או תאים בתרבית שיש לשמר את הרשת בין כל השותפים מולקולרית. יחד עם רצפי RNA תפוקה גבוהה, פרוטוקול זה נפתחים RNA יכול לספק את interactome RNA שלם של lncRNA עניין.
המטרה הכוללת של השיטה המתוארת כאן היא לזהות השותפים מולקולרית RNA RNA noncoding זמן (lncRNA). LncRNA תואמות רצפי נוקלאוטידים יותר מ-200 ללא מסגרת הקריאה מוגדר. חלק מהם הוכחו להיות מעורב ביטוי הכונה, לא רק ברמה תעתיק, אלא גם על שלבים שונים של RNA co – ועם בגרות post-transcriptional. במקרים האחרונים, מולקולרית של lncRNA השותפים RNAs כי הם זוהו. שיטה המאפשרת הזיהוי של RNAs הקשורים ישירות או בעקיפין עם lncRNA של עניין ואז יהיה חיוני לפתח.
שפורסמו קודם לכן בשיטות, כגון כרומטין בידוד על ידי RNA טיהור (בטוח)1,2 ו לכידת הכלאה ניתוח של RNA מטרות (תרשים)3,4, לאפשר גילוי תפוקה גבוהה RNA מכורך חלבונים, אתרי קישור גנומית של lncRNA ספציפי. ב שתי שיטות אלו, lncRNA עניין היה hybridized קודם כדי oligonucleotides משלים biotinylated, המתחם היה אז מבודדים באמצעות streptavidin חרוזים. ההבדל העיקרי בין שתי שיטות אלה קשורה העיצוב של הגששים כי המטרה lncRNAs. . אה, בהשראת דגים RNA, כללה תכנון בריכה של הגששים oligonucleotide DNA משלימים קצר כדי לפרוש לכל אורכה של lncRNA האסטרטגיה. לעומת זאת, בתרשים, המחברים הותאם assay מיפוי של RNase H ב- lncRNAs כדי לחקור אתרים לרשות הכלאה.
ההליך המוצע כאן עיצוב oligonucleotide biotinylated חוש אנטי DNA שימושים הגששים ביואינפורמטיקה מידול של מבנה שניוני lncRNA5 לבחירת רגשים עם משיכה חזקה עבור אזורים המציגים הסתברות נמוכה של פנימי בסיס זיווג. הליך זה יש את היתרון של להיות זול יותר מאשר אלה המבוססים על בריכות של ריצוף oligonucleotide הגששים2 וצורכת פחות זמן מאשר אלה בהתבסס על רגישות RNAse-H4.
מאחר גוף גדל והולך של ראיות הכונה post-transcriptional lncRNAs6, זה מאוד שימושי לפתח גישה המאפשרת לכידתו של RNAs כי הם היעדים lncRNA. יתר על כן, ניתנת לשימוש עבור מרבית היישומים, הגישה היה מותאם הן תאים בתרבית רקמה תמציות.
זמן noncoding RNAs (lncRNAs) על ידי מספר והמגוון שלהם לייצג תחום רחב של המחקר, רוב התפקידים שלהם הם עדיין להתגלות. רבים lncRNAs אלה יש לוקליזציה של הגרעין, ביניהם, כמה הם ערבו במשעולים הרגולציה של ביטוי גנים באמצעות מנגנונים תעתיק או posttranscriptional. אחד האתגרים הנוכחיים בתחום זה יש להבין את הרלוונטיות של האלה lncRNAs בעיבוד post-transcriptional של RNAs. למטרה זו, RNAs ממוקד על ידי lncRNAs צריך להיות מזוהה. בהשראת מחקרים קודמים התמקדו התאחדות lncRNAs עם כרומטין, פיתחנו תהליך המאפשר זיהוי RNAs המשויך lncRNA. ההצלחה של פרוטוקול זה, בשם RNA נפתחים, תלויה בעיקר שני צעדים חיוניים, כלומר העיצוב של חוש אנטי DNA oligonucleotide רגשים זה צריך במיוחד. ובלעדית hybridize עם lncRNA את עניין, התנאים של רקמה או קיבוע תא שיש כדי לשמור על השלמות של הרשת בין כל השותפים מולקולרית.
בעבר פרסם פרוטוקולים סיפק הליכים כדי לבודד את lncRNA יחד עם רצפי כרומטין המשויכת שלו (אה1,2,3,תרשים4). בפרוטוקולים אלה, הועסקו אסטרטגיות שונות לתכנון ש-oligonucleotide biotinylated חוש אנטי DNA רגשים. בהליך מעוצבנת, המחברים משמש מאגר של ה-DNA-biotinylated-oligonucleotide-הגששים המקיף לכל אורכה של lncRNA עניין לאחר ניכוי של הגששים שאינם ספציפיים של כל1,2. בפרוטוקול תרשים, המחברים זיהו את מחוזות lncRNA נגישים יותר של הכלאה ועוצב oligonucleotides לכידת המכוון על אזורים אלה. אזורים אלה נבחרו על סמך את רגישותם RNase-H. ואכן, באמצעות המאפיין של RNAse-H כדי hydrolyze RNAs באתרים של איגוד ה-RNA-DNA, oligonucleotides זה hybridize לאתרים נגישים ב lncRNA לייצר מכוניות היברידיות RNA-DNA ולהוביל lncRNA. המחשוף אנזימטי. המחברים נבחר שלושה אלה oligonucleotides לכידה של המועמד, המשמשים אותם קוקטייל3,4.
ההליך נהגנו עיצוב חוש אנטי DNA biotinylated oligonucleotide הגששים היתה קרובה בשימוש בפרוטוקול תרשים, אבל מחוזות lncRNA הרצוי הכלאה-זמין לא נבחרו על סמך את רגישותם RNAse-H, אבל לפי הסתברות נמוכה שלהם זיווג בסיס פנימי כפי שנקבע על ידי ביואינפורמטיקה מידול של מבנה שניוני lncRNA. זה בטח הבחין כי מבנים משניים שונים ניתן לחזות באמצעות אלגוריתמים שונים, הגששים להיבחר צריך להיות כאלה hybridize כדי רצפים זמינים של lncRNA בהמספר הגדול ביותר של מבנים משני חזה. אותן התוצאות התקבלו באמצעות קוקטייל של שלושה תוכנן, הגששים ספציפי או בדיקה אחת בנפרד. הנחיה זו השימוש של שני רגשים נפרד, הספציפיים, השיקול של תוצאות חיוביות כמו אלה משותפים אלה שני רגשים. לבסוף, ולכן מומלץ בתחילת הפיתוח של השיטה, לקבלת תוצאה מיטבית, כדי שניתן יהיה להעריך את ייחודה של התוצאות של המשיכה-למטה, לעצב 3 oligonucleotide אנטי-תחושה שונה רגשים ולאחר מכן להשוות השפעול היעילות שלהם, במיוחד מאחר יעילות המכשיר עשויה להשתנות על ידי תא lysate הכנה. למרות זאת, ההליך של עיצוב המכשיר המבוסס על ביואינפורמטיקה מידול של lncRNA משני מבנה השתמשנו נותרה פחות יקר זה מבוסס על בריכות של ריצוף oligonucleotide הגששים2, וזה היה פחות לארוך זמן רב יותר השיטה מבוסס על רגישות RNAse-H4.
פקד שלילי גם להתבצע באמצעות לכידת שלילי oligonucleotide גם חוש דנ א biotinylated oligonucleotide רגשים או מקושקשות הגששים oligonucleotide, או oligonucleotides נגד של RNA לא קשורים. בגלל הקיום של תעתיקים antisense טבעי lncRNAs, לפעמים ייתכן שימוש הגיוני oligonucleotide הגששים לקוי. ללא קשר החללית oligonucleotide שנבחר עבור הפקד שלילי, זה הכרחי כדי לבדוק אם הפיצוץ כי זה לא hybridize עם RNA ידועים וכדי לזכור כי oligonucleotide הזה יכול hybridize כדי lncRNA עדיין האו ם המבואר.
Lysates תא שימוש בניסויים משיכה אלה RNA, התקבלו 106 תאים7 10 בעת עבודה עם תאים בתרבית, מ 1 עד 10 מ ג כאשר עובדים עם רקמה. הכנת תא lysates צריך להיות מותאם על פי סוג הרקמה או תא בשימוש בשני שלבים העיקרי צריך להיות מותאם: כלומר, השלב cross-linking המאפשרת היווצרות קשרים הדדיים בין lncRNA את שותפיה מולקולרית, ו sonication שלב זה מפחית את צמיגות by גיזום כרומטין.
מטרת השלב cross-linking נועד להבטיח כי כל המטרות RNA להישאר סגור בפני lncRNA על ידי גרימת היווצרות של רשת בין כל השותפים מולקולרית. שלב הטיפול paraformaldehyde שיהוו קשרים הדדיים בין lncRNA את השותפים שלה מאפשר שהרשת תהיה רשת לסופרמרקטים. בפרוטוקול תרשים, הוצע אם על כל עובד עם lncRNA גרעינית, לבצע טיפול הראשון עם paraformaldehyde תא lysate, שנייה טיפול על שבר nucleic מבודד3,4. הבחנו כי צעד משלים זה ירד את היעילות של הגששים, כנראה על-ידי הפחתת הנגישות lncRNA בתאים. לכן, מידת ‘ רשתית ‘ מאת paraformaldehyde חייב להיות מותאם לוקח בחשבון את התא או סוג הרקמה בשימוש, הלוקליזציה של lncRNA את עניין, ואת היעילות של הגששים מעוצב.
בזמן lysing את התאים, כרומטין מופץ ב- lysate ומגביר צמיגות שלה; זה ואז יש צורך לגרוס את כרומטין מאת sonication להגדיל את הנזילות של הדגימות, ומכאן לקדם את הנגישות של oligonucleotide רגשים כדי lncRNA עניין. עם זאת, sonication גם לגרוס את RNAs חילוץ עם lncRNA עניין. אז חשוב למזער את הזמן sonication כך בזמן זה מפחית ביעילות את צמיגות lysate, שהיא גם מאפשרת שהקניית RNA קטעים באורך מורכבת בין 200-800 bp. שימו לב הפעם sonication תהיה מאוד תלוי הכמות והן את הסוג של רקמה או תאים בתרבית בשימוש.
לסיכום, ההליך המתואר כאן מאפשרת ב- 2-3 ימים לכידתו של RNA המטרות של lncRNA הרצוי. יחד עם RT-qPCR, שיטות אלה יאפשר מחפש של ויסות mRNA וארגון ספציפי על ידי lncRNA הרצויה כמו הגישה של המועמד. לגישה הגנום כולו, ניתן לנתח RNA נפתחים ניסויים על ידי RNA בתפוקה גבוהה-המאפשר שליפת כל RNAs המשויך lncRNA הרצוי רצף. לא משנה מה, אנליטי האסטרטגיה שנבחרה, ההליך נפתחים RNA צריך לספק ידע משמעותי חדש על RNA הרגולציה על-ידי lncRNAs.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על-ידי אוניברסיטת Aix-מרסיי ו CNRS, שמומן על ידי מענק של פייזר מעבדות.
Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
Proteinase K | Sigma | P2308 | |
RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |