Denna RNA pull-down-metod kan identifiera RNA målen i en lång icke-kodande RNA (lncRNA). Baserat på hybridisering av hemgjorda, utformade anti känsla DNA oligonukleotiden sonder specifika för denna lncRNA i ett lämpligt fast vävnad eller cellinje, tillåter det effektivt fångst av alla RNA mål av lncRNA.
Långa icke-kodande RNA (lncRNA), vilka sekvenser av mer än 200 nukleotider utan definierade läsning ram, tillhör den regulatoriska icke-kodande rnas familj. Även om deras biologiska funktioner förblir i stort sett okända, numrera av dessa lncRNAs har ökat stadigt och det uppskattas nu att människor kan ha mer än 10 000 sådana avskrifter. Några av dessa är kända för att vara inblandade i viktiga rättsliga vägar av genuttryck som äger rum på transkriptionell nivå, men också på olika steg av RNA co- och post-transcriptional mognad. I de senare fallen har RNAs som riktas av lncRNA identifieras. Det är anledningen till varför det är användbart att utveckla en metod som möjliggör identifiering av RNAs associerade direkt eller indirekt med ett lncRNA sevärdheter.
Detta protokoll, som inspirerades av tidigare publicerade protokoll så att isoleringen av ett lncRNA tillsammans med dess associerade kromatin-sekvenser, anpassades till tillåta isolering av associerade RNAs. Vi fast beslutna att två steg är avgörande för effektiviteten i detta protokoll. Först är utformningen av särskilda anti känsla DNA oligonukleotiden sonder kan hybridisera till lncRNA sevärdheter. I detta syfte lncRNA sekundära struktur förutspåddes av bioinformatik och anti känsla oligonukleotiden sonder utformades med en stark affinitet för regioner som visar en låg sannolikhet för inre bas ihopkoppling. Det andra avgörande steget i proceduren är beroende av fixativ villkoren av vävnad eller odlade celler som har att bevara nätverket mellan alla molekylär partner. Tillsammans med hög genomströmning RNA-sekvensering, kan detta RNA nedrullningsbara protokoll ge den hela RNA-interactome av ett lncRNA sevärdheter.
Det övergripande målet för den metod som beskrivs här är att identifiera RNA molekylär partners en lång kodande RNA (lncRNA). LncRNA motsvarar sekvenser av mer än 200 nukleotider utan definierade läsning ram. Några av dem har visat sig vara inblandade i uttrycket genreglering, inte bara på transkriptionell nivå, men också på olika steg av RNA co- och post-transcriptional mognad. I de senare fallen är molekylär partner av lncRNA RNAs som ska identifieras. En metod som möjliggör identifiering av RNAs associerade direkt eller indirekt med ett lncRNA av intresse skulle då vara viktigt att utveckla.
Tidigare publicerade metoder, såsom kromatin isolering av RNA rening (ChIRP)1,2 och fånga hybridisering analys av RNA mål (diagram)3,4, tillåter hög genomströmning upptäckten av RNA-bundna proteiner och genomisk bindningsställen för en specifik lncRNA. I dessa två metoder, lncRNA sevärdheter var först hybridiseras till biotinylerade kompletterande oligonukleotider, och anläggningen var då isolerat med streptividin pärlor. Den största skillnaden mellan dessa två tekniker är relaterad till utformningen av sonder som är avsedda för lncRNAs. ChIRP, strategin inspirerad av RNA fisk, bestod av att utforma en pool av korta kompletterande DNA oligonukleotiden sonder att kakla hela längden av lncRNA. Däremot i diagram anpassat författarna ett RNase H mappning test på lncRNAs sond platser tillgängliga för hybridisering.
Det förfarande som föreslås här att design den anti känsla DNA biotinylerade oligonukleotiden sonder använder bioinformatik modellering av lncRNA sekundärt strukturera5 Markera sonder med en stark affinitet för regioner som visar en låg sannolikhet för interna basera ihopkoppling. Detta förfarande har fördelen att vara billigare än de som baseras på pooler av plattsättning oligonukleotiden sonder2 och mindre tidskrävande än de baserat på RNAse-H känslighet4.
Eftersom det finns en växande mängd bevis för post-transcriptional genreglering av lncRNAs6, är det mycket användbart för att utveckla en strategi som gör det möjligt för fångst av RNAs som är mål för ett lncRNA. Dessutom för att vara användbara för de flesta tillämpningar, var metoden optimerad både i odlade celler och vävnad extrakt.
Långa icke-kodande RNAs (lncRNAs) av deras antal och mångfald representerar ett stort fält av forskning och de flesta av sina roller är fortfarande att bli upptäckta. Många av dessa lncRNAs har en cellkärnelokalisering och bland dem, några är inblandade i rättsliga vägar av genuttryck med transkriptionell eller postttransskriptionell mekanismer. En av de nuvarande utmaningarna på detta område är att förstå betydelsen av dessa lncRNAs post-transcriptional bearbetning av RNAs. För detta ändamål måste RNAs riktade av lncRNAs identifieras. Inspirerad av tidigare studier fokuserat på sambandet mellan lncRNAs och kromatin, utvecklade vi ett förfarande som möjliggör identifiering av RNAs associerade med ett lncRNA. Framgången av detta protokoll, heter RNA pull-down, beror främst på två avgörande steg, nämligen utformningen av anti känsla DNA oligonukleotiden sonder som har till specifikt och uteslutande hybridisera med lncRNA sevärdheter och villkoren för vävnad eller cell fixering som måste bevara integriteten i nätverket mellan alla molekylär partner.
Tidigare publicerade protokoll anges förfaranden för att isolera ett lncRNA tillsammans med dess associerade kromatin-sekvenser (ChIRP1,2, diagram3,4). I dessa protokoll användes olika strategier till design den anti känsla DNA biotinylerade oligonukleotiden sonder. I förfarandet för ChIRP använde författarna en pool av DNA biotinylerade oligonukleotiden sonder som omfattar hela längden av lncRNA sevärdheter efter uteslutning av alla överflödiga och icke-specifika sonder1,2. I diagram protokollet, författarna identifierat de regioner i lncRNA som är mer tillgängliga för hybridisering och utformade fånga oligonukleotider som riktar dessa regioner. Dessa regioner har valts ut på grundval av deras RNase-H känslighet. Faktiskt använda egenskapen för RNAse-H för att hydrolysera RNAs på platser av RNA-DNA-bindning, de oligonukleotider som hybridiserar till tillgängliga platser i lncRNA producera RNA-DNA hybrider och leda till enzymatisk klyvning av lncRNA. Författarna valde tre av dessa kandidat fånga oligonukleotider och använde dem i en cocktail3,4.
Förfaranden som vi brukade design anti känsla DNA biotinylerade oligonukleotiden sonderna var nära som används i diagrammet protokollet, men de önskade lncRNA hybridisering-tillgängliga regionerna inte valdes på grundval av deras RNAse-H känslighet, men enligt deras låg sannolikhet att inre bas parning som bestäms av bioinformatik modellering av lncRNA sekundärt strukturera. Det måste märkas att olika sekundära strukturer kommer förutsägas med hjälp av olika algoritmer och sonder väljas bör vara de som hybridiserar till tillgängliga sekvenser av lncRNA största antal sekundära strukturer förutspådde. Samma resultat erhölls med antingen en cocktail av tre utformad, särskilda sonder eller en enda sond individuellt. Detta föranledde användningen av två separata, särskilda sonder och beaktande av positiva resultat som de som är gemensamma för dessa två sonder. Slutligen, det rekommenderas därför i början av utvecklingen av metoden för ett optimalt resultat och för att kunna bedöma resultaten av pull-down, att utforma 3 olika anti känsla oligonukleotiden specificitet sonder och sedan jämför experimentellt deras effektivitet, särskilt eftersom sonden effektivitet får ändras av cell lysate beredning. Dock tillvägagångssättet av sonden design baserad på bioinformatik modellering av lncRNA sekundära struktur vi använde förblev billigare än som baserat på pooler av plattsättning oligonukleotiden sonder2, och detta var mindre tidskrävande än metoden baserat på RNAse-H känslighet4.
En negativ kontroll bör också utföras med som negativ fånga oligonukleotiden antingen den känsla DNA biotinylerade oligonukleotiden sonder eller äggröra oligonukleotiden sonder eller oligonukleotider riktade mot en icke-närstående RNA. På grund av förekomsten av naturliga antisense avskrifter lncRNAs, kan användning av känsla oligonukleotiden sonder ibland vara otillräcklig. Oavsett oligonukleotiden sonden valts för den negativa kontrollen, är det nödvändigt att kontrollera av blast som det inte hybridiserar med en känd RNA och Tänk på att denna oligonukleotid kan hybridisera till ett fortfarande un-kommenterad lncRNA.
De cell-lysates som används i dessa RNA nedrullningsbara experiment erhölls från 106 107 celler när du arbetar med odlade celler, och från 1 till 10 mg när du arbetar med vävnad. Beredning av cell lysates måste anpassas beroende på vävnads- eller typ som används med två steg som behöver optimeras: nämligen det tvärbindande steg som tillåter bildandet av kovalenta bindningar mellan lncRNA och dess molekylära partner, och den ultraljudsbehandling steg som minskar viskositeten genom fragmentering kromatin.
Syftet med det tvärbindande steget är att säkerställa att alla RNA mål förblir stängd för lncRNA genom att inducera bildandet av ett nätverk mellan alla molekylär partner. En PARAFORMALDEHYD behandling steg som kommer att bilda kovalenta bindningar mellan lncRNA och dess partner kan nätverket vara nätstruktur. I diagram protokollet, det föreslogs om arbetar med kärnkraft lncRNA, för att utföra en första behandling med PARAFORMALDEHYD på hela cell lysate och en andra behandling på isolerade nucleic bråkdel3,4. Vi konstaterade att detta kompletterande steg minskat effektiviteten i sonderna, förmodligen genom att minska lncRNA tillgängligheten i cellerna. Därför graden av gårdslokaliserade av PARAFORMALDEHYD måste anpassas med hänsyn till cellen eller vävnadstyp används, lokalisering av lncRNA sevärdheter och effektiviteten av de designade sonderna.
Samtidigt lyseringslösning cellerna, kromatinet släpps i den lysate och ökar dess viskositet; Det är då nödvändigt att strimla kromatinet av ultraljudsbehandling att öka rörligheten på proverna och därmed underlätta tillgängligheten till oligonukleotiden sonder till lncRNA sevärdheter. Ultraljudsbehandling kommer dock också strimla RNASEN extraheras med lncRNA sevärdheter. Det är då viktigt att minimera den ultraljudsbehandling tid på ett sådant sätt att det minskar effektivt viskositeten hos den lysate, det tillåter också obtainmenten av RNA fragment med en längd består mellan 200-800 bp. Observera att ultraljudsbehandling tiden kommer att vara mycket beroende av både kvantitet och typ av vävnad eller odlade celler används.
Sammanfattningsvis kan det förfarande som beskrivs här i 2-3 dagar tillfångatagandet av RNA målen i en önskad lncRNA. Tillsammans med RT-qPCR, tillåter dessa metoder söker en specifik association och reglering av en mRNA av den önskade lncRNA som en kandidat. En genome-wide strategi, kan RNA nedrullningsbara experiment analyseras med hög genomströmning RNA-sekvensering tillåta hämtning av alla RNAs associeras med de önskade lncRNA. Oavsett analytiska strategin, bör RNA nedrullningsbara förfarandet ge nya betydande kunskaper om RNA förordning av lncRNAs.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Aix-Marseille universitet och CNRS och finansieras av ett bidrag från Pfizer laboratorier.
Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
Proteinase K | Sigma | P2308 | |
RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |