Här presenterar vi en experimentell metod för att testa multicopy plasmider roll i utvecklingen av antibiotikaresistens.
MultiCopy plasmider förekommer mycket rikligt i prokaryoter men deras roll i bakteriell utveckling fortfarande dåligt förstådd. Vi visade nyligen att ökningen gen kopia antalet per cell som tillhandahålls av multicopy plasmider kan påskynda utvecklingen av plasmid-kodade gener. I detta arbete presenterar vi en experimentell system för att testa multicopy plasmider förmåga att främja gen evolution. Med enkla molekylärbiologiska metoder, konstruerat vi modellsystem där en antibiotikaresistensgen kan infogas i Escherichia coli MG1655, antingen i kromosomen eller på en multicopy plasmid. Vi använder en experimentell evolution strategi för att propagera de olika stammarna under ökande koncentrationer av antibiotika och vi mäter överlevnad av bakteriell populationer över tid. Valet av antibiotika molekylen och motstånd genen är så att genen kan endast ge motstånd genom förvärvet av mutationer. Detta ”evolutionära rescue” tillvägagångssätt ger en enkel metod för att testa multicopy plasmider potential att främja förvärv av antibiotikaresistens. I nästa steg av experimentella systemet kännetecknas molekylära baserna av antibiotikaresistens. För att identifiera mutationer ansvarar för förvärvet av antibiotikaresistens använder vi DNA djupsekvensering av produktproverna hela befolkningar och kloner. Slutligen, för att bekräfta rollen av mutationer i genen under studien, vi rekonstruera dem i föräldrarnas bakgrund och testa motstånd fenotypen av de resulterande stammarna.
Antibiotikaresistenta bakterier är ett stort hälsoproblem problem1. På en grundläggande nivå är spridningen av antibiotikaresistenta patogena bakterier ett enkelt exempel på evolution genom naturligt urval2,3. Enkelt uttryckt, genererar användning av antibiotika urval för resistenta stammar. Ett centralt problem i evolutionsbiologi, därför att förstå de faktorer som påverkar populationernas förmåga till bakteriell utvecklas resistens mot antibiotika. Urval experiment har visat sig vara ett mycket kraftfullt verktyg för att undersöka evolutionär biologi av bakterier, och fältet har producerat otroliga insikter i ett brett utbud av evolutionära problem4,5,6. I experimentell evolution, bakteriell populationer initieras från en enda föräldrarnas stam är seriellt anpassade villkor definierade och väl kontrollerad. Några av de mutationer som inträffar under tillväxten av dessa kulturer öka bakteriell fitness, och dessa sprids genom kulturer genom naturligt urval. Under experimentet bevaras prover av befolkningarna regelbundet cryogenically för att skapa en icke-utvecklas frozen fossilfynd. Ett stort antal metoder kan användas för att karaktärisera utvecklas bakteriella populationer, men de två vanligaste metoderna är fitness-analyser, som mäter förmågan av utvecklade bakterier att konkurrera mot deras avlägsna förfäder, och hela Genomsekvensering, som är används för att identifiera de genetiska förändringarna att driva anpassning. Efter pionjärarbete av Richard Lenski och kollegor7,8, standardmetoden i experimentell utveckling har varit att utmana ett relativt litet antal replikera populationer (vanligtvis < 10) med anpassning till en ny miljöutmaningen, såsom nya kolkällor, temperatur eller en underprissättning phage.
Infektioner orsakade av antibiotikaresistenta bakterier blir ett stort problem när motståndet är tillräckligt hög för att det inte är möjligt att öka antibiotiska koncentrationerna till dödliga nivåer i patientens vävnad. Kliniker är därför intresserade vad gör att bakterier att utvecklas resistens mot höga doser av antibiotika som överstiger detta tröskelvärde antibiotikakoncentrationen, kliniska brytpunkten. Hur man studera detta experimentellt? Om ett litet antal bakteriella populationer utmanas med en hög dos av antibiotikum, som en Lenski-stil experiment, då det mest sannolika utfallet är att antibiotika kommer att driva alla befolkningar till utrotning. Samtidigt, om dosen av antibiotika som används är låg, under den minimal hämmande koncentrationen (MIC) av föräldrarnas stam, är det osannolikt att de bakteriella populationerna kommer att utvecklas kliniskt relevanta nivåer av motstånd, särskilt om motstånd bär en stor kostnad. En kompromiss mellan dessa två scenarier är att använda en ”evolutionära rescue” experiment9,10,11. I detta synsätt, ett mycket stort antal kulturer (normalt > 40) utmanas med doser av antibiotika som ökar över tid, vanligtvis genom att fördubbla antibiotikakoncentrationen varje dag12. Kännetecknande för detta experiment är att någon befolkning som inte utvecklas ökat motstånd kommer att drivas till utrotning. De flesta populationer som utmanas på detta sätt kommer vara drivande utdöd, men en liten minoritet kommer att bestå av utvecklas höga nivåer av motstånd. I detta papper visar vi hur detta experimentell design kan användas för att undersöka multicopy plasmid bidrag till utvecklingen av resistens.
Bakterier förvärva resistens mot antibiotika genom två huvudsakliga rutter, kromosomala mutationer och förvärvet av mobila genetiska element, oftast plasmider13. Plasmider spela en nyckelroll i utvecklingen av antibiotikaresistens eftersom de kan överföra antibiotikaresistensgener mellan bakterier genom konjugation14,15. Plasmider kan delas in i två grupper beroende på deras storlek och biologi: ”små”, med hög kopienumret per bakteriecell och ”stora”, med låg Kopiera nummer16,17. Rollen av stora plasmider i utvecklingen av antibiotikaresistens har dokumenterats i stor utsträckning eftersom de innehåller konjugering plasmider, vilka är viktiga drivkrafter för spridning av resistens och multi motstånd bland bakterier15. Liten multicopy plasmider är också mycket vanliga i bakterier17,18, och de kod ofta för antibiotikaresistens gener19. Rollen av små multicopy plasmider i utvecklingen av antibiotikaresistens har dock studerats i mindre utsträckning.
I ett senare arbete föreslog vi att multicopy plasmider kan påskynda utvecklingen av de gener som de bär genom att öka gene mutation priser på grund av högre gen kopia antalet per cell12. Med en experimentell modell med E. coli -stam MG1655 och β-laktamas gen blaTEM-1 visades det att multicopy plasmider påskyndas av utseende av TEM-1 mutationer ger resistens mot den tredje generationen cefalosporin ceftazidime. Dessa resultat visade att multicopy plasmider kan spela en viktig roll i utvecklingen av antibiotikaresistens.
Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av den metod vi har utvecklat att undersöka multicopy plasmidmedierad utvecklingen av antibiotikaresistens. Denna metod har tre olika steg: första, införande av genen under studien antingen i en multicopy plasmid eller kromosomen av värd bakterier. För det andra, användning av experimentell evolution (evolutionära räddning) att bedöma de olika stammarna har potential att anpassa sig till selektionstryck. Och tredje, att fastställa den molekylära basen underliggande plasmidmedierad evolution med DNA-sekvensering och rekonstruera de misstänkta mutationerna individuellt i föräldrarnas genotypen.
Slutligen, även om det protokoll som beskrivs här har utformats för att undersöka utvecklingen av antibiotikaresistens, kan man hävda att denna metod kan vara allmänt användbara att analysera utvecklingen av innovationer som förvärvats av mutationer i någon multicopy plasmid-kodade genen.
Vi presenterar ett nytt protokoll som kombinerar molekylärbiologi, experimentell evolution och djupa DNA-sekvensering för att undersöka betydelsen av multicopy plasmider i utvecklingen av antibiotikaresistenta bakterier. Även om detta protokoll kombinerar tekniker från olika områden, alla de metoder som krävs för att utveckla det enkel och kan utföras i en vanlig mikrobiologi laboratorium. De viktigaste stegen i protokollet är förmodligen byggandet av modell system stammar och återuppbyggnaden av de mutatione…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Instituto de Salud Carlos III (planera Estatal de jag + D + jag 2013-2016): beviljar CP15-00012, PI16-00860 och CIBER (CB06/02/0053), medfinansieras av Europeiska regionala utvecklingsfonden ” ett sätt att uppnå Europa ” (ERUF). JAE stöds av programmet Atracción de talento av regeringen av regionen Madrid (2016-T1/BIO-1105) och jag + D Excelencia av den spanska Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM stöds av en Miguel Servet stipendium från Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) medfinansieras av den Europeiskasocialfonden ”investera i din framtid” (ESF) och Europeiska regionala utvecklingsfonden.
Thermocycler | BioRad | C1000 | |
Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
Incubator | Memmert | UF1060 | |
Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
96-well plates | Falcon | 351172 | |
LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |