Summary

Analyse le rôle des plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique

Published: May 02, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici une méthode expérimentale pour évaluer le rôle des plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique.

Abstract

Multicopie plasmides sont extrêmement abondants chez les procaryotes, mais leur rôle dans l’évolution bactérienne reste mal comprise. Récemment, nous avons montré que l’augmentation en nombre de copies du gène par cellule fournie par plasmides multi-copies pourrait accélérer l’évolution des gènes codés plasmide. Dans ce travail, nous présentons un système expérimental pour tester la capacité de Multicopie plasmides à promouvoir l’évolution des gènes. À l’aide de méthodes simples de biologie moléculaire, nous avons construit un modèle de système où un gène de résistance aux antibiotiques peut être inséré dans Escherichia coli MG1655, dans le chromosome ou sur un plasmide Multicopie. Nous utilisons une approche de l’évolution expérimentale pour propager les différentes souches au titre de l’augmentation des concentrations d’antibiotiques et nous mesurons la survie des populations bactériennes au fil du temps. Le choix de la molécule antibiotique et le gène de résistance est donc que le gène peut seulement conférer résistance grâce à l’acquisition de mutations. Cette approche « évolutionniste al Rescate » fournit une méthode simple pour tester le potentiel des plasmides multi-copies pour favoriser l’acquisition de la résistance aux antibiotique. Dans l’étape suivante du système expérimental, les bases moléculaires de résistance aux antibiotique sont caractérisés. Pour identifier les mutations responsables de l’acquisition de la résistance aux antibiotique nous utilisons profond séquençage de l’ADN des échantillons obtenus à partir de clones et de populations entières. Enfin, pour confirmer le rôle des mutations du gène à l’étude, les reconstituer en arrière-plan parental et tester le phénotype de résistance des souches qui en résulte.

Introduction

La résistance aux antibiotique chez les bactéries est un problème majeur de santé1. À un niveau fondamental, la propagation de la résistance aux antibiotique chez les bactéries pathogènes est un exemple simple de l’évolution par sélection naturelle2,3. Autrement dit, l’utilisation d’antibiotiques génère de sélection de souches résistantes. Un problème majeur en biologie de l’évolution, est donc de comprendre les facteurs qui influencent la capacité des populations bactériennes à évoluer de la résistance aux antibiotiques. Expériences de sélection ont émergé comme un outil très puissant pour étudier la biologie de l’évolution des bactéries, et ce domaine a produit un aperçu incroyable un large éventail de problèmes évolutifs4,5,6. En évolution expérimentale, les populations bactériennes effectuées à partir d’une seule souche parentale sont en série repiquées dans des conditions définies et étroitement contrôlées. Certaines mutations qui se produisent au cours de la croissance de ces cultures augmentent bactérienne remise en forme, et ceux-ci se propager à travers les cultures par la sélection naturelle. Pendant l’expérience, les échantillons des populations sont conservés périodiquement cryogénie pour créer un enregistrement fossile congelé non en évolution. Un grand nombre d’approches peut être utilisé pour caractériser l’évolution des populations bactériennes, mais les deux méthodes les plus courantes sont les essais de remise en forme, qui mesurent la capacité des bactéries évolués de rivaliser contre leurs lointains ancêtres et le séquençage du génome entier, qui est permet d’identifier les changements génétiques que l’adaptation en voiture. Après les travaux pionniers de Richard Lenski et collègues7,8, l’approche standard en évolution expérimentale a été de contester un nombre relativement faible des populations répétées (typiquement < 10) à s’adapter à un nouveau défi environnemental, telles que de nouvelles sources de carbone, la température ou un phage prédatrice.

Les infections causées par des bactéries résistantes aux antibiotiques deviennent un gros problème quand la résistance est suffisamment élevée pour qu’il n’est pas possible d’augmenter les concentrations d’antibiotique à des niveaux mortels dans les tissus du patient. Les cliniciens sont donc intéressés par ce qui permet aux bactéries d’évoluer résistance à de fortes doses d’antibiotiques qui sont au-dessus de ce seuil de concentration antibiotique, le point d’arrêt clinique. Comment étudier ceci expérimentalement ? Si un petit nombre de populations bactériennes est mis au défi avec une forte dose d’antibiotique, comme dans un style Lenski experiment, alors le résultat le plus probable est que l’antibiotique conduira toutes les populations à l’extinction. Dans le même temps, si la dose d’antibiotique qui est utilisé est basse, inférieure à la concentration minimale inhibitrice (CMI) de la souche parentale, puis il est peu probable que les populations bactériennes évoluera cliniquement pertinents niveaux de résistance, surtout si résistance entraînera un coût important. Un compromis entre ces deux scénarios consiste à utiliser un « sauvetage évolutive » expérience9,10,11. Dans cette approche, un très grand nombre de cultures (typiquement > 40) doit relever le défi avec des doses d’antibiotiques qui augmentent au fil du temps, généralement en doublant la concentration d’antibiotique chaque jour12. La principale caractéristique de cette expérience est que toute la population qui n’évolue pas de résistance accrue est conduite à l’extinction. La plupart des populations qui sont mis au défi de cette manière seront pilotées disparues, mais une petite minorité sera présent en évoluant à des niveaux élevés de résistance. Dans cet article, nous montrons comment cette conception expérimentale peut être utilisée pour étudier la contribution de plasmide Multicopie à l’évolution de la résistance.

Les bactéries acquièrent la résistance aux antibiotiques par le biais de deux voies principales, mutations chromosomiques et d’acquisition d’éléments génétiques mobiles, pour la plupart des plasmides13. Plasmides jouent un rôle clé dans l’évolution de la résistance aux antibiotique, parce qu’ils sont en mesure de transférer des gènes de résistance entre bactéries par conjugaison14,15. Plasmides peuvent être divisés en deux groupes selon leur taille et de la biologie : « petit », avec le nombre élevé de copies par cellule bactérienne et les « grands », avec faible copie numéro16,17. Le rôle des grands plasmides dans l’évolution de la résistance aux antibiotique a été largement documenté parce qu’elles incluent les plasmides conjugatifs, qui sont les principaux moteurs de la diffusion de la résistance et la résistance chez les bactéries15multi. Petits plasmides multi-copies sont également extrêmement fréquents chez les bactéries17,18, et ils codent souvent pour de gènes de résistance aux antibiotiques19. Cependant, le rôle des petits plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique a été étudié dans une moindre mesure.

Dans un ouvrage récent, nous avons proposé que les plasmides multi-copies pourraient accélérer l’évolution des gènes qu’ils transportent en augmentant le taux de mutation de gène en raison du nombre de copie de gène supérieur par cellule12. En utilisant un modèle expérimental avec la souche e. coli MG1655 et la β-lactamase gène blaTEM-1 , il a été démontré que les plasmides multi-copies accélèrent le taux d’apparition de TEM-1 mutations conférant la résistance à la troisième génération céphalosporines ceftazidime. Ces résultats indiquent que les plasmides multi-copies pourraient jouer un rôle important dans l’évolution de la résistance aux antibiotique.

Nous présentons ici une description détaillée de la méthode que nous avons mis au point pour analyser l’évolution de la médiation plasmidique multicopie de résistance aux antibiotique. Cette méthode a trois différentes étapes : tout d’abord, insertion du gène à l’étude dans un plasmide Multicopie ou le chromosome de la bactérie hôte. En second lieu, utiliser des évolution expérimentale (sauvetage évolutive) pour évaluer le potentiel des souches différentes pour s’adapter à la pression de sélection. Et Troisièmement, déterminer les bases moléculaires qui sous-tendent la médiation plasmidique evolution en utilisant l’ADN, séquençage et la reconstruction de ces mutations présumées individuellement dans le génotype parental.

Enfin, bien que le protocole décrit ici a été conçu pour analyser l’évolution de la résistance aux antibiotique, on peut affirmer que cette méthode pourrait être généralement utile pour analyser l’évolution des innovations acquis par des mutations dans n’importe quel multicopies gène plasmidique codée.

Protocol

1. construction du système expérimental codant le gène de résistance aux antibiotiques Remarque : Ici MG1655 d’e. coli a été utilisé comme la souche réceptrice du gène plasmidique ou chromosomique-codé la résistance aux antibiotiques. Le gène de résistance aux antibiotiques est encodé dans le chromosome ou un plasmide Multicopie dans une souche sinon isogénique (Figure 1). Insertion du gène de résistance aux antibiot…

Representative Results

Dans nos travaux précédents, on a étudié l’évolution le gène les β-lactamase blaTEM-1 vers conférant la résistance à la troisième génération de céphalosporines ceftazidime12 . Ce gène a été choisi parce que, bien que TEM-1 ne confère pas de résistance à la ceftazidime, mutations blaTEM-1 peuvent élargir l’éventail des activités de TEM-1 d’hydrolyser les céphalosporines comme ceftazidime<sup class…

Discussion

Nous présentons un nouveau protocole combinant biologie moléculaire, évolution expérimentale et profond séquençage de l’ADN visant à examiner le rôle des plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique chez les bactéries. Bien que ce protocole combine les techniques de différentes disciplines, toutes les méthodes nécessaires pour le développer sont simples et peuvent être effectuées dans un laboratoire de microbiologie ordinaire. Les étapes plus critiques dans le protocole …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l’Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de I + D + je 2013-2016) : subventions CP15-00012, PI16-00860 et CIBER (CB06/02/0053), cofinancé par le Fonds européen de développement régional ” une façon d’atteindre l’Europe ” (FEDER). JAE est soutenue par le programme Atracción de talento du gouvernement de la région de Madrid (2016-T1/BIO-1105) et la j’ai + D Excelencia de l’espagnol Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM est soutenu par une bourse de recherche Miguel Servet de l’Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) cofinancés par le Fonds Social européen « Investir dans votre avenir » (FSE) et le FEDER.

Materials

Thermocycler BioRad C1000
Electroporator BiorRad 1652660
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000 Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm
Incubator Memmert UF1060
Incubator (shaker) Cole-Parmer Ltd SI500
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis chamber BioRad 1704405 Agarose gel electrophoresis
Pippettes Biohit 725020, 725050, 725060, 725070
Multi-channel pippetes Biohit 728220, 728230,
728240
Plate reader Synergy HTX BioTek BTS1LF
Inoculating loops Sigma-Aldrich I8388
96-well plates Falcon 351172
LB BD Difco DF0446-17-3
LB agar Fisher scientific BP1425-500
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Resctriction enzymes Fermentas FastDigest
Antibiotics Sigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 Plasmid extraction kit
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 gDNA extraction kit
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 gDNA extraction kit
Electroporation cuvettes Sigma-Aldrich Z706078
Petri dishes Sigma-Aldrich D9054
Cryotubes ClearLine 390701
96-well plates (-80ºC storage) Thermo Fisher Scientific 249945
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 Quantification of DNA concentartion
Agarose BioRad 1613100 Agarose gel electrophoresis
50x TAE buffer BioRad 1610743 Agarose gel electrophoresis
T4 Polynucleotide Kinase Thermo Fisher Scientific EK0031
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific EL0014

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Cite This Article
Escudero, J. A., MacLean, R. C., San Millan, A. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (135), e57386, doi:10.3791/57386 (2018).

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