Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक आसान और सुविधाजनक विधि लेबल और Histone2B-GFP BacMam 2.0 लेबल और एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग कर mitotic कोशिकाओं में रहते गुणसूत्रों कल्पना ।
Abstract
गुणसूत्रों मज़बूती से होना चाहिए और समान रूप से mitotic कोशिका विभाजन के दौरान बेटी कोशिकाओं में अलग । गुणसूत्र अलगाव की निष्ठा धुरी विधानसभा चौकी (सैक) शामिल है कि कई तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है । सैक एक जटिल प्रतिक्रिया प्रणाली है कि बँटवारा के माध्यम से एक सेल प्रगति की रोकथाम के लिए जिंमेदार है जब तक सभी गुणसूत्र kinetochores धुरी microtubules से जुड़े है का हिस्सा है । गुणसूत्र विश्र्व और असामान्य गुणसूत्र पृथक्करण शिथिल कोशिका चक्र नियंत्रण चौकियों का एक संकेतक है और विभाजन कोशिकाओं की जीनोमिक स्थिरता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । थैली के विनियमन गुणसूत्र अलगाव के दौरान त्रुटियों के संचय के माध्यम से एक घातक सेल में एक सामांय कोशिका के परिवर्तन में परिणाम कर सकते हैं । थैली के कार्यांवयन और kinetochore परिसर के गठन कसकर kinases और फॉस्फेट जैसे प्रोटीन फॉस्फेट 2a (PP2A) के बीच बातचीत के द्वारा विनियमित रहे हैं । यह प्रोटोकॉल माउस भ्रूण fibroblasts चूहों कि PP2A-B56γ विनियामक उपइकाई के एक नॉकआउट था से पृथक में विश्र्व गुणसूत्रों के लाइव सेल इमेजिंग का वर्णन । यह विधि अन्य कोशिका चक्र नियंत्रण इमेजिंग तकनीकों जैसे फ्लो cytometry या immunocytochemistry की कमियों को काबू करती है जो केवल गुणसूत्रों के गतिशील spatiotemporal दृश्य के बजाय एक कोशिका cytokinesis स्थिति का स्नैपशॉट प्रदान करती हैं बँटवारा के दौरान.
Introduction
निंनलिखित प्रोटोकॉल में, हम एक सुविधाजनक विधि का वर्णन करने के लिए माउस भ्रूण fibroblasts में सेल चक्र के दौरान गुणसूत्र अलगाव और mitotic प्रगति कल्पना हिस्टोन बी-GFP, BacMam 2.0 लेबलिंग और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग कर ।
सेल चक्र नियंत्रण चौकियों गुणसूत्र अलगाव की निगरानी और सेल 1,2,3की आनुवंशिक अखंडता के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । गलत अलग गुणसूत्रों के संचय aneuploidy है, जो सबसे ठोस ट्यूमर की एक बानगी है नेतृत्व कर सकते है 4। इसलिए, विश्र्व गुणसूत्रों का पता लगाने के लिए गुणसूत्र अस्थिरता का अध्ययन करने के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन के लिए जीना गुणसूत्र अलगाव और गुणसूत्र विश्र्व कल्पना लेकिन mCherry की पीढ़ी-टैग या H2B-GFP टैग प्रोटीन जीन वितरण और आणविक जीवविज्ञान के पर्याप्त ज्ञान की आवश्यकता है प्रयोग किया जा सकता है 5। यहां हम CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0 एजेंट के उपयोग का वर्णन, इसके बाद सीएल-एचबी regent कहा जाता है, सादगी की खातिर । इस रिएजेंट तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह वेक्टर गुणवत्ता और अखंडता के बारे में चिंताओं को समाप्त । इसके अलावा, इस एजेंट संभावित हानिकारक उपचार या लिपिड और डाई लोडिंग रसायनों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । पारंपरिक फ्लोरोसेंट लेबल के विपरीत, सीएल एचबी regent समारोह के स्वतंत्र रूप से दाग (यानी, झिल्ली क्षमता) । सीएल एचबी regent बस कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए रातोंरात गर्मी । सीएल एचबी regent स्तनधारी कोशिकाओं में प्रतिकृति नहीं है और सुरक्षा के स्तर (बीएसएल) 1 प्रयोगशाला सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस क्षणिक अभिकर्मक अप करने के लिए 5 दिनों के लिए रातोंरात मशीन के बाद पता लगाया जा सकता, पर्याप्त समय के लिए सबसे गतिशील सेलुलर विश्लेषण बाहर ले जाने के लिए ।
वैकल्पिक रूप से, गुणसूत्र विषमताओं का अध्ययन विभिन्न तकनीकों जैसे प्रवाह cytometry, immunohistochemistry या प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (मछली) 6द्वारा किया जा सकता है । फ्लो cytometry aneuploidy अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो डीएनए सामग्री और कोशिका चक्र में कोशिकाओं के चरण के आधार पर मापा जा सकता है. हालांकि प्रवाह cytometry aneuploidy मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह गुणसूत्र एमआईएस-पृथक्करण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है । मछली और immunohistochemistry तकनीक फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करने के लिए डीएनए या गुणसूत्रों को बांध । जबकि इन तकनीकों कोशिकाओं की आबादी की स्थिति का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं, वे रहते सेल इमेजिंग जिससे किसी भी विशिष्ट कोशिकाओं में cytokinesis के spatiotemporal दृश्य के माध्यम से प्राप्त जानकारी समय की अवधि के बाद लापता की अनुमति नहीं है ।
इस प्रोटोकॉल को विश्र्व गुणसूत्रों या गुणसूत्र एमआईएस-अलगाव nocodazole इलाज माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) PP2A-B56γ-चूहों से पृथक में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसके बाद के संस्करण आवेदन के अलावा, इस प्रोटोकॉल को लेबल और विभिंन प्रकार के सेल जो कोशिका चक्र विनियमन या ट्यूमर कोशिकाओं में गुणसूत्र अस्थिरता का अध्ययन किया जा सकता है में गुणसूत्र अलगाव कल्पना करने के लिए एक सरल उपकरण प्रदान करता है । इसके अलावा, यह भी विभिंन दवा उपचार की वजह से गुणसूत्र अस्थिरता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या जीन दस्तक के प्रभाव का अध्ययन बाहर गुणसूत्र गलत अलगाव में जिसके परिणामस्वरूप ।
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Protocol
इन अध्ययनों में किए गए सभी प्रयोगों को खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) अनुसंधान सुविधा में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था ।
1. अलगाव और माउस भ्रूण Fibroblasts (MEFs) की संस्कृति
- मानक प्रोटोकॉल 7,8,9द्वारा एक PP2A-B56γ-माउस तनाव और जंगली प्रकार littermates से माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) अलग ।
- 3 मार्ग, फ्रीज और जब तक की दुकान के लिए ExpandMEFs प्रयोगों के लिए आवश्यक 8.
2. संवर्धन Mefs में 2-अच्छी तरह से चैंबर्ड कवर ग्लास लाइव इमेजिंग के लिए
- Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM/F12) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1 एक्स पेनिसिलिन/Streptomycin एंटीबायोटिक्स, एल-Glutamine (200 mM) और 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) एक 500 मिलीलीटर मीडिया की बोतल के साथ युक्त MEF वृद्धि मीडिया की 500 मिलीलीटर तैयार करें ।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म पानी के स्नान में 3 मार्ग पर जंगली प्रकार और PP2A-B56γ-चूहों से जमे हुए MEFs के गल शीशियों ।
- स्थानांतरण गल MEFs 15 एमएल ट्यूबों के लिए और धीरे से जोड़ें dropwise 20 मिलीलीटर DMEM/F12 मीडिया के लिए 15 मिलीलीटर एक 10-एमएल पिपेट का उपयोग कर ट्यूबों ।
- T75 कुप्पी में DMEM/F12 विकास मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ MEFs स्थानांतरण और उंहें विस्तार जब तक कोशिकाओं 70% धाराप्रवाह हैं । प्रवाह 4x या 10x आवर्धन पर एक व्युत्क्रम माइक्रोस्कोप का उपयोग करने का अनुमान है ।
- महाप्राण वृद्धि एक गिलास चराई का उपयोग कर पिपेट हुड में एक वैक्यूम प्रणाली से जुड़ी मध्यम, 0.25% trypsin/EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें और 37 ° c 5 मिनट के लिए में मशीन । DMEM/F12 वृद्धि मध्यम की 3 मिलीलीटर की प्रतिक्रिया को रोकने के लिए जोड़ें ।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कम गति (300 x g) पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । ध्यान से supernatant निकालें और DMEM/F12 विकास मध्यम पूर्व के 1 मिलीलीटर में एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म सेल गोली पुनः निलंबित ।
- trypan नीली बहिष्करण पद्धति या अन्य उपयुक्त कक्ष की गणना विधि 8का उपयोग करके कक्षों की गणना करना ।
- बीज लगभग 20,000 MEFs/अच्छी तरह से एक 2-अच्छी तरह से चैंबर कवर गिलास में । 200 µ l/अच्छी तरह से DMEM/F12 विकास माध्यम जोड़ें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर उंहें रात में मशीन द्वारा संलग्न करने की अनुमति देते हैं ।
3. तुल्यकालन
- G0/g1 चरण में कक्षों की अधिकतम संख्या प्राप्त करने के लिए 24 ज के लिए 0.1% FBS वाले DMEM/F12 ग्रोथ मीडिया में कोशिकाओं को G0/g1 चरण में MEFs सिंक्रनाइज़ करें ।
नोट: हालांकि सीरम भुखमरी वरीयता की एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया गया था, विभिंन अंय तरीकों mitotic मंच है जिस पर कोशिकाओं को गिरफ्तार किया जा करने के लिए आवश्यक है के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है 10।
4. लेबलिंग
- DMSO में nocodazole के 1.5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें । Nocodazole microtubule गठन को बाधित करके G2/एम चरण में कोशिकाओं की गिरफ्तारी 10।
- तीन दिनों के बाद तुल्यकालन, वृद्धि मध्यम के 200 µ एल जोड़ें (10% FCS के साथ), 200 एनजी/एमएल nocodazole और सीएल-एचबी regent (हिस्टोन बी-GFP BacMam 2.0) ।
- प्रति कक्ष (पीपीसी) के लिए सीएल-एचबी regent कणों की गणना निम्नानुसार कोशिकाओं को जोड़ा जा करने के लिए:
जहां कोशिकाओं की संख्या लेबलिंग के समय में कोशिकाओं की अनुमानित कुल संख्या है, पीपीसी सेल प्रति कणों की संख्या है, और 1 × 108 एजेंट की मिलीलीटर प्रति कणों की संख्या है । उदाहरण के लिए, 30 के पीपीसी के साथ 20,000 कोशिकाओं को लेबल करने के लिए
नोट: सीएल एचबी regent 10 और 50 पीपीसी के बीच सबसे अधिक सेल प्रकार के साथ अच्छी तरह से काम करता है । हालांकि, 30 पीपीसी इस अध्ययन के लिए सबसे अच्छा काम किया । - 37 ° c और 5% CO2पर 18 h के लिए MEFs की मशीन ।
नोट: वर्तमान प्रयोग के लिए, mitotic कोशिकाओं में गुणसूत्रों के दृश्य धुरी विधानसभा भागने के nocodazole के साथ सेल साइकिल गिरफ्तारी के बाद 18 ज हुई ।
5. विश्र्व गुणसूत्रों का दृश्य
- कल्पना माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप एक पर्यावरण चैंबर और एक तेल विसर्जन, 63x उद्देश्य लेंस के साथ सुसज्जित प्रणाली का उपयोग कर ।
- GFP चैनल छवि अधिग्रहण के लिए 488 एनएम और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 450 एनएम के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का प्रयोग करें ।
- इस तकनीक के लिए फोटो ब्लीचिंग के बाद मोटर चालित स्कैनिंग चरणों, जेड-पीजो आवेषण, स्टेज टॉप मशीन और प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति वसूली की क्षमता के साथ एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप प्रणाली का प्रयोग करें ।
- इमेजिंग से पहले एक दिन, पर पर्यावरण चैंबर बिजली बारी और 37 डिग्री सेल्सियस रात भर में पूरे चैंबर गर्म ।
- माइक्रोस्कोप स्टैंड, कैमरा, कताई डिस्क यूनिट, प्रकाशक, आर्गन लेजर, कंप्यूटर और मोटर की अवस्था के लिए बिजली चालू करें ।
- प्रणाली 3 मिनट के लिए गर्म करने दें; इग्निशन कुंजी को चालू करके आर्गन लेजर शुरू करें । "स्टैंडबाय" से आर्गन लेजर के लिए टॉगल स्विच स्विच करने के लिए "लेजर भागो" ।
- डाटा अधिग्रहण और प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर लांच ।
- चरण शीर्ष मशीन के लिए सह2 नियंत्रक आरंभ और 5% पर सह2 की एकाग्रता निर्धारित किया है । यह इमेजिंग के प्रारंभ से पहले किया जाना चाहिए ।
- दृश्य के लिए मंच पर मशीन और जगह से चैम्बर कवर ग्लास निकालें । एक तेल विसर्जन 63x उद्देश्य लेंस (na 1.4) के माध्यम से कोशिकाओं कल्पना ।
- नेत्र लेंस के माध्यम से देखें, छवि ध्यान केंद्रित करने और परमाणु लिफाफा टूटने (NEBD) चरण में एक सेल की पहचान ।
- शुरू उपयुक्त लेजर (488 एनएम आर्गन लेजर कल्पना Histone2B-GFP) ।
- खुला अधिग्रहण नियंत्रण खिड़की और सेट GFP चैनल के लिए जोखिम समय है । NEBD में है जो किसी कक्ष की पहचान करें ।
- मैन्युअल लक्ष्य सेल के ऊपर और नीचे फोकल विमान का निर्धारण, और xyz ऑप्टिकल खोदी सेटिंग्स दर्ज करें ।
- यह 20 मिनट के लिए निरीक्षण; सेल प्रभाग के माध्यम से कक्ष आगे बढ़ना नहीं है, तो 20 मिनट के बाद छवि प्राप्ति रोकें और NEBD में है जो अगले कक्ष पर ले जाएँ ।
- लगभग 1 ज प्रति कोशिका PP2A-B56γ-कोशिकाओं है कि थैली से बच में बँटवारा के दौरान छवि विश्र्व गुणसूत्रों की जरूरत है । किसी चलचित्र के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए, हर 3 मिनट में चित्र लें ।
नोट: जंगली प्रकार की कोशिकाओं की गिरफ्तारी और पिछले NEBD प्रगति नहीं है जब nocodazole के साथ इलाज किया । - आगे विश्लेषण के लिए zvi फ़ाइल स्वरूप में छवियों को बचाओ ।
6. छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण
नोट: Axiovision संस्करण 4.8.2 या Imaris संस्करण 8.2 जैसे किसी भी उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए तीन-आयामी छवि संसाधन और विश्लेषण निष्पादित करें । इस अध्ययन के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया गया था ।
- छवि अनुक्रम खोलें । यदि चित्र पहले से स्टैक स्वरूप में हैं, तो अगले चरण पर आगे बढ़ें । यदि नहीं, तो एक ' का उपयोग कर ढेर में सभी प्रासंगिक छवियों गठबंधन छवि > स्टैक्स > चित्र मेनू पट्टी में ढेर ' ।
- चमक/कंट्रास्ट और स्तरों के लिए आवश्यक के रूप में किसी भी समायोजन करते हैं ।
- चलचित्र में कोई समय स्टांप जोड़ने के लिए:
- मेनू बार में ' छवि > स्टैक्स > लेबल... ' पर जाएं ।
- उपयुक्त स्वरूप, प्रारंभ समय मान, और प्रत्येक छवि के बीच समय अंतराल का चयन करें ।
- ' पूर्वावलोकन ' बॉक्स की जाँच करें और स्थान और स्वरूप सेटिंग्स समायोजित. प्रेस ' ठीक ' समय स्टांप लागू करने के लिए ।
- चलचित्र में स्केल बार जोड़ने के लिए:
- मेनू पट्टी में ' विश्लेषण > सेट स्केल ' के अंतर्गत छवि स्केलिंग सेट करें ।
- ' पिक्सेल में दूरी ' फ़ील्ड में, जहाँ दूरी ज्ञात है, और ' ज्ञात दूरी ' फ़ील्ड में दूरी दर्ज करें पिक्सेल की एक संख्या दर्ज करें । दूरी के लिए लंबाई की सही इकाई निर्धारित करें, जैसे, µm. the स्टैक करने के लिए स्केल लागू करने के लिए ' ठीक ' दबाएँ ।
- ' के लिए विश्लेषण > टूल > स्केल बार... ' के लिए स्केल बार जोड़ने जाओ । पट्टी के आकार को ' µm में चौड़ाई ' के रूप में सेट करें, और शेष स्वरूपण विकल्पों को उपयुक्त के रूप में समायोजित करें । स्केल बार को पूरे स्टैक में जोड़ने के लिए ' सभी स्लाइस लेबल ' बॉक्स को चेक करें ।
- छवि खिड़की के नीचे बाएँ किनारे पर त्रिकोणीय खेलने के बटन पर क्लिक करके फिल्म का पूर्वावलोकन करें. मेनू बार में ' छवि > स्टैक्स > ऐनिमेशन > ऐनिमेशन विकल्प ' का उपयोग करके फ़्रेम दर समायोजित करें ।
- का चयन करके फिल्म फ़ाइल निर्यात ' फ़ाइल > के रूप में सहेजें > AVI... ' और फ्रेम दर और संपीड़न का चयन करें ।
- सहेजें स्थान और फ़ाइल नाम का चयन करने के लिए ' ठीक ' दबाएँ. चलचित्र फ़ाइल सहेजने के लिए ' सहेजें ' दबाएं ।
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Representative Results
जंगली प्रकार और PP2A-B56γ-चूहों से MEFs एक 2-well चैंबर कवर ग्लास में वरीयता प्राप्त और संलग्न करने की अनुमति दी गई । 2 दिन, MEFs 24 एच के लिए 0.1% FBS का उपयोग कर सिंक्रनाइज़ किया गया । 3 दिन, 200 एनजी/एमएल nocodazole और 30 पीपीसी सीएल-एचबी regentwere के साथ मीडिया में MEFs 37डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर 18 एच के लिए मशीन । 4 दिन पर, कोशिकाओं को एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप प्रणाली (चित्रा 1) का उपयोग कर imaged थे । लाइव सेल इमेजिंग के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं के भाग्य कल्पना के रूप में वे बँटवारा (चित्रा 2) के माध्यम से NEBD से प्रगति किया गया था. Nocodazole microtubule गठन के साथ हस्तक्षेप करके G2M चरण में जंगली प्रकार की कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए जाना जाता है । यह देखा गया कि पोस्ट nocodazole उपचार जंगली प्रकार की कोशिकाओं metaphase ऊपरी पैनल में गिरफ्तार किया गया (चित्रा 2) । हमने देखा है कि PP2A की कमी-B56γ कोशिका चक्र नियंत्रण कमजोर है, जो PP2A-B56γ-MEFs सेल चक्र nocodazole द्वारा प्रेरित गिरफ्तारी पर काबू पाने के लिए अनुमति दी 9। इसके अलावा, असामांय गुणसूत्र अलगाव 62% में पता लगाया गया था (21 में से 13) mitotic PP2A-B56γ-MEFs nocodazole के साथ इलाज ( चित्रा 2में निचले पैनल में पीले तीर से दिखाया गया है) । पांच PP2A-B56γ-MEFs में गिरफ्तार NEBD और 3 पर बिना किसी चौकसी के दोषों का बँटवारा होकर चला गया. इसके विपरीत, सभी 21 जंगली प्रकार की कोशिकाओं है कि छवि का बँटवारा के माध्यम से आगे बढ़ना नहीं था और metaphase (ऊपरी पैनल चित्रा 2) द्वारा गिरफ्तार किया जा पाया गया ।
चित्र 1 . लाइव सेल इमेजिंग के लिए मूल फ़्लोचार्ट । जंगली प्रकार और PP2A-B56γ-चूहों से MEFs एक 2 में अच्छी तरह से चैम्बर कवर गिलास रात भर में वरीयता प्राप्त थे । दिन 2, कक्ष 24 घंटे के लिए 0.1% FBS का उपयोग कर सिंक्रनाइज़ किए गए थे 3 दिन, कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया था 200 एनजी/एमएल nocodazole विकास मीडिया में और 30 पीपीसी हिस्टोन 2 बी-GFP, BacMam 2.0 एजेंट 18 घंटे के लिए 4 दिन कोशिकाओं कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग कर रहे थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2। PP2A-B56γ-MEFs में गुणसूत्र विषमताओं का पता लगाया जाता है. समय चूक माइक्रोस्कोपी लाइव छवियों का बँटवारा (0-51 min) में विभिन्न समय बिंदुओं पर कब्जा कर लिया nocodazole का इलाज जंगली प्रकार और PP2A-B56γ-MEFs. जंगली प्रकार की कोशिकाओं को metaphase (ऊपरी पैनल) पर गिरफ्तार किया जाना पाया गया, जबकि PP2A-B56γ-MEFs का बँटवारा (लोअर पैनल) के माध्यम से जाने में सक्षम थे. गुणसूत्र विश्र्व या गलत-पृथक्करण को निचले फलक में पीले तीरों द्वारा दर्शाए गए PP2A-B56γ-MEFs में देखा जा सकता है. स्केल बार = 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
सही गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करने के लिए सेल चक्र नियंत्रण चौकियों aneuploidy और सेल परिवर्तन 1,2,3को रोकनेके। वर्तमान अध्ययन में, हमने पाया कि PP2A की निष्क्रियता-B56γ एक कमजोर धुरी विधानसभा चौकी के परिणामस्वरूप । लाइव सेल इमेजिंग हमें गुणसूत्र एमआईएस का निरीक्षण करने की अनुमति दी-अलगाव PP2A में बँटवारा के दौरान-B56γ MEFs nocodazole के साथ इलाज किया 9.
यह प्रोटोकॉल लाइव सेल इमेजिंग के लिए गुणसूत्रों को लेबल करने के लिए BacMam 2.0 तकनीक द्वारा उत्पंन Histone2B-GFP लेबल का इस्तेमाल करता है । लेबलिंग में महत्वपूर्ण चरणों में से एक कोशिकाओं (पीपीसी) प्रति कणों की सही राशि की गणना करने के लिए पर्याप्त लेबलिंग प्राप्त है । यह अनुमापन के माध्यम से पाया गया कि 10-50 पीपीसी सबसे अच्छा काम करता है । यह एजेंट कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है; इसलिए यह अनुमापन पीपीसी लेबलिंग और बला कोशिकाओं को विषाक्तता के बीच संतुलन को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया आवश्यक है । इसके अलावा, यह एक क्षणिक अभिकर्मक है और केवल 5 दिनों तक पता लगाया जा सकता है, इसलिए, यह पढ़ाई के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है कि अब प्रेक्षण अवधि वारंट होगा ।
प्रोटीन या डीएनए के पारंपरिक टैगिंग जटिल प्रोटोकॉल की आवश्यकता कर सकते हैं, लेकिन यहां हम एक एजेंट है जो वांछित कोशिकाओं के साथ ही एक रात की मशीन की आवश्यकता का उपयोग करें । इसके अलावा, लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग किया गया कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी के विपरीत जो फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी तेजी से है और जीवित कोशिकाओं में phototoxicity और ब्लीचिंग प्रभाव कम कर देता है 11. इस प्रोटोकॉल आसान, सुविधाजनक विधि mitotic कोशिकाओं लेबल और गुणसूत्र अलगाव कल्पना के रूप में अंय तकनीकों की तुलना में ऐसी मछली, immunohistochemistry और प्रवाह cytometry के रूप में की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल भी है कि पारंपरिक immunocytochemistry, मछली या प्रवाह cytometry का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त जानकारी प्रदान बँटवारा भर में विश्र्व गुणसूत्रों छवियों का कब्जा अनुमति देता है, जिससे यह इस तरह phenotypes पर कब्जा करने के लिए संभव बनाने दोनों अंतरिक्ष और समय में विश्र्व गुणसूत्र के रूप में । इस प्रोटोकॉल सेल लाइनों, प्राथमिक कोशिकाओं, स्टेम सेल, न्यूरॉन्स और अमर टी कोशिकाओं की एक विस्तृत विविधता में गुणसूत्रों के सुविधाजनक, तेज और आसान लेबलिंग की अनुमति देता है 12,13,14.
सेल थेरेपी उत्पादों के विभिंन प्रकार के विभिंन रोग की स्थिति के इलाज के लिए उंमीद के साथ विकसित किया जा रहा है 15। इन कोशिका उपचारों के विकास में आने वाली चुनौतियों में से एक आनुवंशिक अस्थिरता और tumorigenesis की संभावना के कारण सुरक्षा चिंताओं को शामिल किया गया है । इस प्रोटोकॉल में गुणसूत्रों को विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में लेबल करने के लिए एक सुविधाजनक और आसान तरीका का वर्णन है । भविष्य में यह एक परख के लिए अध्ययन और आनुवंशिक अस्थिरता और कोशिका चिकित्सा उत्पादों की गुणवत्ता को मापने के विकास के लिए नियोजित किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
हम dr. गुओ-Chiuan त्रिशंकु और बहुमूल्य टिप्पणी है कि पांडुलिपि में सुधार के लिए डॉ भरतकुमार जोशी का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
References
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