Summary
Este protocolo descreve um método fácil e conveniente para rotular e Visualizar ao vivo cromossomos em células mitóticas usando Histone2B-GFP BacMam 2.0 label e um sistema de microscopia confocal de disco girando.
Abstract
Cromossomos devem ser confiável e uniformemente agrupados em células-filhas durante a divisão celular mitótica. Fidelidade de segregação cromossômica é controlada por vários mecanismos que incluem o Checkpoint do fuso de Assembly (SAC). O SAC é parte de um sistema de realimentação complexo que é responsável pela prevenção de um progresso de célula através de mitose, a menos que todos os cinetócoros cromossômicos tem anexado para eixo de microtúbulos. Guarnição cromossómica e cromossomo anormal segregação é um indicador de disfuncional ciclo celular postos de controle e pode ser usada para medir a estabilidade genômica de dividir células. Desregulamentação do saco pode resultar na transformação de uma célula normal em uma célula maligna através da acumulação de erros durante a segregação cromossômica. Implementação do saco e a formação de complexos o cinetócoro estão fortemente regulamentados pelas interações entre quinase e fosfatase, tais como a proteína fosfatase 2A (PP2A). Este protocolo descreve a imagem de célula viva de retardamento de cromossomos em fibroblastos embrionários de rato isolados de ratos que tinham um nocaute de subunidade reguladora PP2A-B56γ. Esse método supera os defeitos do outros ciclo celular controle técnicas de imagem como citometria de fluxo ou imunocitoquímica que fornecem apenas um instantâneo de um estatuto de citocinese células, em vez de uma visualização dinâmica spatiotemporal de cromossomos durante a mitose.
Introduction
O seguinte protocolo, descrevemos um método conveniente para visualizar a segregação cromossômica e progressão mitótica durante o ciclo celular em fibroblastos embrionários de rato usando histona 2B-GFP, BacMam 2.0 rotulagem e imagens de células vivas.
Postos de controle do ciclo celular monitorar a segregação do cromossomo e desempenham um papel importante na manutenção da integridade genética das células 1,2,3. Acumulação de cromossomos mis segregados pode levar à aneuploidia, que é uma marca registrada de mais sólido tumores 4. Daí, deteção de retardamento cromossomos pode ser usada como um método para estudar a instabilidade cromossômica.
Fluorescente etiquetado proteínas podem ser usado para visualizar a segregação do cromossomo ao vivo e cromossômicas atraso mas a geração de mCherry-tag ou proteína H2B-GFP com a tag requer conhecimento substancial do gene entrega e biologia molecular 5. Aqui nós descrevemos o uso do reagente de CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, doravante chamado regente CL-HB, por razões de simplicidade. Este reagente pode ser usado imediatamente e, portanto, elimina as preocupações sobre o vetor de qualidade e integridade. Além disso, este reagente não requer o uso de tratamentos potencialmente prejudiciais ou lipídios e produtos químicos de tintura-carregamento. Ao contrário de etiquetas fluorescentes convencionais, o regente de CL-HB manchas independentemente de função (i. e., potencial de membrana). O regente de CL-HB pode ser simplesmente adicionado às células e incubado durante a noite para a expressão da proteína. O regente de CL-HB não replicar em células de mamíferos e pode ser usado em configurações de 1 laboratório nível de biossegurança (BSL). Também, este transfecção transiente pode ser detectada após incubação durante a noite por até 5 dias, tempo suficiente para efectuar análises de celulares mais dinâmicas.
Alternativamente, anormalidades cromossômicas poderiam ser estudadas por várias técnicas como citometria de fluxo, imuno-histoquímica ou fluorescência em situ hybridization (FISH) 6. Citometria de fluxo pode ser usada para estudar aneuploidia, que pode ser medida com base no conteúdo de DNA e a fase das células no ciclo celular. Apesar de citometria de fluxo pode ser usada para medir a aneuploidia, ele não fornece informações sobre segregação cromossômica de mis. Técnicas de peixes e imuno-histoquímica usam sondas fluorescentes para ligar ao DNA ou cromossomos. Enquanto essas técnicas fornecem um instantâneo do status de uma população de células, eles não permitem célula viva imagem faltando, assim, qualquer informação obtida através da visualização spatiotemporal de citocinese em células específicas, seguido por um período de tempo.
Este protocolo foi utilizado para estudar os cromossomas menos desenvolvidas ou cromossômica mis segregação em nocodazole Tratado rato embrionárias fibroblastos (MEFs) isoladas de PP2A-B56γ-ratos. Além de acima de aplicativo, este protocolo fornece uma ferramenta simples para rotular e visualizar a segregação cromossômica em vários tipos de células, que pode ser usado para estudar a regulação do ciclo celular ou instabilidade cromossômica em células tumorais. Além disso, ele pode também ser usado para estudar a instabilidade cromossômica causada por vários tratamentos com drogas ou para estudar os efeitos do gene nocaute resultando em segregação cromossômica de mis.
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Protocol
Todos os experimentos realizados nestes estudos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal no centro de pesquisa do Food and Drug Administration (FDA).
1. isolamento e cultura de fibroblastos embrionários de Mouse (MEFs)
- Isole os fibroblastos embrionários do rato (MEFs) de uma estirpe de PP2A-B56γ-rato e tipo selvagem littermates pelo protocolo padrão 7,8,9.
- ExpandMEFs para 3 passagens, congelar e armazenar até necessários para experimentos 8.
2. cultivo Mefs em vidro de tampa septadas 2-bem para viver de imagem
- Preparar 500 mL de meios de crescimento do MEF contendo meio Eagle modificado do Dulbecco (DMEM/F12) com 10% de soro Fetal bovino (FBS), 1 antibióticos penicilina/estreptomicina de X, L-glutamina (200 mM) e 1 X não aminoácidos essenciais (timina) em uma garrafa de 500 mL de mídia.
- Descongele os frascos de MEFs congelados do tipo selvagem e PP2A-B56γ-ratos na passagem 3 em banho de água previamente aquecido a 37 ° C.
- Transferir MEFs descongelados para tubos de 15 mL e adicionar lentamente gota a gota 20 mL de DMEM/F12 mídia para os tubos de 15 mL com uma pipeta de 10 mL.
- Transferência MEFs juntamente com 20 mL de DMEM/F12 mídia de crescimento em balões T75 e expandi-los até que as células são 70% de Confluencia. Confluência é estimada usando um microscópio inverso em 4x ou ampliação de 10x.
- Aspirado, o meio de crescimento usando uma pastagem de vidro Pipetar ligado a um sistema de vácuo do capuz, adicionar 3 mL de 0,25% tripsina/EDTA e incubar a 37 ° C por 5 min. Adicione 3 mL de meio de crescimento DMEM/F12 para parar a reação.
- Centrifugar as células em baixa velocidade (300 x g) durante 5 min à temperatura ambiente. Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 mL de DMEM/F12 crescimento médio pré aquecido a 37 ° C em banho-maria.
- Enumere as células usando o método de exclusão azul trypan ou outra célula apropriada contando o método 8.
- Sementes de aproximadamente 20.000 MEFs/bem em um vidro de tampa septado 2-bem. Adicionar 200 µ l/poço DMEM/F12 meio de crescimento e permitir que as células anexar incubando-os durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.
3. a sincronização
- Sincronizar o MEFs na fase G0/G1 incubando células em meios de crescimento DMEM/F12 contendo 0,1% FBS durante 24 h, para obter um número máximo de células em fase G0/G1.
Nota: Embora fome de soro foi usado como um método de preferência, vários outros métodos podem ser usados dependendo da fase mitótica em que células são necessários para ser preso 10.
4. rotulagem
- Prepare a 1,5 mg/mL solução stock de nocodazole em DMSO. Nocodazole prende as células na fase G2/M, inibindo a formação de microtúbulos 10.
- Três dias post sincronização, adicionar 200 µ l de meio de crescimento (com 10% de FCS), 200 ng/mL nocodazole e regente de CL-HB (histona 2B-GFP BacMam 2.0).
- Calcule o regente de CL-HB partículas por célula (PPC) para ser adicionado a células como segue:
Onde o número de células é o número total de células no momento da rotulagem, PPC é o número de partículas por célula, e 1 × 108 é o número de partículas por mL do reagente. Por exemplo, às células de rótulo 20.000 com um PPC de 30
Nota: O regente de CL-HB funciona bem com a maioria dos tipos de células entre 10 e 50 PPC. No entanto, PPC 30 funcionou melhor para este estudo. - MEFs, incube por 18 h a 37 ° C e 5% de CO2.
Nota: Para o experimento, visualização dos cromossomos em células mitóticas escapar o ponto de verificação do conjunto de eixo ocorreu 18 h após a detenção do ciclo celular com nocodazole.
5. visualização dos cromossomos de retardamento
- Visualize os fibroblastos embrionários de rato (MEFs) usando um sistema de microscópio confocal de disco girando equipado com uma câmara ambiental e uma imersão de óleo, 63 x da lente objetiva.
- Use o comprimento de onda de excitação de 488 nm e emissão de comprimento de onda de 450 nm para aquisição de imagens do canal GFP.
- Usar um sistema de microscópio confocal de disco giratório com a capacidade dos estágios de varredura motorizadas, Z-Piezo insere, incubação de palco-top e recuperação de fluorescência direta após o clareamento de foto para esta técnica.
- Um dia antes da imagem, a câmara ambiental poder ligar e aquecer a câmara inteira a 37 ° C durante a noite.
- Poder liga para o suporte do microscópio, câmera, unidade de rotação de disco, iluminador, laser de argônio, computador e palco motorizado.
- Deixe o sistema aquecer por 3 min; Inicie o laser de argônio, girando a chave de ignição. Mude o interruptor de alavanca para laser de argônio de "standby" para "executar a laser".
- Lançar o software de aquisição e processamento de dados.
- Iniciar o controlador de CO2 para a incubadora de estágio superior e definir a concentração de CO2 em 5%. Isso deve ser feito antes do início das imagens.
- Remova o vidro tampa septado da incubadora e lugar no palco para visualização. Visualize as células através de uma lente de objetiva de 63 x óleo imersão (NA1.4).
- Ver através das lentes oculares, focar a imagem e identificar uma célula em fase de esgotamento (NEBD) envelope nuclear.
- Inicie o apropriado do laser (488 nm laser de argônio para visualizar Histone2B-GFP).
- Abra a janela de controle de aquisição e definir o tempo de exposição para o canal GFP. Identifica uma célula que está no NEBD.
- Manualmente determinar a parte superior da célula alvo e plano focal de fundo e insira o xyz óptico configurações de corte.
- Observá-lo por 20 min; Se não houver lugar a célula através de divisão celular, pare de aquisição de imagem depois de 20 min e passar para a próxima célula que está em NEBD.
- Aproximadamente 1 h por célula é necessário aos cromossomos de atraso de imagem durante a mitose em PP2A-B56γ-células que escaparam do saco. Para obter dados para um filme, tire fotos cada 3 min.
Nota: células de tipo selvagem prendam e não progresso passado NEBD quando tratados com nocodazole. - Salve imagens no formato de arquivo zvi para posterior análise.
6. processamento e análise de imagem
Nota: Execute análise usando qualquer software disponível como Axiovision versão 4.8.2 ou hottie versão 8.2 e processamento de imagem tridimensional. Para este estudo o ImageJ software foi usado.
- Abra a sequência de imagens. Se as imagens já estão em um formato de pilha, prossiga para a próxima etapa. Se não, combinar todas as imagens relevantes em uma pilha usando ' imagem > pilhas > imagens para pilha ' na barra de menus.
- Realize todos os ajustes conforme necessário para brilho/contraste e níveis.
- Para adicionar um carimbo de hora para o filme:
- Ir para ' imagem > pilhas > etiqueta... ' na barra de menus.
- Selecione o formato apropriado, o valor inicial de tempo e intervalo de tempo entre cada imagem.
- Marque a caixa 'Preview' e ajuste as configurações de local e formato. Pressione 'Okey' para aplicar o carimbo de hora.
- Para adicionar uma barra de escala para o filme:
- Definir a imagem dimensionamento sob ' análise > definir escala ' na barra do menu.
- No campo 'Distância em pixels', digite um número de pixels, onde a distância é conhecida e no campo 'Distância conhecida' digite a distância. Defina a unidade correta de comprimento para a distância, por exemplo, em µm. imprensa 'Okey' para aplicar a escala para a pilha.
- Ir para ' Analyze > Ferramentas > escala bar... ' para adicionar a barra de escala. Definir o tamanho da barra como 'Largura em µm' e ajustar o restante formatação opções conforme apropriado. Marque a caixa 'Rotular todas as fatias' para adicionar a barra de escala para a pilha inteira.
- Visualize o filme clicando no botão peça triangular no canto inferior esquerdo a borda da janela de imagem. Ajustar a taxa de quadro usando ' imagem > pilhas > animação > animação opções na barra de menus.
- Exportar o arquivo de filme, selecionando ' arquivo > salvar como > AVI... ' e selecione a taxa de quadros e compressão.
- Pressione 'Okey' escolher salvar localização e nome de arquivo. Pressione 'Salvar' para salvar o arquivo de filme.
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Representative Results
MEFs de tipo selvagem e PP2A-B56γ-ratos foram semeadas em um vidro de tampa de câmara de 2-poço e permitidos anexar. No dia 2, MEFs foram sincronizados usando 0.1% FBS por 24 h. No dia 3, MEFs na mídia com 200 ng/mL nocodazole e regentwere de PPC CL-HB 30 incubados por 18 h em 37° C e 5% CO2. No dia 4, as células foram fotografadas usando um sistema de microscópio confocal de disco giratório (Figura 1). Viver imagem latente da pilha foi usado para visualizar o destino das células individuais, como evoluíram de NEBD através de mitose (Figura 2). Nocodazole é conhecido para prender as tipo selvagem pilhas no G2M fase por interferir com a formação de microtúbulos. Observou-se esse tipo de post nocodazole tratamento selvagem células foram presos no painel superior da metáfase (Figura 2). Observamos que a falta de PP2A-B56γ enfraqueceu o controlo do ciclo celular, que permitiu PP2A-B56γ-MEFs superar a detenção do ciclo celular induzida por nocodazole 9. Além disso, a segregação cromossômica anormal foi detectada em 62% (13 de 21) de mitóticas PP2A-B56γ-MEFs tratados com nocodazole (indicado por setas amarelas no painel inferior na Figura 2). Cinco das PP2A-B56γ-MEFs preso em NEBD e 3 passou por mitose sem defeitos observáveis. Em contraste, todos os 21 células de tipo selvagem que foram fotografadas não avançar através da mitose e foram encontradas para ser preso por metáfase (painel superior Figura 2).
Figura 1 . Fluxograma Básico para geração de imagens ao vivo de celular. MEFs de tipo selvagem e PP2A-B56γ-ratos foram semeadas em um vidro de tampa septado 2-bem durante a noite. Dia 2, as células foram sincronizadas usando 0.1% FBS por 24 h. dia 3, as células foram tratadas com 200 ng/mL nocodazole em meios de crescimento e 30 PPC histona 2B-GFP, BacMam 2.0 reagente para 18 h. dia 4, as células foram fotografadas usando sistema de microscópio confocal de disco girando. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Anormalidades cromossômicas são detectadas em PP2A-B56γ-MEFs. Tempo lapso microscopia ao vivo imagens capturadas em vários pontos de tempo na mitose (0-51 min) de tipo selvagem de nocodazole Tratado e PP2A-B56γ-MEFs. As células de tipo selvagem foram encontradas para ser preso na metáfase (painel superior), Considerando que PP2A-B56γ-MEFs foram capazes de passar por mitose (painel inferior). Guarnição cromossómica ou mis segregação pode ser vista em PP2A-B56γ-MEFs indicados por setas amarelas no painel inferior. Barra de escala = 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ciclo celular controle postos de controle que garantem a segregação do cromossomo precisa evitar aneuploidia e célula transformação 1,2,3. No presente estudo, encontramos essa inativação de PP2A-B56γ resultou em um posto de montagem do eixo enfraquecido. Imagem de célula viva nos permitiu observar a segregação de mis cromossômica durante a mitose em MEFs PP2A-B56γ tratados com nocodazole 9.
Este protocolo utiliza a etiqueta Histone2B-GFP gerada pela tecnologia BacMam 2.0 para cromossomos de rótulo para a imagem latente de células vivas. Um dos passos críticos na rotulagem é calcular certa quantidade de partículas por células (PPC) para alcançar suficiente rotular. Verificou-se através de titulação que PPC 10-50 funciona melhor. Este reagente pode ser tóxico para as células; Portanto, é necessário dosear PPC usado para atingir o equilíbrio entre marcação e toxicidade às células rotuladas. Também, esta é uma transfecção transiente e pode ser detectada apenas até 5 dias, portanto, não pode ser apropriado para estudos que justificariam a longos períodos de observação.
Tradicional marcação do DNA ou proteína pode exigir protocolos complicados, mas aqui usamos um reagente que requer apenas uma incubação overnight com células desejadas. Além disso, viver imagem latente da pilha foi realizada usando a fiação disco microscopia confocal que, ao contrário do laser confocal, microscopia eletrônica de varredura, é mais rápido e reduz a fototoxicidade e branqueamento efeitos do vida células 11. Este protocolo permite método fácil, conveniente rotular células mitóticas e visualizar a segregação cromossômica em comparação com as outras técnicas, tais como peixes, imuno-histoquímica e citometria de fluxo. Este protocolo também permite a captura de retardamento imagens de cromossomos durante a mitose, fornecendo informações complementares obtidas usando citometria de imunocitoquímica, peixe ou fluxo tradicional, tornando possível capturar os fenótipos tais como cromossomo no espaço e no tempo de atraso. Este protocolo permite conveniente, rápido e fácil de rotulagem de cromossomos em ampla variedade de linhas celulares, células primárias, células-tronco, neurônios e células T imortalizado 12,13,14.
Vários tipos de produtos de terapia celular estão sendo desenvolvidos com as esperanças para tratar doenças variadas condições 15. Um dos desafios enfrentados no desenvolvimento destas terapias celulares envolve preocupações de segurança devido a possibilidade de instabilidade genética e tumorigênese. Este protocolo descreve um método conveniente e fácil de cromossomos de rótulo em variedade de tipos de células. No futuro ele pode ser empregado para desenvolver um ensaio para estudar e medir a qualidade dos produtos de terapia celular e instabilidade genética.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Dr. Guo-Chiuan Hung e Dr. Bharatkumar Joshi comentários valiosos que melhorou o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
References
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