Summary
Denne protokol beskriver en nem og bekvem metode til at mærke og visualisere live kromosomer i mitotiske celler ved hjælp af Histone2B-NGL BacMam 2.0 etiket og et roterende disksystem Konfokal mikroskopi.
Abstract
Kromosomer skal være pålideligt og ensartet adskilt i datter celler under mitotiske celledeling. Troskab af kromosomale segregation styres af flere mekanismer, der omfatter spindel forsamling Checkpoint (SAC). SAC er en del af et kompleks feedback-system, der er ansvarlig for forebyggelse af en celle fremskridt gennem mitose, medmindre alle kromosomale kinetochores har vedhæftet en spindel mikrotubuli. Kromosomale halter og unormal kromosom segregation er en indikator for dysfunktionelle cellecyklus kontrol checkpoints og kan bruges til at måle genomisk stabilitet dividere celler. Deregulering af SAC kan resultere i omdannelsen af en normal celle i en maligne celler gennem akkumulering af fejl under kromosomale adskillelse. Gennemførelsen af SAC og dannelsen af den komplekse kinetochore er stramt reguleret af interaktioner mellem kinaser og fosfatase såsom Protein fosfatase 2A (PP2A). Denne protokol beskriver levende celle billeddannelse af halter kromosomer i mus embryonale fibroblaster isoleret fra mus, der havde en knockout af PP2A-B56γ lovgivningsmæssige subunit. Denne metode overvinder manglerne i andre cellecyklus kontrol billeddiagnostiske teknikker såsom flowcytometri eller immuncytokemi, kun giver et øjebliksbillede af en celle cytokinesis status, i stedet for en dynamisk spatiotemporelle visualisering af kromosomer under mitosen.
Introduction
I den følgende protokol beskriver vi en praktisk metode til at visualisere den kromosomale segregation og mitotiske progression i løbet af celle cyklus i mus embryonale fibroblaster ved hjælp af Histon 2B-normal god landbrugspraksis, BacMam 2.0 mærkning og levende celle imaging.
Cellecyklus kontrol checkpoints overvåge kromosom segregation og spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af den genetiske integritet i celle 1,2,3. Ophobning af mis segregeret kromosomer kan føre til aneuploidi, som er kendetegnende for mest solide tumorer 4. Derfor, påvisning af halter kromosomer kan bruges som en metode til at studere kromosomale ustabilitet.
Fluorescently mærket proteiner kan blive brugt til at visualisere live kromosom segregation og kromosomale halter men generation af mCherry-mærkede eller H2B-NGL markeret protein kræver betydelig viden om gen levering og molekylærbiologi 5. Her beskrives brug af CellLight Histone2B-NGL BacMam 2.0 reagens, herefter kaldet CL-HB regent, for nemheds skyld. Dette reagens kan anvendes umiddelbart og dermed eliminerer bekymringer om vektor kvalitet og integritet. Derudover kræver dette reagens ikke brug af potentielt skadelige behandlinger eller lipider og dye-loading kemikalier. I modsætning til konventionelle fluorescerende etiketter, CL-HB regent pletter uafhængigt af funktion (dvs., membran potentiale). CL-HB regent kan være blot tilføjet til cellerne og inkuberes natten over i protein udtryk. CL-HB regent replikere ikke i pattedyrceller og kan bruges i biosikkerhed (BSL) 1 laboratorium indstillinger. Også, dette forbigående Transfektion kan påvises efter natten inkubation i op til 5 dage, tid nok til at udføre mest dynamiske cellulære analyser.
Alternativt, kromosomafvigelser kunne studeres ved hjælp af forskellige teknikker såsom flowcytometri, immunhistokemi eller fluorescens i situ hybridisering (FISH) 6. Flowcytometri kan bruges til at studere aneuploidi, som kan måles baseret på DNA indhold og fasen af celler i celle cyklus. Selvom flowcytometri kan bruges til at måle aneuploidi, det ikke give oplysninger om kromosomale mis adskillelse. FISK og Immunhistokemi teknikker bruge fluorescerende sonder til at binde til DNA eller kromosomer. Mens disse teknikker giver et øjebliksbillede af status af en population af celler, tillader de ikke levende celle imaging dermed mangler oplysninger indhentet gennem spatiotemporelle visualisering af cytokinesis i bestemte celler fulgt over en periode.
Denne protokol blev brugt til at studere halter kromosomer eller kromosomal mis adskillelse i nocodazole behandlede mus embryonale fibroblaster (MEFs) isoleret fra PP2A-B56γ-mus. I tillæg til ovenstående program giver denne protokol et simpelt værktøj til at mærke og visualisere kromosomale adskillelse i forskellige celletyper, som kan bruges til at studere celle cyklus regulering eller kromosomal ustabilitet i tumorceller. Det kan desuden også bruges til at studere kromosomale ustabilitet forårsaget af forskellige medicinske behandlingsmetoder eller at studere virkningerne af genet knock ud resulterer i kromosomale mis adskillelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter udført i disse studier blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget på forskningsfacilitet Food and Drug Administration (FDA).
1. isolering og kultur af musen embryonale fibroblaster (MEFs)
- Isolere mus embryonale fibroblaster (MEFs) fra en PP2A-B56γ-mus stamme og vildtype littermates af standardprotokol 7,8,9.
- ExpandMEFs for 3 passager, fryse og opbevar indtil behov for eksperimenter 8.
2. dyrkningsbaserede Mefs i 2-godt Chambered Cover glas til Live Imaging
- Forberede 500 mL af MEF vækst medier indeholdende Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM/F12) med 10% føtal bovin Serum (FBS), 1 X Penicillin/Streptomycin antibiotika, L-glutamin (200 mM) og 1 X ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) i en 500 mL media flaske.
- Tø hætteglas af frosne MEFs fra vildtype og PP2A-B56γ-mus på passage 3 i pre varmede vandbad ved 37 ° C.
- Overføre optøede MEFs 15 mL rør og langsomt tilsættes dråbevis 20 mL DMEM/F12 medier til 15 mL rør ved hjælp af en 10-mL pipette.
- Overføre MEFs sammen med 20 mL af DMEM/F12 vækst medier i T75 kolber og udvide dem indtil cellerne er 70% sammenflydende. Confluency skønnes ved hjælp af en invers mikroskop på 4 x eller 10 x forstørrelse.
- Aspirat vækstmediet ved hjælp af et glas græs afpipetteres knyttet til et vakuum system i hætten, tilsættes 3 mL 0,25% trypsin/EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Tilføj 3 mL DMEM/F12 vækstmediet at stoppe reaktionen.
- Der centrifugeres cellerne ved lav hastighed (300 x g) i 5 min ved stuetemperatur. Forsigtigt fjerne supernatanten og genopslæmmes celle pellet i 1 mL DMEM/F12 vækstmediet pre varmes ved 37 ° C i et vandbad.
- Optælle celler ved hjælp af metoden trypan blå udstødelse eller andre passende celle tælle metode 8.
- Frø ca 20.000 MEFs/brønd i en 2-godt chambered dækslet glas. Tilføje 200 µL/brønd DMEM/F12 vækstmediet og tillade celler til at knytte ved at inkubere dem natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
3. synkronisering
- Synkronisere MEFs i G0/G1 fase ved at inkubere celler i DMEM/F12 vækst medier indeholdende 0,1% FBS i 24 timer, at få et maksimalt antal celler i G0/G1 fase.
Bemærk: Selvom serum sult blev brugt som en metode til præference, forskellige andre metoder kan bruges alt efter mitotiske scenen hvor celler er nødvendige for at blive arresteret 10.
4. mærkning
- Forberede 1,5 mg/mL stamopløsning af nocodazole i DMSO. Nocodazole arresterer celler på G2/M fase ved at hæmme mikrotubulus dannelse 10.
- Tre dage efter synkronisering, tilsæt 200 µL af vækstmediet (med 10% FCS), 200 ng/mL nocodazole og CL-HB regent (Histon 2B-NGL BacMam 2.0).
- Beregne CL-HB regent partikler Per celle (PPC) føjes til celler som følger:
Hvor antallet af celler er det anslåede samlede antal celler i forbindelse med mærkning, PPC er antallet af partikler Per celle, og 1 × 108 er antallet af partikler per mL af reagenset. For eksempel, at etiketten 20.000 celler med en PPC 30
Bemærk: CL-HB regent fungerer godt med de fleste celletyper mellem 10 og 50 PPC. Dog arbejdede 30 PPC bedst for denne undersøgelse. - Inkubér MEFs i 18 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: For den aktuelle eksperiment, visualisering af kromosomer i mitotiske celler flygter spindel forsamling checkpoint opstod 18 h efter celle cyklus anholdelse med nocodazole.
5. visualisering af halter kromosomer
- Visualisere mus embryonale fibroblaster (MEFs) ved hjælp af en roterende disk Konfokal mikroskop system udstyret med en miljømæssig kammer og en olie fordybelse, 63 x mål linse.
- Bruge excitation boelgelaengden 488 nm og emission bølgelængde 450 nm for normal god landbrugspraksis kanal billede erhvervelse.
- Bruge en roterende disk Konfokal mikroskop system med mulighed for motoriseret scanning stadier, Z-Piezo indsætter, fase-top inkubation og direkte fluorescens opsving efter foto blegning for denne teknik.
- En dag før imaging, drej Tænd miljømæssige kammer og varme op i hele salen ved 37 ° C natten over.
- Drej Tænd for mikroskopholderen, kamera, spinning disk enhed, illuminator, argon laser, computer og motoriserede Stadium.
- Lad systemet varme op 3 min; Start argon laser ved at dreje på tændingsnøglen. Skifte vippekontakt for argon laser fra "standby" til "laser run".
- Starte data erhvervelse og forarbejdning software.
- Indlede CO2 controller til fase top inkubator og indstille koncentrationen af CO2 på 5%. Dette skal ske før påbegyndelsen af billedbehandling.
- Fjerne den chambered cover glas fra rugemaskinen, og sted på scenen for visualisering. Visualisere celler via en olie fordybelse 63 x mål linse (NA1.4).
- Se gennem okulær linser, fokusere billedet og identificerer en celle i nukleare kuvert opdeling (NEBD) fase.
- Indlede passende laser (488 nm argon laser til at visualisere Histone2B-NGL).
- Åbn erhvervelse kontrolvinduet og indstillet eksponeringstid for normal god landbrugspraksis kanal. Identificer en celle, der er i NEBD.
- Manuelt bestemme målcellens top og bund brændplanet, og Angiv xyz optiske skære-indstillinger.
- Iagttage det i 20 min.; Hvis cellen ikke fortsætte gennem celledeling, stoppe billede erhvervelse efter 20 min og gå videre til den næste celle, der er i NEBD.
- Ca 1 time per celle er nødvendig for at billedet halter kromosomer under mitosen i PP2A-B56γ-celler, der undslap fra SAC. Hvis du vil hente data for en film, tage billeder hver 3 min.
Bemærk: Wild type celler arrestere og komme videre ikke forbi NEBD når de behandles med nocodazole. - Gemme billeder i zvi filformat for yderligere analyse.
6. billede behandling og analyse
Bemærk: Udføre tre-dimensionelle billedbehandling og analyse ved hjælp af alle tilgængelige software som Axiovision version 4.8.2 eller Imaris version 8.2. For denne undersøgelse at ImageJ blev software brugt.
- Åbne en billedsekvens. Hvis billederne er allerede i en stak format, fortsætte til næste trin. Hvis ikke, kombinere alle relevante billeder i en stak ved hjælp af ' Image > stakke > billeder til stak ' i menulinjen.
- Udføre justeringer efter behov til lysstyrke/kontrast og niveauer.
- Sådan føjes et tidsstempel til filmen:
- Gå til ' Image > stakke > etiket...' i menulinjen.
- Vælg det korrekte format, tid startværdien og tidsintervallet mellem hvert billede.
- Afkryds boksen 'Preview' og justere indstillingerne for placering og format. Tryk på 'OK' at anvende tidsstemplet.
- Føje en skalalinjen til filmen:
- Placere den billed skalering "Analyze > angive skala ' i menulinjen.
- I feltet 'Afstand i pixel' Angiv et antal pixels, hvor afstanden er kendt, og angiv afstanden i feltet 'Kendt afstand'. Sæt den korrekte enhed af længde til afstanden, fxi µm. Tryk 'OK' at anvende skalaen på stakken.
- Gå til "Analyze > værktøjer > skala bar... ' tilføje skalalinjen. Indstille størrelsen af baren som 'Bredde i µm', og justere de resterende formateringsindstillinger som passende. Afkryds boksen 'Mærke alle skiver' for at tilføje skalalinjen til hele stakken.
- Gennemse filmen ved at klikke på den trekantede afspilningsknappen på nederste venstre kant i billedvinduet. Justere frame rate ved hjælp af ' Image > stakke > Animation > Animation valgmuligheder i menu advokatstanden.
- Eksportere movie-fil ved at vælge ' fil > Gem som > AVI...' og vælg den billedhastighed og komprimering.
- Tryk på 'OK' for at vælge Gem placering og et filnavn. Tryk 'Gem' for at gemme filmfilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MEFs fra vildtype og PP2A-B56γ-mus var seedede i en 2-godt kammer dække glas og lov til at vedhæfte. På dag 2, MEFs blev synkroniseret med 0,1% FBS i 24 timer. På dag 3, MEFs i medier med 200 ng/mL nocodazole og 30 PPC CL-HB regentwere inkuberes i 18 timer ved 37° C og 5% CO2. Dag 4, blev cellerne afbildet ved hjælp af en roterende disk Konfokal mikroskop system (figur 1). Live celle imaging blev brugt til at visualisere skæbnen af individuelle celler, som de skred fra NEBD gennem mitosen (figur 2). Nocodazole er kendt for at anholde vildtype celler på G2M fase ved at forstyrre mikrotubulus dannelse. Det blev observeret at post nocodazole behandling vildtype celler blev anholdt på metafase øverste panel (figur 2). Vi observerede, at manglen på PP2A-B56γ svækket kontrolelementet celle cyklus, som tillod PP2A-B56γ-MEFs at overvinde celle cyklus anholdelse induceret af nocodazole 9. Derudover blev unormal kromosomale adskillelse opdaget i 62% (13 ud af 21) af mitotiske PP2A-B56γ-MEFs behandles med nocodazole (vist med gule pile i nederste panel i figur 2). Fem af PP2A-B56γ-MEFs anholdt på NEBD og 3 gik igennem mitosen uden observerbare defekter. Derimod alle 21 vilde type celler, der var afbildet fortsætte ikke gennem mitosen og fandtes at være arresteret af metafase (øverste panel figur 2).
Figur 1 . Standardrutediagram for levende celle imaging. MEFs fra vildtype og PP2A-B56γ-mus var seedede i en 2-godt chambered cover glas natten over. Dag 2, celler blev synkroniseret med 0,1% FBS for 24 h. dag 3, celler blev behandlet med 200 ng/mL nocodazole i vækst medier og normal god landbrugspraksis-30 PPC Histon 2B, BacMam 2.0 reagens for 18 h. dag 4 celler blev afbildet ved hjælp af spinning disk Konfokal mikroskop system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kromosomafvigelser registreres i PP2A-B56γ-MEFs. Tid bortfalder mikroskopi levende billeder taget på forskellige tidspunkter i mitosen (0-51 min) af nocodazole behandlet vildtype og PP2A-B56γ-MEFs. Vildtype celler blev anset for at være arresteret i metafase (øverste panel), der henviser til, at PP2A-B56γ-MEFs var i stand til at gå gennem mitosen (nederste panel). Kromosomale halter eller mis adskillelse kan ses i PP2A-B56γ-MEFs vist med gule pile i nederste panel. Skalalinjen = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellecyklus kontrol checkpoints, der sikrer nøjagtig kromosom segregation forhindre aneuploidi og celle transformation 1,2,3. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi at inaktivering af PP2A-B56γ resulterede i en svækket spindel forsamling checkpoint. Levende celle imaging tillod os at observere kromosomale mis segregation under mitosen i PP2A-B56γ MEFs behandlet med nocodazole 9.
Denne protokol udnytter Histone2B-NGL etiket genereret af BacMam 2.0 teknologi til etiketten kromosomer for levende celle billeddannelse. En af de afgørende trin i mærkning beregning af rette mængde partikler pr. celler (PPC) at opnå en tilstrækkelig mærkning. Det blev fundet gennem titrering, 10-50 PPC virker bedst. Dette reagens kan være giftigt for celler; Derfor er det nødvendigt at titrere PPC bruges til at opnå balance mellem mærkning og toksicitet for de mærkede celler. Også, dette er en forbigående Transfektion og kan påvises kun op til 5 dage, derfor kan det ikke være hensigtsmæssigt for undersøgelser, der ville berettige længere observation.
Traditionelle tagging af protein eller DNA kan kræve kompliceret protokoller, men her bruger vi et reagens, der kræver kun en natten inkubation med ønskede celler. Derudover lever celle imaging blev udført ved hjælp af spinning disc Konfokal mikroskopi, som i modsætning til Konfokal laser scanning mikroskopi er hurtigere og reducerer fototoksicitet og blegning effekter i levende celler 11. Denne protokol giver mulighed for nem og bekvem metode til at mærke mitotiske celler og visualisere kromosomale adskillelse i forhold til de andre teknikker såsom fisk, immunhistokemi og flow flowcytometri. Denne protokol tillader også erobringen af halter kromosomer billeder i hele mitosen leverer yderligere oplysninger til der opnås ved hjælp af traditionelle immuncytokemi, fisk eller flow flowcytometri, hvilket gør det muligt at fange fænotyper sådanne som halter kromosom i både tid og rum. Denne protokol tillader nem, hurtig og let mærkning af kromosomer i bred vifte af cellelinjer, primærelementer, stamceller, neuroner og udødeliggjort T-celler 12,13,14.
Forskellige typer af celleterapi udvikles med håb om at behandle varieret sygdom vilkår 15. En af de udfordringer i udviklingen af disse celle behandlinger indebærer sikkerhedsproblemer på grund af muligheden for genetiske ustabilitet og tumordannelse. Denne protokol beskriver en praktisk og nem metode til etiketten kromosomer i forskellige celletyper. Det kunne i fremtiden anvendes til at udvikle en analyse for at undersøge og måle genetiske ustabilitet og kvaliteten af celleterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Guo-Chiuan Hung og Dr. Bharatkumar Joshi for værdifulde kommentarer, at forbedret håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
References
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, 966-980 (2012).
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
