Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון

doi: 10.3791/57406 Published: March 29, 2018

Summary

כאן נתאר שיטת הדמיה כולה-הר ברזולוציה גבוהה בעור האוזן והעכבר כולו למבוגרים, אשר מאפשרת לנו לדמיין מורפוגנזה מסעף והמתבנת של העצבים ההיקפיים, כלי הדם, כמו גם התפלגות תא החיסון.

Abstract

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של עור האוזן למבוגרים כולה-הר של הדמיה טכניקה ללמוד מקיף תלת מימדי מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית ו המתבנת, וכן חלוקת תא החיסון ברמה התאית. הניתוח של היקפי עצבים, כלי דם מבנים אנטומיים של רקמות בוגרות מספק כמה תובנות להבנת חיווט נוירו-וסקולרית פונקציונלי והתנוונות נוירו-וסקולרית במצבים פתולוגיים כגון ריפוי הפצע. כמערכת מודל מאוד אינפורמטיבי, אנחנו התמקדו המחקרים שלנו בעור האוזן למבוגרים, אשר נגיש עבור ניתוח. פרוטוקול לשחזור ופשוט שלנו מספק תיאור מדויק של הרכיבים הסלולר של העור כולו, כגון העצבים ההיקפיים (אקסונים סנסוריים, סימפטי אקסונים ו תאי שוואן), כלי הדם (תאי אנדותל ותאים השריר החלק בכלי הדם ), ותאים דלקתיים. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יסלול את הדרך לחקור ליקויים מורפולוגי של העצבים וכלי הדם, כמו גם הדלקת בעור האוזן למבוגרים תחת מצבים פתולוגיים שונים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העור מורכב משלוש שכבות: אפידרמיס, דרמיס ובהיפודרמיס. זה שימש כמערכת מודל לחקר תאי גזע תחזוקה, בידול, מורפוגנזה פיתוח וכן התחדשות, tumorigenesis, וכן דלקת למבוגרים. העור הוא בעושר vascularized, innervated כך ההתפתחות של מערכת העצבים ההיקפית, מערכת כלי הדם היא מתואמת היטב.

בעבר הראו טכניקת דימות של העור מתחלקים כולה-הר עם תיוג מרובים ללמוד העצבים ההיקפיים שלמים וכלי הדם כולל את מרכיבי התא1,2,3, 4: אקסונים סנסוריים אקסונים סימפטי, שוואן תאי העצבים, תאי אנדותל, pericytes, תאי השריר החלק בכלי הדם (VSMCs) בכלי הדם. במהלך האנגיוגנזה, רשת נימי הראשי עובר שיפוץ כלי הדם אינטנסיבית ומפתחת היררכי לרשת מסתעפים כלי הדם. פיתוח הדרמיס/ובהיפודרמיס, העורקים הסניף לצד העצבים החישה היקפיים וורידים מכן יוצרים הסמוכים העורקים. אחרי היררכי לרשת כלי הדם יהיה מכוסה היטב עם VSMCs, העצבים הסימפתטית להאריך לאורך, innervate כלי דם גדולים בקוטר1,5,6. למרות החשיבות של האגודה קרוב בין מערכות עצבים וכלי פיתוח, שאלה גדולה כבר להתייחס מה יקרה הרשתות נוירו-וסקולרית במצבים פתולוגיים שונים אצל מבוגרים. דימות ברזולוציה תלת מימדי יש צורך להעריך בפתוגנזה, מורפוגנזה מסעף לזיהוי אנטומית ו המתבנת.

מורפוגנזה עצביים ואת כלי הדם בעור עכבר מבוגרים בדרך כלל ניתוח על ידי רקמת סעיף מכתים. מחקרים אחרים השתמשו כולה-הר הדמיה של העור כדי להמחיש את העצבים וכלי הדם, בנוסף זקיקי שיער, בלוטות החלב, arrector pili השרירים7,8,9. עם זאת, עובי העור למבוגרים הפכה אותו קשה לנתח את העור מעל כל העומק שלה.

במחקר הנוכחי, פיתחנו הרומן דימות כולה-הר ברזולוציה של האוזן למבוגרים עור כדי להתגבר על האתגרים הללו. האוזן העור הוא נגיש עבור ניתוח והדמיה כולה-הר עוקבות של העור מעל כל העומק שלה. לכן שיטה פשוטה מאוד לשחזור שניתן להחיל כדי להשוות בין ארכיטקטורה תלת מימדי של מערכות היקפיות לחוץ ואת כלי הדם של העור, עם מדידות כימות מקיף. להדגים היישור של העצבים ההיקפיים חושית ואוהד עם כלי דם גדולים בקוטר נשמרת בעור מבוגר. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג באופן חזותי מורפוגנזה מסעף, את המתבנת של העצבים ההיקפיים, כלי הדם, כמו גם את התפלגות תא החיסון ברמה התאית במודלים של העכבר מבוגרים בתנאים שונים כגון דלקת ו התחדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הניסויים בסעיף זה בוצעו תחת אישור מן הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (NHLBI) חיה אכפת לי שימוש הוועדה.

1. בגיר העכבר האוזן העור אוסף

  1. המתת חסד עכברים בוגרים על ידי חשיפה פחמן דו-חמצני (CO2) בתוך תא סגור ולאחר מכן לאשר את המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.
    הערה: הניסוי מלווה מנחה לאומי מכונים לבריאות (NIH) עבור שיטת המתת חסד.
  2. לנתח את האוזן מבסיס ולמקם אותו 35 x 10 מ מ2 פטרי המכילות 2 מ"ל מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק). בקצרה לקצץ שערות עם מספריים.
  3. לקלף את העור האחורי ועור הקדמי משם בקפידה הסחוס להתערב.
    הערה: סחוס מייחסת העור הקדמי.
  4. להעביר את ישבנה ואת העור הקדמי בנפרד כדי בגודל 24 טוב לוח המכיל 1 מ"ל של קרח טרי 4% paraformaldehyde (PFA) בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לכל טוב. לרדד את העור האחורי ו הקדמי של ארבעה אחוזים מחברים.
  5. לתקן את העור האחורי ו הקדמי עם סחוס ב 4 ° C עבור 1 h.
  6. לשטוף את העור האחורי ו הקדמי 3 פעמים במשך 5 דקות ב- 1 מ"ל של PBS עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.
  7. להעביר את העור האחורי ו הקדמי עם הסחוס התחתון של 35 x 10 מ מ2 פטרי. חתוך את אזור הבסיס, אשר הוא מקופל יש שומן ואת רקמות החיבור. לקלף את הסחוס של העור הקדמי באמצעות מלקחיים מעוקל בסדר.
  8. הסר בזהירות את השערות, רקמות adipose ואת רקמות החיבור מהחלק הפנימי של העור האחורי בעזרת פינצטה מעוקל משובחים. לשמור על עור רטוב עם PBS.

2. כולה-הר נוגדן של העכבר האוזן העור

הערה: כל הניסויים בסעיפים הבאים בוצעו בהתאם להנחיות הבטיחות מעבדה NIH.

  1. הכנת המאגר חסימה. מסנן חום 10% לא פעיל עז סרום (HIGS) מדולל ב- PBS עם טריטון 0.2% מאגר חסימה X-100 (TX-100), או 10% חמור סרום (DS) מדולל ב- PBS עם 0.2% מאגר חסימה TX-100, באמצעות יחידת מסנן 0.45 מיקרומטר.
  2. להעביר את הצד האחורי, העור הקדמי כדי בגודל 24 צלחת טוב המכיל 1 מ"ל של 10% HIGS מאגר חסימה או מאגר חסימה של DS 10% לכל טוב. דגירה על העור למשך 30 דקות עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.
  3. להכין את הפתרון נוגדן ראשוני על ידי דילול הנוגדנים הראשי (טבלה של חומרים) במאגר חסימה (או 10% HIGS או 10% DS).
    הערה: כל-mout immunohistochemical ניתוח של האוזן למבוגרים עור עם נוגדנים לכיתה ספציפית נוירון סמן פאן עצבית השלישי β-טובולין (Tuj1, ארנב polyclonal IgG או בעכבר monocloncal IgG2a, דילול שבערך על הריכוז הסופי של 2 µg/mL). תאי אנדותל-פאן סמן טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה 1 (PECAM-1, אוגר monoclonal איג, 1:300 דילול-הריכוז הסופי של 3.3 µg/mL), מעטפת המיאלין סמן המיאלין הבסיסי חלבון (MBP, ארנב polyclonal איג, 1:200 דילול ב הריכוז הסופי של 5 µg/mL), סמן דלקתיות התאים מיאלואידית CD11b (עכברוש IgG2b monoclonal, 1:50 דילול-הריכוז הסופי של 20 µg/mL) הוצג באיור 1 ו- 2 איור. העור, נדגרה עם נוגדנים Cy3 מצומדת על השריר החלק בכלי הדם תא סמן α שריר חלק אקטין (αSMA) יחד עם נוגדנים משניים (2.6). הנוגדנים הראשית נבדקו על-ידי עצמנו נרשמו בטבלה שלחומרים. יכול להיות מעורב מספר נוגדנים העיקרי נגזר מינים שונים בו זמנית.
  4. להעביר את עור אחורי, קדמי באר חדשה המכילה 150 µL של הפתרון העיקרי נוגדנים. דגירה העור תוך ערבוב עדין על מערבל ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. למחרת, להעביר את עור אחורי, קדמי בארות חדשות בצלחת טוב 24 או תשאף המאגר חסימה המכיל נוגדנים העיקרי. להוסיף 1 מ"ל או 2% HIGS מדולל ב- PBS עם מאגר כביסה TX-100 0.2% או 2% DS מדולל ב- PBS עם מאגר כביסה TX-100 0.2%. לשטוף את העור עם שינויים 3 המאגר כביסה בכל 15 דקות עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.
  6. להכין את הפתרון נוגדנים משניים (טבלה של חומרים). לדלל נוגדנים משניים במאגר חסימה (או 10% HIGS או 10% DS) ומסנן המאגר חסימה המכיל נוגדנים משניים דרך 0.22 מיקרומטר polyvinylidene difluoride (PVDF) ממברנה מזרק פילטר מחובר מזרק 1 מ"ל.
    הערה: אלקסה 488 או מצומדת 633 עז ארנב אנטי איג (H + L) או עכבר IgG2a עבור Tuj1, אוגר נגד עז מצומדת אלקסה 647 IgG (H + L) אנטי-ארנב PECAM-1, 488 אלקסה מצומדת עז IgG (H + L) עבור MBP, ושימשו עכברוש מצומדת אלקסה 594 IgG (H + L) עבור CD11b עם דילול 1:250-הריכוז הסופי של 8 µg/mL. העור, נדגרה עם נוגדנים αSMA מצומדת Cy3 (דילול שבערך על הריכוז הסופי של 2-3 µg/mL) בשילוב עם נוגדנים משניים אלה.
  7. Centrifuge הפתרון ב 13,000 g x 10 דקות להסיר חלקיקים צבורים של נוגדנים משניים מתוך המאגר חסימה.
    הערה: שונה פלורסנט מצומדת משני נוגדנים נגזר מינים שונים יכול להיות מעורב בו זמנית.
  8. העבר את העור האחורי ו הקדמי טוב המכיל 150 µL של הפתרון נוגדנים משניים. לעטוף את הצלחת היטב 24 בנייר אלומיניום כדי למנוע אור דגירה את העור h 1 עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.
  9. להעביר את עור אחורי, קדמי בארות חדשות בצלחת טוב 24 או תשאף הפתרון נוגדנים משניים על-ידי pipet לחלוטין. להוסיף 1 מ"ל של מאגר כביסה HIGS 2% או 2% DS כביסה מאגר.
  10. לעטוף את הצלחת היטב 24 בנייר אלומיניום ולשטוף בשינויים 3 המאגר כביסה בכל 15 דקות עם ערבוב עדין על מערבל בטמפרטורת החדר.

3. הרכבה את העור האוזן בשקופית

  1. מקם את העור על החלק התחתון של 35 x 10 מ מ2 פטרי. הסר בזהירות את שערות רקמות adipose, רקמות החיבור, dusts, הסיבים מהחלק הפנימי של העור בעזרת מלקחיים מעוקל בסדר תחת stereomicroscope עם תאורה נמוכה כדי למזער תמונה מקיפה הלבנה. לשמור על עור רטוב עם PBS.
  2. להעביר את העור שקופיות מיקרוסקופ דבק באמצעות מלקחיים. מקם את העור האחורי ו הקדמי עם הפנימי כלפי מעלה בשקופית. לשטח העור בעזרת מלקחיים.
  3. הר העור במדיום הרכבה לדעוך אנטי נוזלית כדי להימנע photobleaching ולשמר אותות פלואורסצנט. ודא כי אין בועות אוויר הם בערך בהעור.
  4. מכסה עם coverslip על הדגימות העור בזהירות, לאחסן השקופיות לדוגמה את העור הנטען הלילה חשוך בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר את שהתקשורת הרכבה לקבל המשרד. לסגור את coverslip אל השקופית עם לק ואחסן אותו ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.

4. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. כוונן המתאים לייזרים של fluorophores. מיקרוסקופ קונפוקלי עם שלושה מקורות לייזר (ארגון 488 ננומטר, DPSS 561 ננומטר, הנה 633 ננומטר) משמש בניסוי זה.
  2. השתמש בכלי הסריקה רציפים, אשר בו זמנית מרגש דגימות שהוכתמו שלוש פעמים, כדי למנוע ולהפחית בחפיפה.
    הערה: תמונות תועבר באופן רציף באמצעות מצב סריקה רציפים.
  3. תמונה תחת מטרה X 10. השתמש בכלי הסריקה אריח כדי ללכוד את העור כל אוזן. הגדר Z-מחסנית וודא כי z-המיקום מכסה את כל עובי העור האוזן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עור אחורי האוזן העכבר למבוגרים (איור 1 א') והעור באוזן קדמית (איור 1B) היו immunostained עם נוגדנים αSMA (אדום), Tuj1 (ירוק), ו- PECAM-1 (כחול). העור האחורי היה immunostained ללמוד נוירו-החיסון הפצה באמצעות נוגדנים CD11b (אדום) ו MBP (ירוק), יחד עם Tuj1 (כחול) (איור 2 א). חלוקת CD11b+ תאים דלקתיים, כולל מקרופאגים זוהה ברזולוציה הסלולר יחיד (איור 2B).

Figure 1
איור 1: יישור ofperipheral העצבים וכלי הדם בעור האוזן למבוגרים. כולה-הר immunofluorescence טריפל מיקרוסקופיה קונפוקלית של האוזן האחורי ו הקדמי עור עם נוגדנים αSMA (אדום), Tuj1 (ירוק), PECAM-1 (כחול) מוצגים. (א) מכוסה VSMC גדול-קוטר כלי הדם להתיישר עם העצבים ההיקפיים בעור האוזן האחורי. (B) קטן יותר-קוטר כלי הדם מכוסה VSMCs להתיישר עם קוטר קטן במערכת העצבים ההיקפית חבילות בעור האוזן הקדמי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Myelination של העצבים ההיקפיים, CD11b+ תא מיאלואידית הפצה בעור האוזן למבוגרים. Immunofluorescence טריפל כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית של עור אחורי האוזן עם נוגדנים CD11b (אדום) ו- MBP (ירוק), יחד עם Tuj1 (כחול), מוצג. (א) בינוניים וגדולים קוטר העצבים ההיקפיים הם סיבי העצב. (B) תקריב תמונה ב- (א). CD11b+ תאים דלקתיים פזר באופן שווה בעור האוזן האחורי. סרגל קנה מידה = 1 מ מ (א), 100 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מתאר את כולה-הר immunonohistochemical הדמיה של האוזן למבוגרים עור לניתוח של המבנים הנוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון. אנו מאמינים שבשיטה זו יש יתרונות רבים ניסיוני לחוקרים ללמוד מורפוגנזה מסעף ו את המתבנת של העצבים וכלי הדם, כמו גם תלת מימדי הפצה של רכיבי העור כולל תאים חיסוניים ושיער זקיקי. ניתן לכמת את התוצאות של ההדמיה באמצעות תוכנות דימות לצורך ניתוח כמותי נוסף.

הכנה נכונה של העור האוזן הינה קריטית להצלחת פרוטוקול זה. ראשית, בעור האוזן צריך גזור בקפידה זמן קצר לאחר המתות חסד העכבר. החלק האחורי של העור האוזן צריך לקלף מן הסחוס. לאחר מכן, הסחוס צריך לקלף מן העור הקדמי לפני צביעת. שנית, רקמות החיבור, רקמות adipose ו שערות צריך להסיר בעדינות וביסודיות לפני הרכבה. בשל קיומה של העצבים ההיקפיים על פני השטח של העור, הסרת זהירות נדרשת כדי למנוע נזק העצבים. שלישית, האוזן העור צריך להיות פרש עם ההסרה של כמה רקמות העור האוזן עבה. לבסוף, העור האוזן צריך להיות שטוח רכוב ללא בועות אוויר.

מגבלה אחת של פרוטוקול זה הוא מתויג אוזן לאוזן העור אינו מתאים לניתוח כמו האוזן תג גורם חור או צלקת. לכן, זיהוי של עכברים באמצעות שיטות שונות תג האוזן כמו תיוג על הזנב הוא הכרחי במקרה ישנם עכברים מרובים כדי לנתח.

ניתן לסרוק בעור האוזן כולו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית עם כלי סריקה אריח, למרות דיווחים קודמים הדגימו כי אזור עניין יכול לדימות עם רזולוציה גבוהה10. מעניין, חושף ההדמיה כולה-הר של העור כולו אוזן מורפוגנזה מסעף ברורים ואת המתבנת של העצבים וכלי הדם בין העור האחורי ו הקדמי (איור 1): לעור האחורי יש קוטר גדול עצבים חבילות (20 – 50 מיקרומטר) מיושר עם כלי הדם קוטר גדול ומשופץ, מכוסה αSMA+ VSMCs (20-60 מיקרומטר), בעוד הקדמי העור יש עצב בקוטר קטן יותר חבילות (< 20 מיקרומטר) מיושר עם קוטר קטן יותר אך שופצה כלי דם מכוסה αSMA+ VSMCs (< 20 מיקרומטר).

ישנם מספר מודלים העכבר11 כדי להבהיר את המנגנון של מחלות עור האדם כגון אטופיק דרמטיטיס12, פסוריאזיס13, פצע ריפוי14ונוירופתיה סוכרתית15יוצא מן הכלל. אנו החילו לפרוטוקול זה על העור האוזן של דיאטה-induced ההשמנה עכברים, הקלד 2 בעכברים סוכרתיים ללמוד נוירופתיה סוכרתית16. פרוטוקול זה ניתן להחיל מ לנוער למבוגרים העכבר העור בתנאים פתולוגיים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ק' גיל לניהול מעבדה, תמיכה טכנית, ג'יי הוקינס, הצוות של נבחרת מכונים לבריאות (NIH) בניית מתקן בעלי חיים 50 על הסיוע עם העכבר, והטיפול ר ריד, פ Baldrey לסיוע מינהלי. תודה גם Motegi ס ו מ Udey עבור שיתוף שלהם האוזן העור לנתיחה פרוטוקול, כוויות (ש ע) עזרה העריכה, חברים של המעבדה של תאי גזע וביולוגיה נוירו-וסקולרית לקבלת עזרה טכנית ודיון מתחשב. ט יאמזאקי נתמכה על ידי החברה יפן עבור NIH-KAITOKU קידום המדע (JSPS). עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחקר מגזר של הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (HL005702-11 כדי עיון)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-β-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
  3. Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. (2011).
  4. Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
  5. Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
  6. Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
  7. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. e51749 (2014).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. (2017).
  9. Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
  10. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
  11. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
  12. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
  13. Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
  14. Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
  15. O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
  16. Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).More

Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter