Summary
Qui, descriviamo un metodo di imaging intero-monta ad alta risoluzione nella pelle dell'orecchio intero topo adulto, che consente di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e patterning di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni.
Abstract
Qui, presentiamo un protocollo di una pelle dell'orecchio dell'adulto intero-monta imaging tecnica per studiare la morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare tridimensionale completa e patterning, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare. L'analisi della periferiche strutture anatomiche del nervo e dei vasi sanguigni nei tessuti adulti fornisce alcuni spunti per la comprensione della funzionale neuro-vascolare cablaggio e degenerazione neuro-vascolare in condizioni patologiche come la guarigione della ferita. Come sistema modello altamente informativo, abbiamo concentrato i nostri studi sulla pelle dell'orecchio dell'adulto, che è facilmente accessibile per la dissezione. Il nostro protocollo semplice e riproducibile fornisce una rappresentazione accurata dei componenti cellulari della pelle intera, come i nervi periferici (assoni sensoriali, simpatici assoni e le cellule di Schwann), vasi sanguigni (cellule endoteliali e cellule muscolari lisce vascolari ) e cellule infiammatorie. Crediamo che questo protocollo spianerà la strada per studiare le anomalie morfologiche in nervi periferici e dei vasi sanguigni così come l'infiammazione della pelle dell'orecchio dell'adulto sotto diverse condizioni patologiche.
Introduction
Pelle è composto da tre strati: l'epidermide, derma e ipoderma. È stato utilizzato come sistema modello per studiare il mantenimento delle cellule staminali, la differenziazione e la morfogenesi in sviluppo come pure la rigenerazione, tumorigenesi e infiammazione in adulto. Pelle è riccamente vascolarizzata ed innervata tale che lo sviluppo del sistema nervoso periferico e sistema vascolare è ben coordinato.
Precedentemente abbiamo dimostrato una tecnica di imaging intero-monta embrionale della pelle con l'etichettatura più per studiare i nervi periferici intatti e vasi sanguigni, compresi i loro componenti cellulari1,2,3, 4: assoni sensoriali, simpatici assoni, cellule in nervi Schwann, cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) nei vasi sanguigni. Durante il processo di angiogenesi, una rete capillare primaria subisce intensivo rimodellamento vascolare e si sviluppa in una rete gerarchica di ramificazione vascolare. In sviluppo derma/ipoderma, arterie ramificano al fianco di vene e nervi sensoriali periferici quindi formano adiacenti alle arterie. Dopo la rete vascolare gerarchica è completamente ricoperta di VSMCs, nervi simpatici si estendono lungo e innervano i vasi sanguigni di grande diametro1,5,6. Nonostante il significato in stretta associazione tra i sistemi nervosi e vascolari in via di sviluppo, è stata una questione importante per affrontare ciò che accade alle reti neuro-vascolare in varie situazioni patologiche negli adulti. La formazione immagine tridimensionale ad alta risoluzione è necessaria apprezzare la patogenesi, insieme a morfogenesi di ramificazione anatomicamente riconoscibile e patterning.
Morfogenesi neuronale e vascolare nella pelle del topo adulto è comunemente analizzata macchiando tessuto sezione. Altri studi hanno utilizzato intero-monta la formazione immagine della pelle per visualizzare i nervi periferici e vasi sanguigni, oltre ai follicoli piliferi, ghiandole sebacee e arrector pili muscoli7,8,9. Tuttavia, lo spessore della pelle adulta ha reso difficile analizzare la pelle nel corso di tutta la sua profondità.
Nello studio presente, abbiamo sviluppato un romanzo imaging ad alta risoluzione di intero-monta della pelle dell'orecchio dell'adulto per vincere queste sfide. Pelle dell'orecchio è facilmente accessibile per la dissezione e la formazione immagine intero-monta successiva della pelle nel corso di tutta la sua profondità. Così, è un metodo semplice e altamente riproducibile che possa essere applicato per confrontare l'architettura tridimensionale dei sistemi nervosi e vascolari periferici nella pelle, con misurazioni di quantificazione completa. Abbiamo dimostrato che l'allineamento dei nervi periferici sensoriali e simpatici con i vasi sanguigni di grande diametro è conservato nella pelle adulta. L'obiettivo del presente protocollo è quello di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare in modelli di topo adulto in varie condizioni quali l'infiammazione e rigenerazione.
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Protocol
Tutti gli esperimenti in questa sezione sono stati eseguiti sotto approvazione dal National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI) Animal Care e Comitato di uso.
1. adulto Mouse orecchio pelle collezione
- Eutanasia di topi adulti tramite l'esposizione di anidride carbonica (CO2) in una camera chiusa e quindi confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale.
Nota: L'esperimento segue la Guida di riferimento di National Institutes of Health (NIH) per il metodo di eutanasia. - Sezionare l'orecchio dalla base e metterlo in un 35 x 10 mm2 capsula di Petri contenente 2 mL di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS). Brevemente tagliare i capelli con le forbici.
- Sbucciare la pelle posteriore e anteriore pelle distanza attentamente dalla cartilagine intermedio.
Nota: Cartilagine si attacca alla pelle anteriore. - Trasferire la parte posteriore e anteriore della pelle separatamente a un 24 ben piastra contenente 1 mL di ghiacciata fresca 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) per pozzetto. Appiattire la pelle anteriore e posteriore a 4% PFA.
- Fissare la pelle anteriore e posteriore con cartilagine a 4 ° C per 1 h.
- Lavare la pelle anteriore e posteriore 3 volte per 5 min in 1 mL di PBS con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.
- Trasferire la pelle anteriore e posteriore con cartilagine alla parte inferiore di un 35 x 10 mm2 piastra di Petri. Tagliare la regione della base, che è piegato e ha adiposo e connettivo. Staccare la cartilagine dalla pelle anteriore utilizzando una pinzetta curva.
- Dall'interno della pelle posteriore con Pinzette curve bene, togliere i peli, tessuti adiposi e tessuti connettivi. Mantenere la pelle umida con PBS.
2. la macchiatura di Immunohistochemical intero-monta della pelle dell'orecchio del topo
Nota: Tutti gli esperimenti nelle sezioni che seguono sono stati eseguiti in conformità con le direttive di sicurezza di laboratorio NIH.
- Preparare il tampone di bloccaggio. Siero di capra filtro 10% calore inattivato (Villa) diluito in PBS con 0,2% triton tampone bloccante X-100 (TX-100), o 10% di siero di asino (DS) diluito in PBS con 0,2% tampone bloccante TX-100, utilizzando un filtro da 0,45 µm.
- Trasferire la parte posteriore e anteriore della pelle a un 24 ben piastra contenente 1 mL di tampone di bloccaggio Villa 10% o 10% tampone bloccante di DS per pozzetto. Incubare la pelle per 30 min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo gli anticorpi primari (Tabella materiali) in tampone bloccante (entrambi 10% Villa o 10% DS).
Nota: Intero-mout l'analisi di immunohistochemical della pelle dell'orecchio dell'adulto con gli anticorpi di classe di neurone-specific marcatore pan-neuronale III β-tubulina (Tuj1, monocloncal mouse o IgG policlonale IgG2a coniglio, diluizione 1: 500 alla concentrazione finale di 2 µ g/mL), molecola di adesione Pan-endothelial delle cellule marcatore della piastrina delle cellule endoteliali 1 (PECAM-1, criceto monoclonale IgG, diluizione di 1: 300 alla concentrazione finale di 3,3 µ g/mL), proteina di base del fodero di myelin marcatore della mielina (MBP, coniglio IgG policlonale, diluizione 1: 200 al concentrazione finale di 5 µ g/mL) e indicatore infiammatorio delle cellule mieloidi CD11b (Rat monoclonali IgG2b, 01:50 diluizione alla concentrazione finale di 20 µ g/mL) è stata indicata nella Figura 1 e Figura 2. La pelle è stata incubata con l'anticorpo coniugato con Cy3 per actina di muscolo liscio α marcatore di muscolo liscio vascolare delle cellule (αSMA) insieme con gli anticorpi secondari (2,6). Gli anticorpi primari testati da noi stessi sono stati elencati nella Tabella materiali. Gli anticorpi primari multipli derivati da specie diverse possono essere mescolati contemporaneamente. - Trasferire la pelle anteriore e posteriore al nuovo pozzo contenente 150 µ l della soluzione di anticorpi primari. Incubare la pelle con miscelazione delicata su un mixer a 4 ° C durante la notte.
- Il giorno seguente, trasferire la pelle anteriore e posteriore nuovi pozzi nella piastra di ben 24 o aspirare il tampone bloccante contenente anticorpi primari. Aggiungere 1 mL di o 2% Villa diluito in PBS con tampone di lavaggio di TX-100 0,2% o 2% DS diluito in PBS con tampone di lavaggio di 0,2% TX-100. Lavare la pelle con 3 cambi di tampone di lavaggio ogni 15min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di anticorpo secondario (Tabella materiali). Diluire anticorpi secondari in tampone bloccante (entrambi 10% Villa o 10% DS) e filtro sul blocco buffer contenente anticorpi secondari attraverso una siringa filtro 0,22 µm polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana collegato ad una siringa da 1 mL.
Nota: Alexa 488 o anti-coniglio di capra 633-coniugato IgG (H + L) o mouse IgG2a per Tuj1, del anti-criceto capra Alexa 647-coniugato IgG (H + L) per il anti-coniglio di capra PECAM-1, Alexa 488-coniugato IgG (H + L) per MBP, e ratto Alexa 594-coniugato IgG (H + L) per CD11b sono stati utilizzati con diluizione di 1: 250 alla concentrazione finale di 8 µ g/mL. La pelle è stata incubata con l'anticorpo coniugato con Cy3 αSMA (diluizione 1: 500 alla concentrazione finale di 2-3 µ g/mL) in combinazione con questi anticorpi secondari. - Centrifugare la soluzione a 13.000 x g per 10 min rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari da tampone bloccante.
Nota: Possono essere miscelati simultaneamente diversi anticorpi secondari coniugati fluorescenti derivati da specie diverse. - Trasferire la pelle anteriore e posteriore ben contenente 150 µ l della soluzione di anticorpi secondari. Avvolgere la piastra ben 24 in foglio di alluminio per evitare la luce e incubare la pelle per 1 h con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.
- Trasferire la pelle anteriore e posteriore nuovi pozzi nella piastra di ben 24 oppure aspirare la soluzione di anticorpo secondario di dispensare completamente. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di Villa 2% o 2% tampone di lavaggio DS.
- Avvolgere la piastra ben 24 in un foglio di alluminio e lavare con 3 cambi di tampone di lavaggio ogni 15min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.
3. montaggio la pelle dell'orecchio sulla diapositiva
- Posizionare la pelle sul fondo di un 35 x 10 mm2 piastra di Petri. Rimuovere con cura i peli, tessuti adiposi, tessuti connettivi, polveri e fibre dall'interno della pelle utilizzando una pinzetta curva sotto stereomicroscopio con scarsa illuminazione per ridurre al minimo fotografica ampia candeggio. Mantenere la pelle umida con PBS.
- Trasferire la pelle in un vetrino da microscopio adesivo usando il forcipe. Posizionare la pelle anteriore e posteriore con l'interno rivolto verso l'alto sulla diapositiva. Appiattire la pelle usando il forcipe.
- Montare la pelle in un mezzo liquido anti-dissolvenza montaggio per evitare il photobleaching e preservare i segnali fluorescenti. Assicurarsi che nessun bolle di aria sono su o intorno alla pelle.
- Coprire con vetrino coprioggetto sui campioni di pelle attentamente e memorizzare le diapositive di esempio pelle montato nel buia durante la notte a temperatura ambiente per consentire che il supporto di montaggio ottiene costante. Sigillare il coprioggetto alla diapositiva con smalto e conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.
4. microscopio confocale
- Impostare il laser appropriato per fluorofori. Un microscopio confocale con tre sorgenti laser (Argon 488 nm, DPSS 561 nm e HeNe 633 nm) viene utilizzato in questo esperimento.
- Utilizzare lo strumento di scansione sequenziale, che eccita contemporaneamente campioni triple-macchiato, per evitare e ridurre eventuali sovrapposizioni.
Nota: Le immagini saranno prese in modo sequenziale utilizzando la modalità di scansione sequenziale. - Immagine sotto un obiettivo 10x. Utilizzare lo strumento di analisi delle mattonelle per acquisire la pelle tutto l'orecchio. Impostare Z-stack e assicurarsi che la posizione z copre l'intero spessore della pelle dell'orecchio.
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Representative Results
Pelle di topo adulto posteriore dell'orecchio (Figura 1A) e pelle anteriore dell'orecchio (Figura 1B) immunostained con anticorpi anti-αSMA (rosso), Tuj1 (verde) e PECAM-1 (blu). Pelle posteriore era immunostained per studiare neuro-immunitario distribuzione utilizzando anticorpi anti-CD11b (rosso) e MBP (verde), insieme a Tuj1 (blu) (Figura 2A). Distribuzione di CD11b+ cellule infiammatorie, tra cui i macrofagi è stata rilevata a una sola risoluzione cellulare (Figura 2B).
Figura 1: allineamento ofperipheral nervi e vasi sanguigni nella pelle dell'orecchio dell'adulto. Intero-monta tripla immunofluorescenza confocale di pelle dell'orecchio anteriori e posteriori con anticorpi anti-αSMA (rosso), Tuj1 (verde), e viene mostrato PECAM-1 (blu). Vasi sanguigni (A), grande diametro VSMC-coperto allineare con i nervi periferici della pelle posteriore dell'orecchio. (B) più piccolo-diametro vasi sanguigni coperti con VSMCs allineare con i pacchi del nervo periferico di diametro più piccolo in pelle anteriore dell'orecchio. Barra della scala = 1 mm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Mielinizzazione dei nervi periferici e CD11b+ distribuzione delle cellule mieloidi in pelle dell'orecchio dell'adulto. Intero-monta tripla immunofluorescenza confocale di pelle posteriore dell'orecchio con anticorpi anti-CD11b (rosso) e MBP (verde), insieme a Tuj1 (blu), è indicato. (A) medio-grandi nervi periferici di diametro sono myelinated. Primo piano (B) immagine in (A). CD11b+ cellule infiammatorie distribuiscono uniformemente nella pelle posteriore dell'orecchio. Barra della scala = 1 mm (A), 100 µm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive l'intero-monta immunonohistochemical imaging della pelle dell'orecchio dell'adulto per l'analisi delle strutture neuro-vascolari e la distribuzione delle cellule immuni. Crediamo che questo metodo presenta numerosi vantaggi sperimentali per i ricercatori a studiare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di vasi sanguigni e nervi periferici, così come la distribuzione tridimensionale di componenti della pelle tra cui capelli e cellule del sistema immunitario follicoli. I risultati dell'imaging possono essere quantificati utilizzando software di imaging per ulteriore analisi quantitativa.
Corretta preparazione della pelle dell'orecchio è critica per il successo del presente protocollo. In primo luogo, la pelle dell'orecchio dovrebbe essere dissecata accuratamente subito dopo eutanasia il mouse. La parte posteriore della pelle dell'orecchio deve essere sbucciata lontano la cartilagine. Quindi, la cartilagine deve essere staccata dalla pelle anteriore prima della colorazione. In secondo luogo, tessuti connettivi, tessuti adiposi e peli devono essere rimosso delicatamente e accuratamente prima del montaggio. A causa dell'esistenza dei nervi periferici sulla superficie della pelle, rimozione accurata è necessaria per evitare di danneggiare i nervi. In terzo luogo, la pelle dell'orecchio dovrebbe essere spiegata con la rimozione di alcuni tessuti spessi dalla pelle dell'orecchio. Infine, la pelle dell'orecchio dovrebbe essere piatto montato senza bolle d'aria.
Una limitazione di questo protocollo è che la pelle dell'orecchio orecchio-etichetta non è appropriata per l'analisi come marchio auricolare provoca un buco o una cicatrice. Pertanto, è necessario identificare dei topi con diversi metodi diversi da auricolare ad esempio etichettatura sulla coda nel caso in cui ci sono più topi da analizzare.
La pelle intera orecchio possa essere analizzata mediante microscopia confocale con uno strumento di ricerca di piastrelle, anche se i rapporti precedenti hanno dimostrato che una regione di interesse può essere imaged con un alta risoluzione10. Interessante, l'imaging intero-monta della pelle intera orecchio rivela distinta morfogenesi di ramificazione e patterning dei nervi periferici e vasi sanguigni tra la pelle anteriore e posteriore (Figura 1): la pelle posteriore ha grande diametro del nervo fasci (20 – 50 µm) allineati con ristrutturati grande diametro vasi sanguigni coperti con αSMA+ VSMCs (20 – 60 µm), mentre l'anteriore pelle ha fasci nervosi di diametro minore (< 20 µm) allineato con i vasi sanguigni di diametro più piccolo ma ristrutturati coperto con αSMA+ VSMCs (< 20 µm).
Ci sono un numero notevole di mouse modelli11 per delucidare il meccanismo delle malattie umane dermatologiche quali la dermatite atopica12, psoriasi13, ferita guarigione14e neuropatia diabetica15. Abbiamo applicato questo protocollo per la pelle dell'orecchio dei topi di obesità indotta da dieta e digitare 2 topi diabetici per studiare la neuropatia diabetica16. Questo protocollo può essere applicato da giovanile alla pelle del topo adulto in varie circostanze patologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo K. Gill per la gestione del laboratorio e supporto tecnico, J. Hawkins e il personale del National Institutes of Health (NIH) costruzione impianto 50 animali per l'assistenza con cura del mouse e R. Reed e F. Boi per l'assistenza amministrativa. Grazie anche a Motegi S. e M. Udey per loro orecchio pelle dissezione protocollo N. Burns per aiuto editoriale e membri del laboratorio di cellule staminali e biologia Neuro-vascolare per aiuto tecnico e riflessivo discussione di condivisione. T. Yamazaki è stata sostenuta dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) NIH-KAITOKU. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del cuore nazionale, polmone e sangue Institute (HL005702-11 al Y.M.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-β-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
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