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Developmental Biology

成人耳皮肤全安装共焦显微术: 一种研究神经血管分支形态发生和免疫细胞分布的模型系统

doi: 10.3791/57406 Published: March 29, 2018

Summary

在这里, 我们描述了一个高分辨率全安装成像方法在整个成年小鼠耳皮肤, 这使我们能够想象分支形态发生和模式的周围神经和血管, 以及免疫细胞分布。

Abstract

在这里, 我们提出了一个完整的成人耳皮肤成像技术的协议, 以研究全面的三维神经血管分支形态发生和模式, 以及免疫细胞分布的细胞水平。对成人组织周围神经和血管解剖结构的分析, 为了解创伤愈合等病理条件下的功能性神经血管接线和神经血管变性提供了一些见解。作为一个高度信息的模型系统, 我们把我们的研究集中在成人耳皮肤, 这是容易被解剖。我们的简单和可重现的协议提供了一个准确的描述整个皮肤的细胞成分, 如周围神经 (感觉轴突, 交感神经轴突, 和雪旺细胞), 血管 (内皮细胞和血管平滑肌细胞) 和炎症细胞。我们相信这项议定书将为调查不同病理条件下成人耳皮肤的形态学异常和周围神经和血管的炎症铺平道路。

Introduction

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皮肤由三层组成: 表皮、真皮和皮下组织。它已被作为一个模型系统来研究干细胞的维持, 分化和形态发生的发展, 以及再生, 肿瘤发生和炎症的成人。皮肤有丰富的血管化和支配, 使周围神经系统和血管系统的发育协调良好。

我们以前已经展示了一个完整的胚胎皮肤成像技术与多重标记研究完整的周围神经和血管, 包括其蜂窝组件1,2,3,4: 血管中的感觉轴突、交感神经轴突、神经的雪旺细胞、内皮细胞、毛细血管和血管平滑肌细胞 (VSMCs)。在血管生成过程中, 一个主要的毛细管网络经过密集的血管重塑, 发展成为一种分层的血管分支网络。在发育的真皮/皮下组织, 动脉分支与周围的感觉神经和静脉形成相邻的动脉。在分层的血管网络被 VSMCs 彻底覆盖后, 交感神经延伸沿和支配大口径血管1,5,6。尽管发展中的神经和血管系统之间的密切联系具有重要意义, 但一个主要问题是解决成人不同病理情况下神经血管网络的发生情况。三维高分辨率成像是必要的, 以了解发病机制, 以及解剖可识别的分支形态发生和模式。

组织切片染色法分析成年小鼠皮肤的神经细胞和血管形态。其他研究还使用了整个影像的皮肤来可视化周围神经和血管, 除了毛囊, 皮脂腺, 和 arrector 毛肌肉7,8,9。然而, 成人皮肤的厚度使得它很难分析整个深度的皮肤。

在本研究中, 我们开发了一种新的高分辨率的成人耳皮肤的全安装成像, 以克服这些挑战。耳朵皮肤是容易接近的解剖和后续整个安装成像的皮肤在其整个深度。因此, 它是一个简单的和高度重复的方法, 可用于比较三维结构的周围神经和血管系统的皮肤, 与综合量化测量。结果表明, 成人皮肤中保留了大口径血管对周围感觉和交感神经的定位。该协议的目标是可视化分支形态发生, 以及周围神经和血管的模式, 以及在各种情况下, 如炎症和成年小鼠模型的细胞水平上的免疫细胞分布。再生.

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Protocol

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这一节的所有实验都是在国家心脏、肺和血液研究所 (NHLBI) 动物护理和使用委员会的批准下进行的。

1. 成人小鼠耳皮收集

  1. 弄死成年小鼠的二氧化碳 (CO2) 暴露在一个封闭的房间, 然后确认安乐死的颈椎脱位。
    注: 实验遵循国家卫生研究院 (NIH) 的安乐死方法指南。
  2. 从底座解剖耳朵, 将其放置在 35 x 10 毫米的2培养皿中, 其中包含有2毫升的汉克平衡盐溶液 (HBSS)。用剪刀简单地修剪头发。
  3. 从介入软骨中仔细剥离后皮肤和前皮肤。
    注: 软骨附着于前皮肤。
  4. 将后、前皮肤分别转移至24井板, 含1毫升冰鲜4% 多聚甲醛 (粉煤灰) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 每井。将4% 的粉煤灰中的后、前皮肤压扁。
  5. 修复后和前皮肤与软骨在4°c 1 小时。
  6. 在室温下, 在混合器上用温和的混合, 在1毫升的 PBS 中清洗后、前皮肤3次5分钟。
  7. 将后、前皮肤与软骨转移到 35 x 10 毫米2培养皿的底部。切断基底区域, 折叠并有脂肪和结缔组织。用细弯钳剥离前皮肤软骨。
  8. 用细弯镊子小心去除后皮肤内侧的毛发、脂肪组织和结缔组织。用 PBS 把皮肤弄湿。

2. 小鼠耳皮肤的全层免疫组化染色

注: 以下各节中的所有实验均按照 NIH 实验室安全指南进行。

  1. 准备阻塞缓冲区。过滤器10% 热灭活山羊血清 (HIGS) 稀释在 pbs 与0.2% 海卫 X-100 (TX-100) 阻断缓冲, 或10% 驴血清 (DS) 稀释在 pbs 与 0.2% TX-100 阻塞缓冲区, 使用0.45 µm 过滤器单位。
  2. 将后、前皮肤转移至24井板, 其中包含1毫升 10% HIGS 阻塞缓冲器或 10% DS 阻塞缓冲器。在室温下, 在搅拌机上用温和的混合孵育皮肤30分钟。
  3. 在阻塞缓冲器 (10% HIGS 或 10% DS) 中稀释主要抗体 (材料表), 准备主要抗体溶液。
    注: 全分队城市免疫组化分析成人耳皮肤抗体的泛神经元标记神经元特定类 III β-蛋白 (Tuj1, 兔多克隆 IgG 或小鼠 monocloncal IgG2a, 1:500 稀释在最后浓度的2µg/毫升),pan 内皮细胞标记的血小板内皮细胞黏附分子 1 (PECAM-1, 仓鼠单克隆 IgG, 1:300 稀释在最后浓度3.3 µg/毫升), 髓鞘标记髓鞘碱性蛋白 (MBP, 兔多克隆 IgG, 1:200 稀释在最后浓度的5µg/毫升) 和炎症髓细胞标记 CD11b (大鼠单克隆 IgG2b, 1:50 稀释在最后浓度20µg/毫升) 显示在图 1图 2。以 Cy3-conjugated 抗体为血管平滑肌细胞标记α平滑肌肌动蛋白 (αSMA) 与继发抗体 (2.6) 一起孵化皮肤。我们自己测试的主要抗体在材料表中列出。来自不同物种的多种主要抗体可以同时混合。
  4. 将后、前皮肤转移到含150µL 的原发抗体溶液的新井中。在4摄氏度的搅拌机上用温和的混合孵育皮肤。
  5. 第二天, 将后、前皮肤转移到24井板中的新井, 或吸入含有原发抗体的阻塞缓冲液。增加1毫升的 2% HIGS 稀释在 pbs 与 0.2% TX-100 洗涤缓冲器或 2% DS 稀释在 pbs 与 0.2% TX-100 洗涤缓冲器。用3的洗涤缓冲器的变化, 每15分钟清洗皮肤, 在混合器的室温下轻轻搅拌。
  6. 准备二级抗体溶液 (材料表)。在阻塞缓冲器中稀释二次抗体 (10% HIGS 或 10% DS), 并通过0.22 µm 聚偏聚氟 (PVDF) 膜注射器过滤器连接到1毫升注射器, 过滤含有二级抗体的阻塞缓冲器。
    注: Alexa 488 或633共轭山羊抗兔 IgG (H + L) 或小鼠 IgG2a Tuj1, alexa 647-共轭山羊抗仓鼠 igg (h + l) 为 PECAM-1, alexa 488 共轭山羊抗兔 igg (h + l) 为 MBP, 和 Alexa 594 共轭大鼠 igg (h + l) 为 CD11b 使用以1:250 稀释在最后的集中8µg/毫升。皮肤用 Cy3-conjugated αSMA 抗体 (1:500 稀释在最后浓度的2-3 µg/毫升) 与这些继发抗体结合而孵化。
  7. 离心溶液在 1.3万 x g 10 分钟内从阻塞缓冲器中去除二次抗体的聚集粒子。
    注: 不同种类的荧光共轭二次抗体可同时混合。
  8. 将后、前皮肤转移至含150µL 的二级抗体溶液。在铝箔上包装24井板, 以避免光和孵化的皮肤为 1 h 与温和的混合在一个搅拌机在室温下。
  9. 将后、前皮肤转移到24井板中的新井, 或完全吸管二次抗体溶液。添加1毫升的 2% HIGS 洗涤缓冲器或 2% DS 洗涤缓冲器。
  10. 在铝箔上包裹24井板, 用洗涤缓冲器的3变化每15分钟清洗一次, 在室温下混合搅拌。

3. 在幻灯片上安装耳皮

  1. 将皮肤放在 35 x 10 毫米2培养皿的底部。用低光照显微镜下的细弯钳, 从皮肤内侧小心去除毛发、脂肪组织、结缔组织、灰尘和纤维, 以尽量减少广泛的照片漂白。用 PBS 把皮肤弄湿。
  2. 使用镊子将皮肤转移到粘附显微镜滑动。将后部和前部皮肤与内侧面朝上滑动。用镊子将皮肤平整。
  3. 在液体防褪色安装介质中安装皮肤, 以避免漂白和保存荧光信号。确保没有气泡在皮肤上或周围。
  4. 在皮肤标本上仔细盖上盖玻片, 在室温下将装入的皮样幻灯片放在黑暗中, 让安装介质变得牢固。用指甲油将盖玻片密封到滑轨上, 并将其存放在4摄氏度, 用于长期贮存。

4. 共焦显微术

  1. 为显影设置合适的激光器。本实验采用三激光源 (氩 488 nm、DPSS 561 nm 和 HeNe 633 nm) 共焦显微镜。
  2. 使用顺序扫描工具, 同时激发三重染色样品, 以避免和减少任何重叠。
    注意: 图像将使用顺序扫描模式以顺序方式进行。
  3. 10X 目标下的图像。使用平铺扫描工具捕捉整个耳朵皮肤。设置 z 堆栈, 并确保 z 位置覆盖整个耳朵皮肤的厚度。

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Representative Results

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成年小鼠后耳皮肤 (图 1A) 和前耳皮肤 (图 1B) 与αSMA (红色)、Tuj1 (绿色) 和 PECAM-1 (蓝色) 的抗体 immunostained。后皮肤 immunostained 研究神经免疫分布, 使用抗体 CD11b (红色) 和 MBP (绿色), 连同 Tuj1 (蓝色) (图 2A)。在单个细胞分辨率 (图 2B) 中检测到 CD11b+炎症细胞 (包括巨噬细胞) 的分布。

Figure 1
图 1: 在成人耳皮肤中对齐 ofperipheral 神经和血管.αSMA (红色)、Tuj1 (绿色) 和 PECAM-1 (蓝色) 的抗体, 对后耳皮肤进行全安装三重免疫荧光共聚焦显微术。(A) VSMC 覆盖的大口径血管与后耳皮肤周围神经相对准。(B) VSMCs 覆盖的较小直径血管与前耳皮肤的小直径外周神经束对齐。缩放条 = 1 mm请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 髓鞘形成周围神经和CD11b + 髓细胞在成人耳皮肤中的分布。CD11b (红) 和 MBP (绿色) 与 Tuj1 (蓝) 的抗体结合, 对后耳皮肤进行全安装三重免疫荧光共聚焦显微术。(A) 中大直径外围神经髓。(B) 特写图像 (A)。CD11b+炎症细胞均匀分布于后耳皮肤。刻度条 = 1 毫米 (A), 100 µm (B)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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本协议描述成人耳皮肤的全芒 immunonohistochemical 成像, 用于分析神经血管结构和免疫细胞分布。我们认为, 这种方法有许多实验优势, 研究人员的分支形态发生和模式的周围神经和血管, 以及三维分布的皮肤成分, 包括免疫细胞和头发毛囊.图像的结果可以用成像软件进行量化, 进一步定量分析。

正确地制备耳部皮肤对本议定书的成功至关重要。首先, euthanizing 后应仔细解剖耳朵皮肤。耳朵皮肤的后部应该从软骨中剥离出来。然后, 软骨在染色前应从前皮肤剥离。其次, 结缔组织、脂肪组织和毛发应在安装前轻轻彻底地去除。由于皮肤表面周围神经的存在, 需要小心去除以避免损伤神经。第三, 耳朵皮肤应展开与去除一些厚的组织从耳朵皮肤。最后, 耳朵皮肤应该是扁平安装没有气泡。

这个协议的一个限制是耳朵标签的耳朵皮肤不适合分析作为耳朵标记导致孔或疤痕。因此, 如果有多只小鼠需要分析, 就必须用不同的方法来鉴别小鼠, 如在尾部贴上标记等。

整个耳朵皮肤可以通过共焦显微镜扫描与瓷砖扫描工具, 虽然以前的报告表明, 一个感兴趣的区域可以成像高分辨率10。有趣的是, 整个耳部皮肤的全装成像揭示了不同的分支形态和模式的周围神经和血管之间的后和前皮肤 (图 1): 后皮肤有大直径神经丛 (20–50µm) 与αSMA+ VSMCs (20–60µm) 覆盖的改建大口径血管对齐, 而前皮肤有较小直径的神经束 (< 20 µm), 与较小直径但改建的血管对齐覆盖αSMA+ VSMCs (< 20 µm)。

有大量的鼠标模型11阐明人体皮肤病的机制, 如特应性皮炎12, 银屑病13, 伤口愈合14, 糖尿病神经病变15。本协议适用于饮食诱发肥胖小鼠的耳部皮肤和2型糖尿病小鼠, 研究糖尿病神经病变16。该协议可从幼年到成年小鼠皮肤的各种病理状况。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢吉尔的实验室管理和技术支持, j. 霍金斯和国家卫生研究院 (NIH) 的工作人员50建立了援助老鼠护理的动物设施, 以及里德和 f. Baldrey 的行政援助。还感谢 s Motegi 和 m. Udey 分享他们的耳朵皮肤解剖协议, n. 烧伤的编辑帮助, 以及干细胞和神经血管生物学实验室成员的技术帮助和深思熟虑的讨论。KAITOKU 是日本促进科学协会 (jsp) 的支持。这项工作得到了国家心脏、肺和血液研究所 (HL005702-11 到 Y.M.) 的校内研究计划的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-β-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

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References

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Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).More

Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

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