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Developmental Biology

पूरे माउंट-वयस्क कान त्वचा के लिए फोकल माइक्रोस्कोप: एक मॉडल प्रणाली न्यूरो संवहनी Morphogenesis और प्रतिरक्षा कोशिका वितरण शाखाओं का अध्ययन करने के लिए

doi: 10.3791/57406 Published: March 29, 2018

Summary

यहां, हम पूरे वयस्क माउस कान त्वचा में एक उच्च संकल्प पूरे माउंट इमेजिंग विधि का वर्णन है, जो हमें morphogenesis शाखाओं में बंटी और परिधीय नसों और रक्त वाहिकाओं के नमूनों की कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है, साथ ही प्रतिरक्षा सेल वितरण ।

Abstract

यहां, हम एक पूरी माउंट वयस्क कान त्वचा इमेजिंग तकनीक का एक प्रोटोकॉल के लिए व्यापक तीन आयामी न्यूरो संवहनी शाखाओं morphogenesis और patterning, साथ ही साथ एक सेलुलर स्तर पर प्रतिरक्षा सेल वितरण का अध्ययन प्रस्तुत करते हैं । परिधीय तंत्रिका और रक्त वाहिका संरचनात्मक संरचनाओं के वयस्क ऊतकों में विश्लेषण कार्यात्मक तंत्रिका संवहनी तारों की समझ में कुछ अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और घाव भरने के रूप में रोग की स्थिति में तंत्रिका संवहनी अध... एक उच्च जानकारीपूर्ण मॉडल प्रणाली के रूप में, हम वयस्क कान त्वचा है, जो विच्छेदन के लिए आसानी से सुलभ है पर हमारे अध्ययन ध्यान केंद्रित किया है । हमारे सरल और reproducible प्रोटोकॉल पूरी त्वचा में सेलुलर घटकों का एक सटीक चित्रण प्रदान करता है, जैसे परिधीय नसों (संवेदी axons, सहानुभूति axons, और Schwann कोशिकाओं), रक्त वाहिकाओं (endothelial कोशिकाओं और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं ), और भड़काऊ कोशिकाओं । हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल के लिए परिधीय नसों और रक्त वाहिकाओं में रूपात्मक विषमताओं की जांच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग रोग की स्थिति के तहत वयस्क कान त्वचा में सूजन का मार्ग प्रशस्त होगा ।

Introduction

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त्वचा तीन परतों के शामिल है: एपिडर्मिस, dermis और hypodermis । यह एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है स्टेम सेल रखरखाव, भेदभाव का अध्ययन, और विकास में morphogenesis के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पुनर्जनन, tumorigenesis, और वयस्क में सूजन । त्वचा बड़े पैमाने पर संवहनी और innervated है कि परिधीय तंत्रिका तंत्र और संवहनी प्रणाली के विकास को अच्छी तरह से समंवित है ।

हम पहले से कई को बरकरार परिधीय नसों और उनके सेलुलर घटकों सहित रक्त वाहिकाओं का अध्ययन करने के लिए लेबलिंग के साथ एक पूरे माउंट भ्रूण त्वचा इमेजिंग तकनीक का प्रदर्शन किया है1,2,3, 4: संवेदी axons, सहानुभूति axons, नसों में Schwann कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं, pericytes, और रक्त वाहिकाओं में संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (VSMCs). angiogenesis के दौरान, एक प्राथमिक केशिका नेटवर्क गहन संवहनी रिमॉडलिंग से गुजरती है और एक पदानुक्रमित संवहनी शाखाकरण नेटवर्क में विकसित करता है । विकासशील dermis/hypodermis, परिधीय संवेदी नसों और नसों के साथ धमनियों शाखा तो धमनियों के निकट फार्म । के बाद पदानुक्रमित संवहनी नेटवर्क अच्छी तरह से VSMCs के साथ कवर किया जाता है, सहानुभूति नसों के साथ विस्तार और अंदर आना बड़े व्यास रक्त वाहिकाओं 1, 5, 6. विकासशील तंत्रिका और संवहनी प्रणालियों के बीच निकट संघ में महत्व के बावजूद, एक प्रमुख सवाल का पता क्या वयस्कों में विभिंन रोग स्थितियों में तंत्रिका संवहनी नेटवर्क के लिए होता गया है । एक तीन आयामी उच्च संकल्प इमेजिंग रोगजनन की सराहना करने के लिए आवश्यक है, साथ anatomically पहचानने शाखाओं में बंटी morphogenesis और patterning ।

वयस्क माउस त्वचा में ंयूरॉंस और संवहनी morphogenesis सामांयतः ऊतक अनुभाग धुंधला द्वारा विश्लेषण किया जाता है । अंय अध्ययनों का इस्तेमाल किया है पूरे-माउंट इमेजिंग त्वचा की परिधीय नसों और रक्त वाहिकाओं कल्पना करने के लिए, बालों के रोम के अलावा, वसामय ग्रंथियों, और arrector पिली मांसपेशियों7,8,9। हालांकि, वयस्क त्वचा की मोटाई यह मुश्किल अपनी पूरी गहराई से अधिक त्वचा का विश्लेषण करने के लिए बनाया गया है ।

वर्तमान अध्ययन में, हम वयस्क कान त्वचा की एक उपंयास उच्च संकल्प पूरे माउंट इमेजिंग विकसित करने के लिए इन चुनौतियों से उबरने । कान त्वचा विच्छेदन के लिए आसानी से सुलभ है और उसके बाद पूरे-अपनी पूरी गहराई से अधिक त्वचा की इमेजिंग माउंट । इस प्रकार, यह एक सरल और उच्च reproducible विधि है कि त्वचा में परिधीय तंत्रिका और संवहनी प्रणालियों के तीन आयामी वास्तुकला, व्यापक ठहराव माप के साथ तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है । हम प्रदर्शन किया है कि बड़े व्यास रक्त वाहिकाओं के साथ परिधीय संवेदी और सहानुभूति नसों के संरेखण वयस्क त्वचा में संरक्षित है । इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को शाखाओं में बंटी morphogenesis कल्पना है, और परिधीय नसों और रक्त वाहिकाओं के पैटर्न, और साथ ही विभिंन स्थितियों में वयस्क माउस मॉडलों में एक सेलुलर स्तर पर प्रतिरक्षा सेल वितरण जैसे सूजन और उत्थान.

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Protocol

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इस खंड में सभी प्रयोगों राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और रक्त संस्थान (NHLBI) पशु देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन के तहत प्रदर्शन किया गया ।

1. वयस्क माउस कान त्वचा संग्रह

  1. Euthanize एक बंद चैंबर में कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) जोखिम द्वारा वयस्क चूहों और फिर गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।
    नोट: प्रयोग इच्छामृत्यु विधि के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) दिशानिर्देश के बाद ।
  2. आधार से कान काटना और यह एक 35 x 10 मिमी2 पेट्री है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 2 मिलीलीटर युक्त पकवान में जगह है । संक्षेप में कैंची के साथ बाल ट्रिम कर दीजिए ।
  3. पीछे त्वचा छील और पूर्वकाल त्वचा दूर ध्यान से हस्तक्षेप उपास्थि से ।
    नोट: उपास्थि पूर्वकाल त्वचा को देते हैं ।
  4. पीछे और पूर्वकाल त्वचा के लिए अलग से एक 24 अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंड ताजा 4% paraformaldehyde (पीएफए) में फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) प्रति अच्छी तरह से प्लेट को स्थानांतरित । पीछे और 4% पीएफए में पूर्वकाल त्वचा समतल ।
  5. पीछे और 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उपास्थि के साथ पूर्वकाल त्वचा को ठीक करें ।
  6. कमरे के तापमान पर एक मिक्सर पर कोमल मिश्रण के साथ पंजाब के 1 मिलीलीटर में 5 मिनट के लिए पीछे और पूर्वकाल त्वचा 3 बार धो लें ।
  7. एक 35 x 10 मिमी के नीचे करने के लिए उपास्थि के साथ पीछे और पूर्वकाल त्वचा हस्तांतरण2 पेट्री डिश । आधार क्षेत्र है, जो जोड़ रहा है और वसा और संयोजी ऊतक है कट । ठीक घुमावदार संदंश का उपयोग कर पूर्वकाल त्वचा से उपास्थि छील ।
  8. ध्यान से बालों को दूर, वसा ऊतकों, और पीछे त्वचा के अंदर से संयोजी ऊतक ठीक घुमावदार चिमटी का उपयोग कर । पंजाबियों के साथ त्वचा को गीला रखें ।

2. पूरे-माउंट Immunohistochemical माउस कान त्वचा के धुंधला

नोट: NIH प्रयोगशाला सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुसार निम्न अनुभागों में सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया.

  1. ब्लॉकिंग बफ़र तैयार करें । फ़िल्टर 10% गर्मी निष्क्रिय बकरी सीरम (HIGS) 0.2% ट्राइटन X-100 (TX-100) बफर अवरुद्ध, या 10% गधा सीरम (डी एस) के साथ पंजाब में पतला 0.2% TX-100 अवरुद्ध बफर के साथ पंजाब में पतला, एक 0.45 µm फ़िल्टर इकाई का उपयोग कर ।
  2. पीछे और पूर्वकाल त्वचा के लिए एक 24 अच्छी तरह से प्लेट 10% HIGS ब्लॉकिंग बफर या 10% डी एस ब्लॉक बफर के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर युक्त स्थानांतरण । कमरे के तापमान पर एक मिक्सर पर कोमल मिश्रण के साथ 30 मिनट के लिए त्वचा की मशीन ।
  3. (या तो 10% HIGS या 10% DS) बफ़र ब्लॉकिंग में प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) कमजोर द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें ।
    नोट: पूरे-mout immunohistochemical का विश्लेषण करने के लिए एंटीबॉडी के साथ वयस्क कान त्वचा के लिए पैन-न्यूरॉन मार्कर ंयूरॉन-विशिष्ट वर्ग III β-tubulin (Tuj1, खरगोश polyclonal आईजीजी या माउस monocloncal IgG2a, 1:500 कमजोर पड़ने के अंतिम एकाग्रता में 2 µ g/ पैन-endothelial सेल मार्कर प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु 1 (PECAM-1, हंसटर मोनोक्लोनल आईजीजी, 1:300 कमजोर पड़ने के अंतिम एकाग्रता में 3.3 µ g/एमएल), myelin म्यान मार्कर myelin बुनियादी प्रोटीन (MBP, खरगोश polyclonal आईजीजी, 1:200 कमजोर पड़ने पर 5 µ जी/एमएल के अंतिम एकाग्रता) और भड़काऊ माइलॉयड सेल मार्कर CD11b (चूहे मोनोक्लोनल IgG2b, 1:50 20 µ जी/एमएल) के अंतिम एकाग्रता पर कमजोर पड़ने के चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाया गया था । त्वचा संवहनी चिकनी मांसपेशी सेल मार्कर α चिकनी मांसपेशी actin (αSMA) माध्यमिक एंटीबॉडी (2.6) के साथ एक साथ के लिए Cy3-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ मशीन था । प्राथमिक खुद के द्वारा परीक्षण एंटीबॉडी सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध किया गया । एकाधिक प्राथमिक विभिंन प्रजातियों से व्युत्पंन एंटीबॉडी एक साथ मिलाया जा सकता है ।
  4. पीछे और पूर्वकाल त्वचा नई अच्छी तरह से 150 µ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के एल युक्त स्थानांतरण । रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मिक्सर पर कोमल मिश्रण के साथ त्वचा की मशीन ।
  5. अगले दिन पर, पीछे और 24 अच्छी तरह से प्लेट में नए कुओं के लिए पूर्वकाल त्वचा हस्तांतरण या ब्लॉकिंग बफर प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त महाप्राण । या तो 2% HIGS के 1 मिलीलीटर जोड़ें 0.2% tx-100 वाशिंग बफर या 2% डी एस के साथ पंजाब में पतला 0.2% tx-100 वाशिंग बफर के साथ पंजाब में पतला । धोने बफर के 3 परिवर्तन के साथ त्वचा के कमरे के तापमान पर एक मिक्सर पर कोमल मिश्रण के साथ हर 15 मिनट धो लें ।
  6. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान (सामग्री तालिका) तैयार करें । अवरुद्ध बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला (या तो 10% HIGS या 10% डी एस) और एक 0.22 µm polyvinylidene difluoride के माध्यम से माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त अवरुद्ध बफर फिल्टर (PVDF) झिल्ली सिरिंज एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा फिल्टर.
    नोट: Alexa 488 या 633-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) या Tuj1 के लिए माउस IgG2a, alexa 647-संयुग्मित बकरी विरोधी हंसटर आईजीजी (एच + एल) के लिए PECAM-1, Alexa 488-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) MBP के लिए, और Alexa 594-संयुग्मित चूहा आईजीजी (एच + एल) CD11b के लिए इस्तेमाल किया गया 8 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता में 1:250 कमजोर पड़ने के साथ । त्वचा Cy3-संयुग्मित αSMA एंटीबॉडी के साथ तैयार किया गया था (1:500 कमजोर पड़ने 2-3 µ जी के अंतिम एकाग्रता में/एमएल) इन माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयोजन में ।
  7. 10 मिनट के लिए 13,000 x जी में समाधान केंद्रापसारक को अवरुद्ध बफर से माध्यमिक एंटीबॉडी के एकत्रित कणों को दूर करने के लिए ।
    नोट: विभिन्न फ्लोरोसेंट संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी विभिन्न प्रजातियों से व्युत्पंन एक साथ मिलाया जा सकता है ।
  8. पीछे और पूर्वकाल त्वचा स्थानांतरण माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 150 µ एल युक्त अच्छी तरह से । प्रकाश से बचने और कमरे के तापमान पर एक मिक्सर पर कोमल मिश्रण के साथ 1 एच के लिए त्वचा की मशीन के लिए एल्यूमीनियम पंनी में 24 वेल प्लेट लपेटें ।
  9. 24 अच्छी प्लेट में नए कुओं के पीछे और पूर्वकाल त्वचा हस्तांतरण या प्लास्टिक द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान महाप्राण पूरी तरह से । या तो 2% HIGS वाशिंग बफर या 2% DS वाशिंग बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  10. एल्यूमीनियम पंनी में 24 अच्छी तरह से थाली लपेटें और धोने बफर के 3 परिवर्तन के साथ धोने के लिए कमरे के तापमान पर एक मिक्सर पर कोमल मिश्रण के साथ हर 15 मिनट ।

3. स्लाइड पर कान की त्वचा बढ़ते

  1. एक 35 x 10 मिमी के तल पर त्वचा प्लेस2 पेट्री डिश । ध्यान से बाल, वसा ऊतकों, संयोजी ऊतक, धूल, और फाइबर कम रोशनी के साथ stereomicroscope के तहत ठीक घुमावदार संदंश का उपयोग कर त्वचा के अंदर से हटाने के लिए व्यापक फोटो ब्लीचिंग को कम करने के लिए । पंजाबियों के साथ त्वचा को गीला रखें ।
  2. संदंश का उपयोग कर एक चिपकने वाला माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए त्वचा स्थानांतरण । पीछे और स्लाइड पर ऊपर का सामना करना पड़ अंदर के साथ पूर्वकाल त्वचा प्लेस । संदंश का उपयोग कर त्वचा को समतल ।
  3. माउंट एक तरल विरोधी में त्वचा photobleaching से बचने और फ्लोरोसेंट संकेतों को बनाए रखने के बढ़ते माध्यम फीका । सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुले पर या त्वचा के आसपास हैं ।
  4. कवर त्वचा के नमूनों पर coverslip के साथ ध्यान से और कमरे के तापमान पर रात भर अंधेरे में घुड़सवार त्वचा नमूना स्लाइड की दुकान के लिए बढ़ते मीडिया फर्म मिल की अनुमति । नेल पॉलिश के साथ स्लाइड करने के लिए coverslip सील और लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।

4. फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. fluorophores के लिए उपयुक्त लेज़र्स सेट करें । इस प्रयोग में तीन लेसर स्रोतों (आर्गन 488 एनएम, DPSS 561 एनएम और HeNe 633 एनएम) के साथ एक फोकल माइक्रोस्कोप का प्रयोग किया जाता है ।
  2. अनुक्रमिक स्कैन उपकरण है, जो एक साथ ट्रिपल-सना हुआ नमूनों को उत्तेजित का उपयोग करें, से बचने और किसी भी ओवरलैप कम ।
    नोट: छवियाँ अनुक्रमिक स्कैन मोड का उपयोग करते हुए एक क्रमिक तरीके से लिया जाएगा ।
  3. एक 10x उद्देश्य के तहत छवि । पूरे कान की त्वचा पर कब्जा करने के लिए टाइल स्कैन उपकरण का उपयोग करें । z-स्टैक सेट करें और सुनिश्चित करें कि z-स्थिति कान की त्वचा की पूरी मोटाई शामिल है ।

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Representative Results

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वयस्क माउस पीछे कान त्वचा (आंकड़ा 1a) और पूर्वकाल कान त्वचा (आंकड़ा 1b) αSMA (लाल), Tuj1 (हरा), और PECAM-1 (नीला) के लिए एंटीबॉडी के साथ immunostained थे । पीछे त्वचा CD11b (लाल) और MBP (हरा) के लिए एंटीबॉडी का उपयोग न्यूरो प्रतिरक्षा वितरण का अध्ययन करने के लिए immunostained था, एक साथ Tuj1 (नीला) (चित्र 2a) । CD11b+ भड़काऊ कोशिकाओं का वितरण, मैक्रोफेज सहित एक एकल सेलुलर संकल्प (चित्रा बीसी) में पाया गया ।

Figure 1
चित्र 1: वयस्क कान की त्वचा में नसों और रक्त वाहिकाओं ofperipheral संरेखण । पूरे-ट्रिपल इम्यूनोफ्लोरेसेंस फोकल माइक्रोस्कोपी के पीछे और αSMA के लिए एंटीबॉडी के साथ पूर्वकाल कान त्वचा (लाल), Tuj1 (हरा), और PECAM-1 (नीला) दिखाया गया है । () VSMC-कवर बड़े व्यास रक्त वाहिकाओं पीछे कान त्वचा में परिधीय नसों के साथ संरेखित करें । () छोटे व्यास रक्त वाहिकाओं VSMCs के साथ कवर पूर्वकाल कान त्वचा में छोटे व्यास परिधीय तंत्रिका बंडलों के साथ संरेखित करें । स्केल बार = 1 mm कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: परिधीय नसों और वयस्क कान त्वचा में CD11b+ माइलॉयड सेल वितरण के Myelination । पूरे माउंट ट्रिपल इम्यूनोफ्लोरेसेंस CD11b के लिए एंटीबॉडी के साथ कान त्वचा के पीछे के फोकल माइक्रोस्कोपी (लाल) और MBP (हरा), Tuj1 के साथ एक साथ (नीला), दिखाया गया है । () मध्यम से बड़े व्यास परिधीय नसों myelinated हैं. (B) (A) में क्लोज़-अप छवि । CD11b+ भड़काऊ कोशिकाओं के पीछे कान त्वचा में समान रूप से वितरित । स्केल बार = 1 mm (A), 100 µm (B) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल न्यूरो संवहनी संरचनाओं और प्रतिरक्षा सेल वितरण के विश्लेषण के लिए वयस्क कान त्वचा के पूरे माउंट immunonohistochemical इमेजिंग का वर्णन । हमारा मानना है कि इस पद्धति के शोधकर्ताओं के लिए कई प्रयोगात्मक लाभ है morphogenesis शाखाओं में बंटी अध्ययन और परिधीय नसों और रक्त वाहिकाओं के पैटर्न, साथ ही प्रतिरक्षा कोशिकाओं और बालों सहित त्वचा घटकों के तीन आयामी वितरण रोम. इमेजिंग के परिणाम आगे मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेअर का उपयोग quantified जा सकता है ।

कान की त्वचा की उचित तैयारी इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है । सबसे पहले, कान त्वचा सावधानी से माउस को euthanizing के बाद जल्द ही विदारक होना चाहिए । कान त्वचा के पीछे भाग उपास्थि से दूर छील किया जाना चाहिए । फिर, उपास्थि धुंधला से पहले पूर्वकाल त्वचा से बंद किया जाना चाहिए । दूसरा, संयोजी ऊतक, वसा ऊतकों, और बाल धीरे से हटाया जाना चाहिए और अच्छी तरह से बढ़ते पहले । त्वचा की सतह पर परिधीय नसों के अस्तित्व के कारण, सावधान हटाने के लिए नसों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए आवश्यक है । तीसरा, कान त्वचा कान त्वचा से कुछ मोटी ऊतकों को हटाने के साथ सामने आना चाहिए । अंत में, कान त्वचा हवा के बुलबुले के बिना फ्लैट घुड़सवार होना चाहिए ।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि कान टैग कान त्वचा कान टैग के रूप में विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है एक छेद या एक निशान का कारण बनता है । इसलिए, जैसे पूंछ पर लेबलिंग के रूप में कान टैग के अलावा अन्य तरीकों से चूहों की पहचान के मामले में वहाँ कई चूहों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है.

पूरे कान त्वचा एक टाइल स्कैन उपकरण के साथ फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा स्कैन किया जा सकता है, हालांकि एक पिछले रिपोर्टों का प्रदर्शन है कि ब्याज के एक क्षेत्र के एक उच्च संकल्प के साथ imaged किया जा सकता है10। दिलचस्प है, पूरे कान त्वचा की पूरी-माउंट इमेजिंग अलग शाखाओं में बंटी morphogenesis और परिधीय नसों और पीछे और पूर्वकाल त्वचा के बीच रक्त वाहिकाओं के नमूनों का पता चलता है (चित्रा 1): पीछे त्वचा बड़े व्यास है तंत्रिका बंडलों (20 – 50 µm) αSMA के साथ कवर बड़े व्यास रक्त वाहिकाओं के साथ गठबंधन किया+ VSMCs (20 – 60 µm), जबकि पूर्वकाल त्वचा छोटे व्यास तंत्रिका बंडलों है (< 20 µm) के साथ गठबंधन छोटे व्यास लेकिन फिर से तैयार रक्त वाहिकाओं αSMA+ VSMCs (< 20 µm) के साथ कवर किया गया ।

वहां माउस मॉडल की एक उल्लेखनीय संख्या11 है atopic जिल्द की सूजन के रूप में मानव dermatological रोगों के तंत्र स्पष्ट12, सोरायसिस13, घाव हीलिंग14, और15मधुमेही न्यूरोपैथी । हम आहार प्रेरित मोटापा चूहों और प्रकार 2 मधुमेह चूहों के कान त्वचा के लिए इस प्रोटोकॉल लागू किया है मधुमेही न्यूरोपैथी16अध्ययन करने के लिए. इस प्रोटोकॉल विभिंन रोग की स्थिति में जुवेनाइल से वयस्क माउस त्वचा के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रयोगशाला प्रबंधन और तकनीकी सहायता, जे हॉकिंस और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) के कर्मचारियों के लिए एस गिल धंयवाद माउस की देखभाल के साथ सहायता के लिए 50 पशु सुविधा का निर्माण, और प्रशासनिक सहायता के लिए आर रीड और एफ Baldrey । उनके कान त्वचा विच्छेदन प्रोटोकॉल बांटने के लिए भी एस मोतेगी और एम Udey को धंयवाद, संपादकीय मदद के लिए N जलता है, और स्टेम सेल की प्रयोगशाला और तकनीकी मदद और विचारशील चर्चा के लिए तंत्रिका संवहनी जीवविज्ञान के सदस्यों । Yamazaki को जापान सोसायटी ऑफ साइंस (JSPS) NIH-KAITOKU के प्रोत्साहन से समर्थन मिला । यह काम नेशनल हार्ट, लंग, और ब्लड इंस्टिट्यूट (HL005702-11 to Y.M.) के अंदर रिसर्च प्रोग्राम द्वारा सपोर्ट किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-αSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-β-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

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References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
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पूरे माउंट-वयस्क कान त्वचा के लिए फोकल माइक्रोस्कोप: एक मॉडल प्रणाली न्यूरो संवहनी Morphogenesis और प्रतिरक्षा कोशिका वितरण शाखाओं का अध्ययन करने के लिए
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Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).More

Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

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