Summary
PH に敏感な重要な染料 6 - カルボキシ - を使用して 2', 7'-ジクロルフルオレッセン アセテート (cDCFDA) のc. の elegansの腸のライソゾーム酸性度の損失をプローブするステップ バイ ステップ ガイド
Abstract
線虫線虫(C. elegans) は、長寿と発達経路の研究に広く使用されているモデル システムです。このような研究は動物、転送し逆遺伝学的アッセイ、生成の蛍光に分類された蛋白質の相対的な容易さと初期に microinjected することができますいずれか蛍光染料の使用能力の透明物によって促進されます。胚、または細胞細胞器官 (例えば9-ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル-5 H-ベンゾ (a) 誘導 5-1 と (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-イル-活版} - N は - のラベルにその食品(大腸菌 OP50)に組み込まれました。[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron)。今回腸内リソソームを汚れ蛍光 pH 感受性色素の使用ライブ ワームのライソゾーム酸性度の動的な生理学的な変更のビジュアルの読み出しを提供します。このプロトコルはリソソームの pH を測定しないが、むしろライソゾーム酸性度の生理学的な関連語句を評価する信頼性の高い方法を確立することを目的と。cDCFDA は細胞内のエステラーゼによって加水分解時に蛍光蛍光 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) に変換はセル側の透過物化合物です。リソソーム内のプロトン化それが蓄積する場所、これらのオルガネラの cDCF をトラップします。4.8 その低い pKa、ためこの染料は、酵母の pH センサーとして使用されています。ここで腸内リソソーム内の酸性度を評価するために栄養補助食品として cDCFDA の使用を説明線虫。この技術は生きている動物,に取って代わるリソソームの発見が可能、老化, オートファジー, およびリソソーム器官に関する研究を含む実験的アプリケーションの広い範囲を持っています。
Introduction
タンパク質凝集体の外観広く認められる真核細胞1,2,3と細胞老化4原則ドライバーの中に思想が形成の高齢化の特徴,5,6,7. 年齢を細胞、タンパク質の異化が障害、タンパク質凝集の増加につながる成長証拠があります。老化細胞における蛋白質分解の破綻には、プロテアソームを介したタンパク質分解9と同様、オートファジー8の障害が含まれます。最後に、古い細胞の増加は不可逆的なタンパク質の酸化タンパク質異化10をさらに損なうこと。
Autophagy は当初一括劣化損傷を受けたタンパク質の非選択性プロセスであると考えられたが、最近の研究は、オートファジーはタンパク質凝集体とは細胞小器官の機能不全の非常に選択が示されています。他の蛋白質のクリアランス機構11による特性劣化を受けやすい。オートファジーのプロセス中に破損したと集計されたタンパク質は、オートファゴソームと呼ばれる二重膜の小胞に隔離します。このオートファゴソームは、オートファゴソーム貨物12の劣化につながる、リソソームと呼ばれる酸性の細胞内小器官と融合します。リソソーム オートファジー経路のエンドポイントを表し、細胞膜修復、転写調節、栄養リモートセンシングなど別の細胞プロセスに参加(文献 13 見直し) のホメオスタシスで彼らの中心的な役割を強調します。いくつかの研究は、ライソゾーム機能、年齢依存的な低下と様々 な神経変性疾患13間の関連を示しています。一貫して、古い細胞のライソゾームの機能を復元すると、高齢化に関連した表現14,15の発症を遅らせることができます。Intralumen 環境の組成の研究では、古い細胞のライソゾームの機能の崩壊はリソソームタンパク16の生産の減少のためではないことを示唆しています。また、intralysosomal 酸味、その酵素活性の重要な要件の損失可能性がありますリソソームを介したタンパク質分解17でドロップの根底にあることが提案されている.この仮説を検証することができる、試薬およびレプリケート可能で一貫性のある方法で生きた細胞のライソゾーム pH のダイナミックな変化をプローブするためのプロトコルの開発が不可欠です。
線虫 c. エレガンスの腸みみずの主要な代謝組織であり、全身の恒常性と寿命の重要な調節因子。変化を評価するアッセイを開発したどのようにリソソームを介したタンパク質分解を決定するワームの腸内リソソーム内腔の酸性度で高齢化に貢献します。Hasn't されてまだ、体内ライソゾーム pH18.の小さい増加を検出する成功したプロトコルを確立する努力が pH に敏感な fluorophores が付いては、腸内のリソソームをマークする線虫で従来使用されてきた、ここでは、OP50 食品に pH に依存した蛍光体 (cDCFDA) が組み込まれています簡単で便利な餌プロトコルを使用してc. の elegansの腸の細胞のライソゾーム酸性度の損失を検出する使用できるプロトコルを提供します。
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Protocol
1. 染色し、腸内リソソームをイメージ
- シード線虫成長媒体 (NGM) 鋼板 OP50
- 19推奨プロトコルに従って NGM 板を準備し、閉じたプレートは室温で 2 日間乾燥を許可します。
- 滅菌ルリア スープ (LB) スープに OP50 細菌を接種する、37 ° c 36 h または外径が 0.2 〜 0.4 まで揺れインキュベーターや水のお風呂で育ちます。細菌培養を用いた OD を避ける > 1 または外径 < 0.2。
- 一度 NGM 板が乾燥、プレートの中央に OP50 接種のドロップ (〜 30 μ L) を配置し、約 2 cm × 2 cm サイズでは、パッチにドロップを広めます。
注: 任意残り OP50 接種は 1 ヶ月最大 4 ° C で保存できます。 - 接種に (約 10 または 15 分) が乾燥したら OP50 板を反転し、36 h の 37 ° C で版を孵化させなさい。
- 36 時間後まで後で使用の定温器および 4 ° C でストアからプレートを削除します。
注: プレートは 4 ° C で 1 ヶ月に適してする必要があります。
- OP50 に cDCFDA を補う
- OP50 プレートの上に cDCFDA を補うためには、ジメチルスルホキシド (DMSO) で 10 mM cDCFDA の在庫を用意してください。光と後で使用のための-20 ° C でのストアから保護された cDCFDA のソリューションを保持します。
- パッチ全体が cDCFDA で均一に覆われているように、2 cm × 2 cm OP50 パッチの表面に 10 mM cDCFDA 溶液 100 μ L をそっと置きます。
注: OP50 のパッチ全体が cDCFDA で覆われていることが非常に重要です。必要な場合は、各プレートの cDCFDA の最大 150 μ L を使用します。また、cDCFDA ソリューションが OP50 パッチから流れる cDCFDA の食品に組み込まれません、染色強度縮小になりますので OP50 パッチの境界を超えて拡張していないことが不可欠です。 - CDCFDA ソリューションのすべての細菌のパッチに吸収されるまで、ベンチ上暗いボックスに OP50 プレートを置き (通常約 25 〜 30 分)。
- CDCFDA を使用してワームを染色
- CDCFDA は、OP50 パッチを浸透している完全に、一度プレートごとの以上 20 のワームを置き、14 時間の最小値のための 20 の ° C で反転板を孵化させなさい。
注: ライトへの露出を最小限に抑えるため不透明なボックスに cDCFDA プレートを配置することをお勧めします。 - 実験の摂取量の違いを制御し、cDCFDA 信号を正規化する (推奨) 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) (共同染色フッ素) ホウ素 (たて 1 ミリメートルのソリューションの 2.5 μ L)、その蛍光は主として非変酸性 pH スペクトル acidotropic 弱いアミン染料 (試薬の一般的な名前の材料表を参照してください)。
注: これが不十分な cDCFDA 染色強度を提供し、ライソゾーム pH の誤った解釈を与えるので 14 h 未満のワームを染色しません。
- CDCFDA は、OP50 パッチを浸透している完全に、一度プレートごとの以上 20 のワームを置き、14 時間の最小値のための 20 の ° C で反転板を孵化させなさい。
- 顕微鏡のスライドの準備
- テープに約 3 インチ ミラー (図 1) などの滑らかな平らな面に離れてラベル付けの 2 つの平行ストリップを配置します。
- 撥水スプレーが付いているミラーの表面をコート、余分な液体をふき取る。
- 完全に液化まで電子レンジで (蒸留 H2O に溶解) 2% の agarose を溶かし、テープの 2 つのストリップ間の agarose の 50 μ L のドロップを配置し、スライドが垂直のストリップに顕微鏡のスライドとドロップについて簡単に説明テープ。Agarose が固化した後、スライドの下の円形のパッドを形成スライドを裏返し、5 mM アジ化ナトリウム (NaN3) agarose パッド上の 10 に 15 μ L を追加します。
注: ナン3はシトクロム C 阻害剤時に低濃度で使用、可逆画像の中には移動しませんので、ワームに麻酔がかかります。 - CDCFDA と補われる OP50 プレートからワームを選ぶし、任意 OP50 せずきれいな NGM プレートに転送しています。ワームは、地表から削除する、OP50 のほとんどを許可する秒数移動するワームを許可し、5 mM アジ化ナトリウムを含む agarose パッドにワームを転送します。
- すぐにカバー スリップでアガロース パッドをカバーします。優しくこれワーム破裂で起因できるので、あまりにも多くの圧力を適用することがなくカバー スリップを配置することを確認します。
注: cDCFDA を添加した OP50 細菌蛍光顕微鏡で可視化したとき、それ故にアジ化ナトリウムを含む agarose パッドにそれらを置く前に可能な限り、ワームをきれいにすることが重要です。線虫(N2、野生型のコントロールを含む) の以上 6 系統を準備中している場合、6、ワームが agarose パッド上の乾燥しないでくださいことを確保するためのバッチのサンプルを準備することをお勧めします。いくつかの系統で、外陰部はそれに応じて計画することが重要ですので、カバー スリップからの圧力により時間の延長期間の後破裂を開始します。
- 共焦点顕微鏡
注: いくつかの顕微鏡蛍光強度を補うため蛍光の変数のレベルが自動的に増加する組み込み機能があります。そのような顕微鏡は、サンプルの蛍光強度は増加が本質的にするので、cDCFDA で染色ワームをイメージングのためによく働かないかもしれない。- 励起/蛍光波長 488/530 に設定を使用して標準的な共焦点顕微鏡のイメージングを実行 cDCFDA の nm。腸内リソソームの単一の平面画像 (ない Z スタック) を取るし、強度の定量化のための焦点 (最大信号強度) は、リソソームのみを使用します。
注: おそらく染料の可用性の違いのためのすぐ後方咽頭に小腸細胞のリソソームを維持 cDCFDA 染色遺伝子型や年齢に関係なく、それゆえ注意が必要これらの細胞のリソソームをイメージングを避けるために。 - 2 日間の古い野生型 N2 はまずワームを含むスライドをイメージします。そうしながら染色 cDCFDA が飽和状態ではないことを確保するためのレーザー出力のピンホール、絞りなど共焦点撮像パラメーターを調整します。
注: これらの設定を設定した後は変更その日の画像の全体の持続期間のため。 - 腸 (3 に 4 枚ワーム) の単一の平面の 1024 x 1024 ピクセルの画像をキャプチャ、60 倍レンズを使用します。
注: ワームの cDCFDA の発光スペクトルは、520 nm は、報告された蛍光スペクトル20、腸蛍光 (図 3) とは異なる特定の信号読み出しを提供するとの一致で単一の顕著なピークを得られます。 - 生共焦点画像 (.lsm ファイル) を各チャネルの .tiff ファイルとしてエクスポートします。
- 次に、ImageJ を開き、ファイルをクリックして |開いてを定量化する画像ファイルを開きます。イメージが読み込まれると、一度 ImageJ で楕円形選択ツールを使用して、利益 (率 ROI) の領域を選択します。
- その後、分析をクリックして |メジャー ROI の蛍光強度を定量化します。画像 1 枚あたり 4-5 異なるフォーカスのリソソームを選択し、利益 (率 ROI) の各地域の平均の相対的な蛍光強度を計算します。
- 各イメージのリソソーム間腸地域のバック グラウンド蛍光強度を測定します。リソゾーム蛍光強度の値からバック グラウンド蛍光強度の値を減算します。
- 合計では、約 30 に 50 cDCFDA 強度 (6 に 10 動物) テストされる各緊張に個別正規化した値を収集します。これらの値を使用して、任意の適切な統計解析ソフトウェアを使用してボックス、ウィスカのプロットを印刷します。
注: は、蛍光強度の比較が同じ染色実験のサンプル プロセス内で関連するだけになるよう温度、培養時間、動物の全体的な健康/年齢のような要因によってかなり異なります染色できます。したがって、すべての染色実験のコントロールを処理するために重要です。統計的な差異を計算 (t-テスト)、適切な統計ソフトウェアを使用します。 - イメージすべては順番に世話を撮像パラメーターのいずれかを変更すること (同じ日にステンド グラス) 同じ実験から系統します。
- 励起/蛍光波長 488/530 に設定を使用して標準的な共焦点顕微鏡のイメージングを実行 cDCFDA の nm。腸内リソソームの単一の平面画像 (ない Z スタック) を取るし、強度の定量化のための焦点 (最大信号強度) は、リソソームのみを使用します。
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Representative Results
cDCFDA は pH 依存的にリソソームを汚れ、その低い pKa およびリソソームに準備ができて吸収理想的な pH センサー21になります。cDCFDA 染色、ライソゾーム pH (pH が下がると強度の増加が染色されているすなわち)18,22に反比例します。cDCFDA 信号が v-atp アーゼ プロトン インポート22 に必要なリソソームの膜タンパク質を消耗したワーム、クロロキン、リソソーム酸性化阻害剤の 20 mM で扱われる動物のリソソームに一貫して弱い.これらは、cDCFDA 他の遺伝的背景や治療法染色の相対的なレベルを評価するときに使用する重要なコントロールです。
我々 も見つけるフィットネス cDCFDA 露出の明白な効果または扱われたワーム (データは示されていない) の不妊治療。このプロトコルを使用して、生殖の野生型ワームのリソソーム中の酸度の内因性損失を識別されます。図 3 に示すように、cDCFDA 蛍光シグナルは若い (2 日ポスト L4) のリソソームに堅牢な線虫、リソソーム酸性を示すを再現します。染色強度は、リソソームの 1p063 を大幅に削減し、( vha V-atpase サブユニット遺伝子のノックダウン) 経由でこれらの細胞小器官にプロトンの流入の減少、ワームのように古い (8 日ポスト L4) ワームは同様に見られる。このメソッドを使用して、我々 は生殖動物 (図 2図 3の蛍光画像の図) の腸内リソソーム酸性度の生理学的な損失を検出しました。減らされた cDCFDA は、ワームがアルカリ化されたリソソーム タンパク質クリアランスの可能な障害を指す日 8 (ポスト L4) の腸内信号します。これは、実際には場合は、これらの動物はかなりこのライフ ステージ22でリソソーム内タンパク質凝集体を蓄積します。ルーメンの脱酸性化がこのプロセスの役割を検証するため、私たち共同染色若いへのプロトンは正しくインポートする必要がありますしたがって v ATPase ポンプ機械 (VHA 2/VHA 8) の 2 つのコアコンポーネントの RNAi で枯渇していた動物を再現リソソーム。予想通り、 vha 2 vha 8 RNAi 動物、生殖段階で示した削減 cDCFDA 蛍光信号生殖の野生型ワームのそれに匹敵し、アルカリ化されたリソソーム (図 3) と一貫性のあります。
図 1: 顕微鏡のスライドの準備します。顕微鏡のスライドを準備するために従う手順を示すシンプルなステップバイ ステップの概略。
図 2: 使用 pH 感受性色素c. の elegansの腸内リソソームの酸性度を調べるため。(2 日目) の再現やポスト生殖 (8 日目) ワームに腸 cDCFDA の蛍光強度のパターンを示す図。上の図を示す全体ワーム.下部を表すボックス拡大、中心部の腸管、腸地域の図を投影します。リソソームは、腸内細胞の細胞質でさまざまなサイズの小胞として描かれています。図 3画像とこれらのスケマティック ダイアグラムを比較します。
図 3: cDCFDA 画像を汚損します。2 日目と日 8 (L4 の記事) を示す代表的な画像vha 2 vha 8 RNAi ワームの腸内リソソームと同様にc. の elegans腸内リソソーム (N2 野生型) cDCFDA で染色染色 cDCFDA (肯定的な制御)。vha 2 vha 8胞膜 ATPase (vATPase)、ライニング リソソーム内腔の酸性化によって、ライソゾーム膜プロトン ポンプのサブユニットをエンコードします。
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Discussion
高齢化に貢献するさまざまな細胞および分子イベント生活史特性と遺伝的要因によって影響を受けます。私たちの最近の研究22では、生殖周期がライソゾーム pH の動態の調節を介して相馬のフィットネスの制御において重要な役割を果たしていることを示唆しています。V ATPase の転写は、順番により、酸性リソソームのアップレギュレーションによって動物を積極的に再現しながら、ライソゾームを介したタンパク質分解を促進しました。再現 v ATPase 式滴末リソソームが alkalinize、タンパク質凝集体がこれらの細胞に蓄積されます。
リソソーム酸性を損なう疾患が変更された v ATPase 活性、によって引き起こされると示されているし、脳内 v ATPase 機能の低下が様々 な神経変性疾患23の根底にも提案されています。さらに我々 の結果は、障害 v ATPase 機能は細胞の老化と高齢化24の原因であるという仮説をサポートします。
老化細胞の細胞学的特徴の 1 つ古い細胞1,25,26,27,28,29と集約された誤って折りたたまれたタンパク質の進歩的な形成であります。生殖の線虫のように通路哺乳類培養末リソソーム内腔に集計があります同様の蛋白質細胞27,29の。それは損傷を受けたタンパク質と細胞小器官アルカリ化されたリソソームへの継続的な流入が他につながるこれらのライソゾームの機能の崩壊の結果をもっともらしいリソソームはオートファジー経路のターミナル終点なので最終的には細胞の老化に寄与するダウン ストリーム イベント。
ここで説明されているプロトコルは、ライブの腸内リソソームに相対的な酸味のシンプルで再現性のある評価を生成する設計されています線虫。狭い pH 範囲 (4.5-5) は、適切なタンパク質分解のためこれらの細胞小器官で必要があるので、pH の微妙な増加は細胞およびティッシュの恒常性のための17に劇的な影響あります。蛍光特性と cDCFDA の低い pka は、この関連する生理学的 pH ウィンドウ18の酸性度の変化をキャプチャするこの染料をことができます。リソソームの汚損のためをお勧めします cDCFDA の濃度は、撮像パラメーターとイメージング システムに基づいてライソゾームの pH 変化の最高の可能な読み出しを提供するために最適化されています。それでも、cDCFDA 染色パターンのライソゾーム pH の変化が正確に反映されないことなどのイメージング設定に基づいてさまざまなエンドユーザーの cDCFDA 染色の結果が異なる場合があります。この場合、cDCFDA (10 ~ 100 mM) の濃度の変化を使用してバリエーションをイメージングに最適な濃度を決定するアクションの最高のコースになる野生型 N2 ワームで 2 日目と 8 日目のポスト L4。理想的な cDCFDA の濃度は、若者 (2 日目記事 L4) ワームのリソソームが過飽和されることがなく効率的に汚れが、また古い (8 日ポスト L4) ワームのための減らされた染色強度を示しています。
CDCFDA 染色法の制限の 1 つは、その長い潜伏時間です。ワームは特定の時点で孵化させるとき、~ 24 h 後にのみ結果を視覚化できます。それはc. の elegansライソゾーム pH のリアルタイムの読み出しを提供するおそらくリソソーム膜タンパク質にタグ付きの pH に敏感な蛍光体を使用してのひずみを開発した方が効率的でしょう。
一方、いくつかの異なる手法が存在するc. の elegansの腸内 pH を評価するためのこれらの技術のほとんど全体30,として腸の pH を評価または時間のかかるである、体内への注入を必要とします。面倒な31。cDCFDA は、その変更をライソゾーム pH または生理学、線虫変異を検索する餌の RNAi ライブラリを使用して大規模な遺伝スクリーンの容易に適用することができます。このメソッドののみに重要な要素は、cDCFDA 使用の若者 (2 日目記事 L4) を含めるようにしてくださいされている濃度セッションごとに共焦点レーザー顕微鏡の構成のためのベンチマークとして N2 制御系統。
老化するライソゾーム pH の貢献については、それはライソゾーム酸性細胞と環境の異なる入力への応答のダイナミックな変化の背後にある調節のメカニズムを解剖することが重要になります。cDCFDA 染色は線虫で、この研究を拡張するの 1 つ戦略として使用することがあります。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
系統、自然科学工学研究会議 (レベル) に線虫の遺伝学センターとカナダ財団の資金調達の革新 (CFI) のために感謝したいと思います。博士 Exing 王 (アソシエイト ・ ディレクター、光イメージング施設と同様、博士 Lizhen 陳 (細胞工学システム、解剖学、UT 健康サン ・ アントニオ) すべての線虫の実験のための彼女の研究室設備の無制限使用を許可するために感謝したいと思います、ユタ州健康サン アントニオ) 共焦点顕微鏡による援助のため。サポートおよびビデオ撮影を容易にするために奨励を提供するため博士マイロン イグナチオに感謝も申し上げます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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