Summary
Um guia passo a passo para sondar a perda da acidez dos lisossomos no intestino de c. elegans usando o corante vital sensíveis ao pH 6 - carboxi - 2', 7'-diclorofluoresceína diacetato (cDCFDA)
Abstract
O nemátodo Caenorhabditis elegans (c. elegans) é um sistema de modelo que é amplamente utilizado para estudar a longevidade e os caminhos do desenvolvimento. Tais estudos são facilitados pela transparência do animal, a capacidade de transmitir e reverter ensaios genéticos, a relativa facilidade de gerar proteínas fluorescente etiquetadas e o uso de corantes fluorescentes que podem também ser injetadas no início embrião ou incorporados em seu alimento (e. coli estirpe OP50) para rotular organelas celulares (por exemplo, 9-dietilamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-1 e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Aqui, apresentamos o uso de um corante fluorescente de sensíveis ao pH que manchas lisossomos intestinais, fornecendo uma leitura visual de alterações fisiológicas, dinâmicas na acidez dos lisossomos em worms ao vivo. Este protocolo não mede pH dos lisossomos, mas prefiro visa estabelecer um método confiável de avaliação fisiológicas relevantes variações na acidez dos lisossomos. cDCFDA é um célula-permeant composto que é convertido para o fluorescente fluoróforo 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) após hidrólise por esterases intracelulares. Protonação dentro de lisossomos armadilhas cDCF nestas organelas, onde se acumula. Devido a sua baixa pKa de 4.8, esse corante tem sido usado como um sensor de pH no fermento. Aqui nós descrevemos o uso de cDCFDA como suplemento alimentar para avaliar a acidez dos lisossomos intestinais em c. elegans. Esta técnica permite a detecção de lisossomos alcalinizante em animais vivos,, e tem uma ampla gama de aplicações experimentais, incluindo estudos sobre envelhecimento, autofagia e biogênese dos lisossomos.
Introduction
A aparência de agregados de proteínas é amplamente aceito para ser uma marca registrada de envelhecimento em pilhas eukaryotic1,2,3e a formação do que é pensado para estar entre os condutores de princípio da senescência celular4 , 5 , 6 , 7. há evidência crescente que, como células de idade catabolismo proteico é prejudicado, levando a um aumento na agregação da proteína. O colapso da proteólise em células de envelhecimento envolve uma imparidade de autofagia8 , bem como a degradação de proteínas mediada por Proteassoma9. Finalmente, oxidação de proteínas irreversível é aumentada em células velhas, prejudicando ainda mais o catabolismo de proteína10.
Autofagia foi inicialmente pensada para ser um processo não-seletivo para degradação em massa de proteínas danificadas, mas estudos recentes têm indicado que autofagia é altamente seletiva para o catabolismo de agregados de proteínas e organelas disfuncionais que não são passível de degradação através de de mecanismos de autorização outros proteína11. Durante o processo de autofagia, proteínas danificadas e agregadas são isoladas em uma vesícula de dupla membrana chamada o autophagosome. Este autophagosome então funde-se com as organelas ácidas chamadas lisossomos, o que leva à degradação do autophagosome carga12. Lisossomos representam o ponto de extremidade da via autophagic e participarem de diferentes processos celulares, tais como a reparação da membrana, controle transcricional e detecção de nutrientes; destacando seu papel centralizado na homeostase celular (revisto em ref. 13). Vários estudos têm demonstrado uma associação entre uma redução dependente da idade na função dos lisossomos e várias de doenças neurodegenerativas13. Consistentemente, restaurando a função dos lisossomos em células mais velhas pode retardar o aparecimento de fenótipos relacionadas ao envelhecimento14,15. Estudos da composição do meio de intralumen sugerem que o colapso da função dos lisossomos em células mais velhas não é devido a uma redução na produção de proteases lisossomais16. Como alternativa, tem sido proposto que perda da acidez intralysosomal, um requisito fundamental da sua actividade enzimática, pode fundamentam a diminuição da proteólise mediada por lisossoma17. Para ser capaz de explorar essa hipótese, é essencial desenvolver protocolos para sondar mudanças dinâmicas no pH dos lisossomos em células vivas de uma forma consistente e replicável e reagentes.
O intestino de c. elegans é o principal tecido metabólico em worms e é um crítico regulador da homeostase sistêmica e vida útil. Temos desenvolvido ensaios para avaliar alterações na acidez do lúmen de lisossomos intestinais de worms para determinar como mediada por lisossoma proteólise contribui para o envelhecimento. Embora sensíveis ao pH fluorophores têm sido utilizados anteriormente em c. elegans para marcar lisossomos intestinais, ainda não houve um esforço para estabelecer um protocolo bem sucedido que pode detectar pequenos aumentos no pH dos lisossomos na vivo18.. Aqui, nós fornecemos um protocolo que pode ser usado para detectar a perda da acidez dos lisossomos em células intestinais de c. elegans usando um protocolo de alimentação simples e conveniente que incorpora um fluoróforo sensíveis ao pH (cDCFDA) OP50 comida.
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Protocol
1. mancha e lisossomos intestinais de imagem
- Placas de mídia de crescimento nematoide de semente (NGM) OP50
- Preparar pratos NGM conforme o protocolo recomendado19 e permitir que as placas fechadas secar por 2 dias à temperatura ambiente.
- Inocular as bactérias OP50 no caldo estéril de caldo Luria (LB) e crescer em um tremendo banho de incubadora ou água a 37 ° C por 36 h ou até que o OD está entre 0,2 e 0,4. Evitar o uso de uma cultura bacteriana com OD > 1 ou OD < 0.2.
- Uma vez que NGM placas são secas, coloque uma gota (~ 30 µ l) de inóculo OP50 no centro da placa e espalhe então a queda em um patch mais ou menos que é 2 x 2 cm de tamanho.
Nota: Qualquer inóculo OP50 restante pode ser armazenado a 4 ° C por até um mês. - Inverter as placas OP50, uma vez que o inóculo secou (cerca de 10 ou 15 min) e então incubar as placas a 37 ° C para 36 h.
- Após 36 h, retire as placas da incubadora e loja a 4 ° C até utilização posterior.
Nota: As placas devem ser boas para até 1 mês a 4 ° C.
- Completando o cDCFDA para OP50
- Para complementar cDCFDA nas chapas OP50, prepare um estoque de trabalho de cDCFDA de 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO). Manter a solução de cDCFDA, protegida da luz e loja a-20 ° C para uso posterior.
- Coloque delicadamente a 100 µ l de solução de cDCFDA de 10mm para a superfície do patch OP50 2 cm x 2 cm, tal que o patch inteiro é uniformemente coberto com cDCFDA.
Nota: É muito importante que o patch inteiro de OP50 é coberto com cDCFDA. Se necessário, use até 150 µ l de cDCFDA para cada placa. Também é imperativo que a solução de cDCFDA não se estende para além das fronteiras do patch OP50, desde que qualquer cDCFDA que flui fora o patch OP50 não ser incorporado a comida e resultará em intensidade de coloração reduzida. - Colocar as placas de OP50 em uma caixa escura na parte superior do banco até que todos da solução cDCFDA é absorvido o patch bacteriano (geralmente cerca de 25 a 30 min).
- Coloração de vermes usando cDCFDA
- Uma vez que o cDCFDA completamente tem permeado o patch OP50, lugar não mais de 20 minhocas por placa e incubar as placas invertidas a 20 ° C por um período mínimo de 14 h.
Nota: Recomenda-se colocar as placas de cDCFDA em um caixa opaco para minimizar a exposição à luz. - Para controlar as diferenças de consumo entre experiências e para normalizar os sinais cDCFDA, (recomendado) co mancha com 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ( diflúor) boro (2,5 µ l de uma solução de recém-feitos 1 mM), um corante de amina fraco acidotropic cuja fluorescência é em grande parte não-variante sobre o espectro de pH ácido (consulte Tabela de materiais para nomes comuns de reagentes).
Nota: Não mancha worms para menos de 14 h, desde que este pode fornecer a intensidade de coloração inadequada cDCFDA e dar uma falsa interpretação de pH dos lisossomos.
- Uma vez que o cDCFDA completamente tem permeado o patch OP50, lugar não mais de 20 minhocas por placa e incubar as placas invertidas a 20 ° C por um período mínimo de 14 h.
- Preparar lâminas para microscopia
- Coloque duas tiras paralelas de rotulagem fita aproximadamente 3 polegadas separados sobre uma superfície lisa e plana, como um espelho (Figura 1).
- Revestir a superfície do espelho com spray repelente de água e limpe o líquido excedente.
- Derreter a agarose 2% (dissolvido em água destilada H2O) no microondas até completamente liquefeito, em seguida, coloque uma gota de µ l 50 de agarose entre as duas tiras de fita e rapidamente cobrir a gota com uma lâmina de microscópio, tal que o slide é perpendicular às tiras de fita. Depois que a agarose tem solidificado, formando uma almofada circular sob o slide, vire o slide e adicionar 10 a 15 µ l de 5mM de azida sódica (NaN3) sobre a placa de agarose.
Nota: NaN3 é um inibidor do citocromo C que, quando usado em baixas concentrações, anestesia reversível vermes para que eles não vão se mover durante a imagem latente. - Pegar vermes da placa OP50 suplementado com cDCFDA e transferi-los para um prato NGM limpo sem qualquer OP50. Permitir que as minhocas mover-se por alguns segundos permitir que a maior parte da OP50 para ser removido da superfície dos vermes e depois transferir os vermes para a almofada de agarose contendo azida sódica 5 mM.
- Cubra imediatamente o pad de agarose com uma lamela. Certifique-se de colocar suavemente a lamínula sem aplicar demasiada pressão, pois isso pode resultar em estouro de vermes.
Nota: OP50 bactérias suplementadas com cDCFDA fluorescem quando visualizadas por microscopia, portanto, é importante limpar os vermes como o melhor possível antes de colocá-los na plataforma de agarose contendo azida de sódio. Se preparando mais de 6 cepas de c. elegans (incluindo N2, controle de tipo selvagem), é aconselhável preparar as amostras em lotes de 6, a fim de assegurar que os vermes não secar na rampa de agarose. Em algumas variedades, a vulva começa a romper-se após longos períodos de tempo devido à pressão da lamínula, portanto é importante planejar de acordo.
- Microscopia confocal
Nota: Alguns microscópios têm um recurso interno que automaticamente aumenta a intensidade de fluorescência para compensar os níveis variáveis de fluorescência. Tais microscópios podem não funcionar bem para vermes manchados com cDCFDA, desde que eles inerentemente irão aumentar a intensidade de fluorescência das amostras de imagem.- Executar a imagem em um microscópio confocal padrão usando comprimentos de onda de excitação/emissão definidos como 488/530 nm para cDCFDA. Leve o único avião imagens (não Z-stacks) de lisossomos intestinais e usar apenas os lisossomos que estão em foco (intensidade de sinal máxima) para quantificação de intensidade.
Nota: Talvez devido a diferenças na disponibilidade de tintura, lisossomos das células intestinais diretamente posteriores da faringe mantêm cDCFDA coloração intensidade independentemente do genótipo ou idade, portanto, tenha cuidado para evitar a imagem de lisossomos nestas células. - Imagem do slide que contém 2 dia de idade tipo selvagem que N2 vermes primeiro. Enquanto isso, ajuste os parâmetros da imagem latente confocal como potência do laser, pinhole e abertura para assegurar que a cDCFDA intensidade de coloração não é saturado.
Nota: Uma vez que essas configurações são definidas, não alterá-los para toda a duração da imagem para esse dia. - Capturar imagens de 1024 x 1024 pixel de um único avião do intestino (3 a 4 imagens por worm) usando um 60 X lente de ampliação.
Nota: O espectro de emissão de cDCFDA em worms renderá um único pico proeminente em 520 nm coincidindo com sua fluorescência relatado espectro20, proporcionando uma leitura de sinal específico que é diferente de autofluorescência intestinal (Figura 3). - Exporte cru confocal imagem (.lsm) como arquivos. TIFF para cada canal.
- Em seguida, abra o ImageJ e clique em arquivo | Abrir para abrir o arquivo de imagem para ser quantificada. Uma vez que carrega a imagem, use a ferramenta de seleção de forma oval no ImageJ para selecionar uma região de interesse (ROI).
- Depois disso, clique no Analyze | Medida para quantificar a intensidade da fluorescência para o ROI. Selecione 4 – 5 diferentes em foco lisossomos por imagem e calcular a intensidade de fluorescência relativa média de cada região de interesse (ROI).
- Para cada imagem, medir a intensidade de fluorescência de fundo em uma região do intestino entre lisossomos. Subtraia os valores de intensidade de fluorescência de plano de fundo dos valores de intensidade de fluorescência dos lisossomos.
- No total, colete em torno de 30 a 50 individuais valores normalizados para cDCFDA intensidade (animais de 6 a 10) para cada tensão a ser testado. Use esses valores para plotar uma caixa e whisker plot usando qualquer software estatístico adequado.
Nota: A coloração pode variar consideravelmente dependendo de fatores como temperatura, tempo de incubação e a saúde geral/idade dos animais que comparações de intensidade de fluorescência só são relevantes no processo de amostras no mesmo experimento coloração. Portanto, é importante processar controles em cada experimento de coloração. Calcular as diferenças estatísticas (t-testes) usando qualquer software estatístico adequado. - Imagem todas as cepas do mesmo experimento (manchado no mesmo dia) em sequência, tomando cuidado para não alterar nenhum dos parâmetros de imagem.
- Executar a imagem em um microscópio confocal padrão usando comprimentos de onda de excitação/emissão definidos como 488/530 nm para cDCFDA. Leve o único avião imagens (não Z-stacks) de lisossomos intestinais e usar apenas os lisossomos que estão em foco (intensidade de sinal máxima) para quantificação de intensidade.
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Representative Results
cDCFDA manchas de lisossomos em uma maneira dependente do pH, e seu pKa baixo e captação pronta em lisossomos torna um sensor de pH ideal21. cDCFDA intensidade de coloração é inversamente proporcional dos lisossomos pH (ou seja, coloração aumentos de intensidade como pH diminui)18,22. os sinais cDCFDA são consistentemente fracos lisossomos de animais tratados com 20mm de cloroquina, um inibidor da acidificação dos lisossomos, em vermes empobrecidos de v-ATPase, a proteína complexa na membrana dos lisossomos que é necessária para a importação de prótons22 . Estas são importantes controles para usar ao avaliar os níveis relativos de cDCFDA em outras origens genéticas ou tratamentos de coloração.
Encontramos também sem efeitos aparentes de cDCFDA exposição na aptidão ou fertilidade de vermes tratadas (dados não mostrados). Usando este protocolo, identificamos uma perda endógena de acidez nos lisossomos de vermes pós-reprodutivo tipo selvagem. Como mostrado na Figura 3, o sinal de fluorescência cDCFDA é robusto nos lisossomos de jovens (dia 2 post L4) reproduzindo o c. elegans, significando lisossomos acidificados. A intensidade de coloração reduz consideravelmente após alcalinização de lisossomos, como observado em velhos worms (8 dias borne L4), bem como vermes onde o afluxo de prótons nestas organelas é reduzido (via nocaute de vha genes que codificam subunidades v-ATPase). Usando esse método, detectamos uma perda fisiológica de acidez dos lisossomos no intestino dos animais pós-reprodutivo (diagrama na Figura 2, imagens de fluorescência na Figura 3). O cDCFDA reduzida do sinal nos intestinos do dia 8 (post-L4) vermes apontaram alkalinized lisossomos e um possível dano na liberação de proteína. Este é de fato o caso, como estes animais acumulam significativamente agregados de proteínas dentro de lisossomos para este estágio de vida22. Para validar um papel de desacidificação de lúmen neste processo, nós co manchado jovens, reproduzindo animais que tinham sido esgotados por RNAi de dois componentes principais da máquina v-ATPase da bomba (VHA-2 e VHA-8) e, portanto, não devem corretamente importar prótons em lisossomos. Como esperado, vha-2 e vha-8 animais de RNAi, mesmo na fase reprodutiva, mostraram sinais de fluorescência reduzida cDCFDA comparáveis às de worms pós-reprodutivo tipo selvagem e consistente com alkalinized lisossomos (Figura 3).
Figura 1: preparação de slides para microscopia. Um simples esquema passo a passo mostrando os passos a serem seguidos para a preparação de lâminas para microscopia.
Figura 2: Uso de corantes sensíveis ao pH para sondar a acidez em lisossomos intestinais de c. elegans. Diagrama mostrando os padrões da intensidade de fluorescência cDCFDA intestinal em reprodução (dia 2) e pós-reprodutiva (dia 8) vermes. Os top diagramas mostram toda vermes. As caixas representam o fundo ampliada, projetada diagramas da região do intestino, o lúmen intestinal no centro. Lisossomos são retratados como vesículas de tamanho variável no citoplasma das células intestinais. Compare estes Diagramas esquemáticos com imagens de Figura 3 .
Figura 3: coloração de imagens de cDCFDA. Imagens representativas mostrando dia 2 e dia 8 (post L4) c. elegans intestinais lisossomos (tipo selvagem de N2) corados com cDCFDA, bem como lisossomos intestinais de vermes de RNAi vha-2 e 8-vha manchado com cDCFDA (controle positivo). VHA-2 e vha-8 codificam subunidades da ATPase vacuolar (vATPase), a bomba de prótons, forro da membrana lisossomal que é responsável pela acidificação do lúmen dos lisossomos.
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Discussion
Uma variedade de eventos celulares e moleculares contribuem para o envelhecimento, influenciado pela história de vida características e fatores genéticos. Nosso recente estudo22 sugere que o ciclo reprodutivo desempenha um papel importante no controle da aptidão da soma através da regulamentação da dinâmica dos lisossomos pH. Nós mostramos que a proteólise lisossomal mediada é promovido enquanto animais reproduzem-se ativamente por upregulation de transcrição v-ATPase, que por sua vez, garante lisossomos ácidos. Após o fim da reprodução, gotas de expressão v-ATPase, lisossomos alkalinize e agregados de proteínas que se acumulam nestas células.
Doenças que prejudicam a acidificação dos lisossomos foram mostradas para ser causado por atividade alterada v-ATPase, e declinando a função v-ATPase no cérebro também tem sido proposto para fundamentam várias de doenças neurodegenerativas23. Ainda mais nossos resultados suportam a hipótese de que a função prejudicada v-ATPase está entre as causas da senescência celular e envelhecimento24.
Um marco citológico das células do envelhecimento é a progressiva formação de agregados e misfolded proteínas no velho células1,25,26,,27,28,29. Como pós-reprodutivo c. elegans, proteína semelhante agregados são encontrados no lúmen dos lisossomos de tarde passagem mamíferos cultivados células27,29. Como lisossomos são o ponto de extremidade terminal da via autophagic, é plausível que o afluxo contínuo de proteínas danificadas e organelas em lisossomos alkalinized resulta em colapso funcional desses lisossomos, que então leva a outro eventos a jusante que, finalmente, contribuam para a senescência celular.
O protocolo descrito aqui foi projetado para gerar uma avaliação simples e reprodutível da acidez relativa em lisossomos intestinais de viver c. elegans. Porque um intervalo estreito de pH (4,5 – 5) é necessário nestas organelas para proteólise adequada, sutis aumentos no pH tem consequências dramáticas para de homeostase celular e tecido17. As características de fluorescência e pka baixo de cDCFDA permite que esta tintura capturar as alterações na acidez neste pH fisiologicamente relevantes janela18. A concentração de cDCFDA recomendado para coloração de lisossomos foi otimizada para fornecer a melhor leitura possível de mudanças no pH dos lisossomos, com base em nossos parâmetros de imagem e sistema de imagem. Mesmo assim, os resultados de cDCFDA coloração podem variar para diferentes usuários finais com base em sua configuração de imagem tal que mudanças de pH lisossomal não podem ser refletidas com precisão no padrão de coloração cDCFDA. Se isso acontecer, o melhor curso de ação seria usar variando as concentrações de cDCFDA (10 a 100 mM) para determinar a concentração ideal para variações de imagem em vermes tipo selvagem N2 no dia 2 e dia 8 post L4. A concentração de cDCFDA ideal é aquele que manchas lisossomos de vermes jovens (dia 2 post L4) eficientemente sem estar saturado, mas também mostra uma diminuição da intensidade coloração para velho (dia 8 post L4) vermes.
Uma das limitações da técnica de coloração do cDCFDA é seu tempo de incubação longa. Quando os vermes são incubadas em um ponto específico de tempo, os resultados podem ser visualizados somente após ~ 24 h. Seria mais eficiente para desenvolver uma cepa de c. elegans que fornece uma leitura em tempo real do pH dos lisossomos, presumivelmente usando um fluoróforo sensíveis ao pH marcado para uma proteína de membrana dos lisossomos.
Enquanto existem algumas técnicas diferentes para avaliar o pH no intestino de c. elegans, a maioria destas técnicas ou avaliar o pH do intestino como um todo,30, ou requerem a injeção na cavidade do corpo, que é demorado e complicado31. cDCFDA pode ser facilmente aplicado para telas de genética de grande escala usando bibliotecas de RNAi alimentação para procurar c. elegans mutantes que mostrar alterado dos lisossomos pH ou fisiologia. Os aspectos críticos apenas desse método são a concentração de cDCFDA usado e certificando-se de incluir um jovem (dia 2 post L4) tensão de controle N2 como referência para a configuração de imagem latente confocal durante cada sessão.
Para compreender melhor a contribuição do pH dos lisossomos ao envelhecimento, será importante dissecar os mecanismos de regulação para trás as mudanças dinâmicas na acidez dos lisossomos em resposta a entradas de celulares e ambientais diferentes. cDCFDA coloração pode ser usada como uma estratégia para estender esta investigação em c. elegans.
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Disclosures
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o centro de genética Caenorhabditis para tensões, as ciências naturais e Conselho de pesquisa de engenharia (NSERC) e a Fundação do Canadá para a inovação (TPI) para financiamento. Gostaríamos de agradecer o Dr. Lizhen Chen (departamento de sistemas de célula e anatomia, UT saúde San Antonio) por permitir o uso irrestrito de seus laboratórios para todos os experimentos de c. elegans , bem como Dr. Exing Wang (diretor associado, Optical Imaging Facility UT saúde San Antonio) para obter assistência com microscopia confocal. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Myron Ignatius para fornecer apoio e incentivo para facilitar a gravação do vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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