Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

ניתוח של מינרלים המיוצר על ידי hFOB 1.19 ואלקטרון Saos-2 תאים באמצעות שידור עם אנרגיה ואנליזת רנטגן Microanalysis

doi: 10.3791/57423 Published: June 24, 2018

Summary

אנו מציגים פרוטוקול כדי להשוות את המצב של מינרלים שלפוחית שפורסמו על ידי שתי שורות תאים עצמות אנושיות: hFOB 1.19 ו- Saos-2. הפרופילים שלהם מינרליזציה נותחו על ידי Alizarin אדום-S (AR-S) מכתים, ויזואליזציה אור אולטרה סגול (UV), הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הדמיה, אנרגיה ואנליזת רנטגן microanalysis (EDX).

Abstract

וידאו זה מציג את השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים עם אנרגיה ואנליזת רנטגן microanalysis (TEM-EDX) כדי להשוות בין המדינה של מינרלים שלפוחית שפורסמו על ידי שתי שורות תאים עצמות אנושיות: hFOB 1.19 ו- Saos-2. שורות תאים אלה, לאחר הטיפול עם חומצה אסקורבית (AA) וβ-glycerophosphate (β-GP), עוברים transdifferentiation osteogenic מלאה של התפשטות כדי מינרליזציה ולייצר מטריקס שלפוחית (MVs) המפעילות אפטיט התגרענות ב מטריצה חוץ-תאית (ECM).

בהתבסס על Alizarin האדום-S (AR-S) צביעת וניתוח של ההרכב של מינרלים lysates תא באמצעות אור אולטרה סגול (UV) או שלפוחית באמצעות הדמיה TEM ואחריו EDX כימות ומיפוי יון, אנחנו יכולים להסיק אוסטאוסרקומה הזה Saos-2 ו- osteoblastic תאים hFOB 1.19 חושפים פרופילים נפרדים מינרליזציה. Saos-2 תאים mineralize ביעילות רבה יותר מאשר תאים hFOB 1.19 ומפיקים מחצבים גדולים אינם גלויים תחת אור UV, אך דומים היידרוקסיאפטיט (HA) כי יש להם תחליפים יותר Ca ו- F.

התוצאות המתקבלות באמצעות טכניקות אלה מאפשרות לנו להסיק כי התהליך של מינרליזציה משתנה בהתאם לסוג התא. אנו מציעים כי ברמה התאית, מקורו ואת המאפיינים של שלפוחית predetermine הסוג של מינרלים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עצם היא סוג של רקמת חיבור מורכב משני חלקים: אורגני (תאים ו סיבי קולגן) מינרלים (תרכובות סידן, פוספט). הרכיבים העיקריים המינרלים בעצמות הם apatites1. סוגים שונים של תאים המוסמכת-מינרליזציה עצם (תאי העצם), שיניים (odontoblasts), סחוס (chondrocytes) לווסת את השלבים הראשונים של מינרליזציה על ידי ייצור החלבונים של מטריצות (ECM) ושחרור מטריקס שלפוחית (MVs) (איור 1). MVs הם 100-300 ננומטר קוטר שלפוחית לצבור סידן, פוספט הקלת התגרענות אפטיט, לאחר מכן לאגד קולגן2,3. לאחר מכן, MVs מתפוררות לשחרר apatites למדיום חוץ-תאית. Apatites ממשיכים לגדול עם סיבי קולגן טופס המטריקס העצם. מינרליזציה הוא נגרם על ידי אספקה מתמדת של Pאני ו- Ca2 + במדיום חוץ-תאית. נתונים שפורסמו לאחרונה מסוימים תומכים שלנו4,דגם5. רקמות רכות mineralize לא בתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, הסתיידות חוץ רחמי עלולה להתרחש בתנאים פתולוגיים כגון הסתיידות כלי הדם3. תאי הדם לרכוש את פנוטיפ אוסטאובלסט יכול לייצר MVs זירוז התגרענות של apatites, ליזום מינרליזציה המדיאלי, intimal בשכבות של הקיר של כלי הדם. מאז הסתיידות חוץ רחמי דומים endochondral נורמלי מינרליזציה3, הבנת המנגנונים המולקולריים של מינרליזציה של תאים osseous, chondrocytes צריך לספק רמזים על הסתיידות חוץ רחמי של רקמות רכות, כי הם נוצרו.

ההתפתחות ברקמות השלד מוסדר על ידי אנזימים שונים, גורמי גדילה, ואת היזמים או מעכבי של מינרליזציה. בפעולה עוינת של הרקמה-ספציפי אלקליין פוספטאז (TNAP) (איור 1), ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase אני (NPP1), יחד עם ankyrin (תודה), שולטת ריכוז רב-תכליתי אי-אורגנית (PPאני) 6. PPאני, מעכב חזק של היווצרות HA, זה הידרוליזה על ידי TNAP; NPP1 הידרוליזה נוקלאוטיד triphosphates כדי ליצור עמודיםאני בזמן תודה מייצאת PPאני מהתא ECM. היחס Pi/PPi יכול לווסת אפטיט היווצרות7,8 עם תוצאה פתולוגית אפשרית9.

קרום MV מועשר בחלבונים תחבורה יון המאפשרים את המשקעים הראשונית של סידן, פוספט בתוך MVs במהלך תהליך התגרענות (איור 1). המשגר פוספט 1 (בור) מסייעת לשלב Pאני שנוצר בחלל perivesicular לתוך MVs10,11. עשויים להיות מעורבים Annexins האיגוד לבין התחבורה של Ca2 + , תהליך biophysical יוזם מינרליזציה MV לומן12,13. . אנחנו מעדיפות את ההשערה, הציעה קודם לכן, עבור מינרליזציה בתוך שלפוחית לתוך הביצית של התגרענות פנימי של אפטיט פנימה MV לפני הפצת שלה ב- ECM ה-14,15. מידול במבחנה אישר את אינדוקציה של Ca2 +/ Pאני מתחמי-צורה proteoliposomes זני PS ו- AnxA516. ייתכן שהדבר מצביע על הצטברות הזה של Ca2 +, Pאני, AnxA5 ו- PS מתחמי ליפיד רפסודות של microvilli כמו membranesrepresent הליבה התגרענות (NC) של אפטיט בתוך מ'לעומת Annexins, TNAP גם מחזיקים מחייב קולגן קיבולות שעשוי להיות שימושי הצבת MVs לאורך סיבי קולגן ו, ב מגרה על התפשטות של מינרליזציה ב- ECM. Fetuin A ו- osteopontin (OPN)17, מכונים מעכבי היווצרות אפטיט עשוי להאט את התפשטות של מינרליזציה על הגרדום סילוק. התגרענות והתפשטות אירועים נפרדים, לשעבר שלפני האחרון, גם עשוי להיות רלוונטי עבור תהליך פתולוגי מינרליזציה.

לגלות איך הכימיה של סידן פוספט מתחמי עשויים להשתנות מינרליזציה פיזיולוגיים, הסתיידות חוץ רחמי, יש צורך לזהות את המינרלים המיוצר על ידי תאי. Apatites הם קבוצה של סידן, פוספט המכיל מינרלים עם קריסטל כללי יחידת התא נוסחה Ca10(PO4)6X2, שבו X = קלרנית, F, OH. הם מסווגים כדלקמן18: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2,10(PO4) קה chlorapatite (CA)6Cl2 ו- Ca היידרוקסיאפטיט (HA)10(PO4 )6(OH)2.

הבחירה של שורות תאים אוסטאובלסט לזירוז היווצרות מינרל חיוני, מאז כל שורה תא תערוכות פרופיל ברורים של מינרליזציה. בדו ח זה, השווינו את התגרענות של מינרלים על-ידי שני דגמים שנבחרו התא האנושי של מינרליזציה: osteoblastic hFOB 1.19 תאים ותאים אוסטאוסרקומה Saos-2. אוסטאוסרקומה, נגזר תאים משמשים כמודלים osteoblastic ו Saos-2 תאים נשתמרו של תו osteoblastic הכי בוגרת19 בזמן מובחן hFOB העובר האנושי תאים נמצאים בשימוש נרחב כמודל עבור רגילה osteoblastic בידול20. הפרופילים שלהם מינרליזציה נותחו על ידי שיטות שונות: צביעת Alizarin אדום-S (AR-S), אולטרה סגול (UV) אור ויזואליזציה, הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הדמיה, אנרגיה ואנליזת רנטגן microanalysis (EDX) כימות ופתוח יון מיפוי. היתרון של TEM-EDX על טכניקות חלופיות השתמשו במחקרים קודמים הוא נותן תוצאות כמותיים ואיכותיים של יון החלפת אפטיט קריסטלים4,5,21. המטרה הכוללת של שימוש TEM-EDX היתה למצוא שיטה פשוטה עבור הדמיה וכימות של ההתפלגות של יונים Ca, F ו- Cl ב מינרלים שונים מסוגים שונים של תאים בשלבים שונים של תהליך מינרליזציה. שיטה זו בהצלחה שימש, לדוגמה, עבור ניטור האינטראקציה של אבץ חלקיקים עם כימיקלים coexisting והשפעתם משולב על אורגניזמים ימיים22. במחקר אחר, photocatalyst נחושת טיטניום החומרים בתמיסה המימית התאפיינה בהרחבה על-ידי פלזמה inductively בשילוב ספקטרומטר פליטה אופטי (ICP-OES), N2 physisorption (ב'), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, ראמאן ספקטרוסקופיה, TEM-EDX ו- photoelectrochemical מידות23. המטרה שלנו הייתה להשוות את מקור והמאפיינים של שלפוחית ומינרלים בשתי שורות תאים כדי להבין את המנגנון השולט מינרליזציה במהלך התמיינות osseous.

Figure 1
איור 1 . ערכה של השלבים הראשונים של מינרליזציה בתאים osseous מעורבים הסינתזה של חלבונים מטריצה חוץ-תאית (ECM) ושחרור של מטריקס שלפוחית (MVs) של הקרום. MVs לצבור סידן דרך הפעולה של סידן מחייב חלבונים, annexins ופוספט, דרך הפעולה של טרנספורטר פוספט אי-אורגנית (בור) ואחריו את הפעילות של רקמה שאינם ספציפיים אלקליין פוספטאז (TNAP), אשר dephosphorylates PPאני כדי Pאני, ובכך להקל התגרענות אפטיט. לאחר מכן, MVs להתפרק ולשחרר apatites למדיום חוץ-תאית. מינרליזציה הוא נגרם על ידי אספקה מתמדת של Pאני ו- Ca2 + ב חוץ-תאית בינוני4,5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. תא תרבות וטיפול

  1. לשים את כל החומרים הדרושים מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית ולחטא אותם תחת אור UV. התרבות והתקשורת: תערובת 1:1 של ירך חזיר של F12 ומדיה DMEM עם 2.5 מ מגלוטמין בתוספת פניצילין U/mL 100, 100 U/mL סטרפטומיצין, 0.3 מ"ג/מ"ל G418 ו 10% סרום שור עוברית (FBS) (v/v) כי עובר אנושי hFOB 1.19 SV40 גדול T אנטיגן transfected תאי העצם, 5A בינוני מקוי עם 1.5 מ מגלוטמין שיושלם עם פניצילין U/mL 100, 100 סטרפטומיצין U/mL 15% FBS (v/v) עבור תאים אנושיים אוסטאוסרקומה Saos-2.
  2. תרבות hFOB 1.19 תאים ב 34 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2 ותאים Saos-2 ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2- העבר תרביות תאים, גם hFOB 1.19 או Saos-2 תאים, החממה מכסה המנוע זרימה שכבתית ושנה המדיום 10 מ"ל של מדיום תרבות טריים עם FBS.
  3. דגירה תאים בלי תכשירים (resting תאים) או לעורר אותם עם µg 50/מ"ל חומצה אסקורבית (AA) ואחריו 7.5 מ מ β-Glycerophosphate (β-GP), שהוכן קודם לכן במים הנדסה גנטית, מסונן דרך 0.22 מיקרומטר סביבונים. להוסיף תכשירים של צינורות פלסטיק microcentrifuge על גבי המשטח של המדיום תרבות. בעדינות מוסיפים את המנה תרבות, תקופת דגירה של 7 ימים.

2. זיהוי של מינרלים סידן

  1. לשטוף את תרביות תאים עם פוספט מאגר מלוחים (PBS: 125 מ"מ NaCl, 5 מ מ. אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2HPO4, 1 מ מ ח'2PO4, pH 7.0).
  2. הוסף 5 מ של 2% (g:100 מ"ל) AR-S ב- PBS, pH 5.0 דגירה הלוחות למשך 30 דקות להכתים את המינרלים.
  3. לשטוף 3 פעמים עם PBS. בזהירות להוסיף PBS לקיר מאכל, נסה לא להרוס את המינרלים.
  4. להתבונן סידן מינרלים תחת מיקרוסקופ אור הפוך, תמונות.

3. הדמיה של הגששים תחת אור UV

  1. עבור תא lysates, התייחס תרביות תאים, נח או מגורה במשך 7 ימים, על פי פרוטוקול עיכול collagenase24.
  2. לאסוף את המדיום של תרביות תאים ולשטוף את התאים עם PBS.
  3. לעכל את התאים עם 3 מ"ל של 500 collagenase U/mL בפתרון של 0.25 M סוכרוז, 0.12 M NaCl, 0.01 M אשלגן כלורי, ומאגר 0.02 נקודות מ' טריס-HCl, pH 7.45, ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  4. מכנית לגרד את התאים, להעביר אותם צינורות פלסטיק microcentrifuge, ולהעביר אותם 10 פעמים באמצעות מזרק 1 מ ל 40 U עם 0.5 × 16 המחט.
  5. Centrifuge את הדגימות ב 500 g × במשך 5 דקות.
  6. למחוק את תגובת שיקוע והשהה בגדר תא ב- 500 µL הסחוס סינתטי הלימפה (SCL, 100 מ מ NaCl, 12.7 מ"מ אשלגן כלורי, מ מ 0.57 MgCl2, מ מ 1.83 NaHCO3, מ מ 0.57 NaH2PO4, 5.5 מ מ D-גלוקוז, 63 מ מ סוכרוז, 16.5 מ מ Hepes, pH 7.4).
  7. להעביר את היידרוקסיאפטיט (HA), fluorapatite (FA) ואבקות chlorapatite (CA) הבקבוקים על transilluminator UV עם מרית, להשתמש כפקדים.
  8. להעביר את lysates תא צינורות פלסטיק עם טיפים פלסטיק ומניחים בזהירות על transilluminator UV.
  9. קח תמונות תחת גלוי ו- UV אור.

4. הכנת זונדי TEM-EDX

  1. הכנה של מינרלים מכתים שלילי
    1. להשעות 2.5 מ"ג לאכסון המיוצר HA, CA ו- FA מינרלים25 ב- 500 µL של מים יונים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2 לשעה.
    2. לקחת את Formvar/פחמן 300 Mesh ני רשתות מהתיבה עם מלקחיים בתמיסה, מניחים על צלחת פורצלן רב טוב ושחרר 10 µL של המתלים HA, CA, הפא על הרשתות.
    3. יבש את הדגימות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. הכנה של נח, המרצת תאי להטבעת 26
    1. לאסוף בינוני מן התרבויות תא ולשטוף את התאים הקהיה פיזיולוגיים (PD) בינונית (125 מ"מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ NaHCO3, 1 מ מ ח'2PO4, גלוקוז 10 מ מ, 20 מ מ HEPES, pH 7.4).
    2. לתקן את התאים עם 5 מ של תערובת של 3% (g:100 מ"ל) paraformaldehyde/1% (g:100 מ"ל) גלוטראלדהיד במאגר סודיום פוספט 100 מ מ, ה-pH 7.2, לשעה בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע fume.
    3. לשטוף את התאים 5 מ ל 100 מ מ סודיום פוספט מאגר ולהסיר בעדינות את המאגר לאחר הרחצה.
    4. בחדר חשוך, postfix הדגימות עם 2 מ של 1% (g:100 מ"ל) אוסמיום ארבע-חמצני במאגר סודיום פוספט 100 מ מ, ה-pH 7.2, למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע fume.
    5. הסר אוסמיום ארבע-חמצני, לנצל את זה.
    6. לשטוף את התאים 5 מ ל 100 מ מ סודיום פוספט המאגר.
    7. לאחר מכן, מייבשים את הדגימות ב 5 מ ל aliquots סדרה פתרון אתנול מדורגת בטמפרטורת החדר: 25% (על-ידי כרך) במשך 5 דקות, 50% (על-ידי כרך) במשך 10 דקות, 75% (על-ידי כרך) למשך 15 דקות, 90% (על-ידי כרך) במשך 20 דקות. לבסוף להשתמש אתנול מוחלטת פעמיים, תקופת דגירה של 30 min ו- 12 שעות.
    8. לגרד את התאים מן התרבות פטרי פלסטיק, לאסוף לתוך צינורות פלסטיק microcentrifuge, centrifuge את הדגימות-g x 130 עבור 1 דקות.
    9. הסר את supernatants, להשעות את התאים 1 מ"ל של תערובת של שרף לבן LR, אתנול מוחלטת ביחס נפח של 1:2.
    10. מערבבים היטב את התוכן של צינורות זכוכית לפני השימוש, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    11. Centrifuge את הדגימות-g x 130 עבור 1 דקות.
    12. להסיר את supernatants, חזור על השלב הקודם באמצעות 1 מ"ל של תערובת 1:1 של שרף לבן LR ואתנול מוחלטת.
    13. מערבבים היטב, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    14. Centrifuge את הדגימות-g x 130 עבור 1 דקות.
    15. להסיר את supernatants.
    16. לבסוף להוסיף 1 מ"ל של שרף LR לבן טהור הדגימות פעמיים, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר צינורות פלסטיק.
    17. להכניס 500 µL של כל מדגם בתוך קפסולות ג'לי מוצקות.
      הערה: הדגימות מסומנות באמצעות גיליון קטנות של נייר ועיפרון כך השרף אינו הורס את התוויות.
    18. סגור את קפסולות ג'לי מוצקות, להכניס אותם לתוך צינורות פלסטיק microcentrifuge, צנטריפוגה-g 130 x עבור 1 דקות ברוטור והזזה.
    19. הסר את הכמוסות צינורות פלסטיק באמצעות משאבה ואקום.
    20. להעביר את הדגימות אל התנור, פולימריזציה ב 56 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
    21. הכן את אבני על ידי הרכבה אותם לתוך למחזיק, זמירה אותם לפירמידה.
    22. להכניס את המחזיק ultramicrotome, לצרף את הסכין אולטרה 45° יהלום ולמלא אותה עם מים יונים; זכור לנקות את הלהב של בועות אוויר נלווים.
    23. ואז חותכים למקטעים (700 Å) בעזרת סכין יהלום לתוך האמבט יונים מים.
    24. הגדר פיסות הנייר באמצעות עפעף שור ומקום שאותם על הצד המבריק של 300 Formvar/פחמן mesh ני רשת, לייבש אותם.
    25. להכין אצטט uranyl 2.5% (על-ידי כרך) אתנול מוחלטת בחושך תחת ברדס fume. לשמור את אצטט uranyl במיכל עופרת ולזכור לא לאסוף את המשקע.
    26. בחדר חשוך, counterstain את הרשתות של apatites סינתטי ודוגמאות תא עם אצטט uranyl 2.5% (על-ידי כרך) אתנול במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע fume.
    27. לשטוף את הרשתות באתנול 50% (על-ידי כרך), ואז במים יונים ויבש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה. לבסוף, שים את הרשתות לתוך התיבה.

5. TEM-EDX ניתוח

  1. TEM הדמיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מצוידים עם טווח מלא אנרגיה ואנליזת רנטגן microanalysis (EDX) ומערכת 11 מגה פיקסל מצלמה
    1. היכונו בעל בריליום התצפית של מינרלים ותאים. השתמש בכלים בתמיסה.
    2. הסר את שני הברגים והרם את צלחת בריליום, בריליום דסקית משאר הפלטה.
    3. הר על הרשת, הצד המבריק, על המחזיק.
    4. בזהירות המקום בריליום דסקית וצלחת בריליום, לדפוק בחוזקה את הברגים הצמדה.
    5. מכניסים את המחזיק תא ואקום והפעל את משאבת ואקום.
    6. ברגע ואקום מושגת, בעדינות להכניס בעל תא הדמיה והפעל את הקרן.
    7. על המסך פלורסנט, להגדיר את הפרמטרים הצמצם במיקרוסקופ. לבצע תיקון אסטיגמציה תמונה; הגדר את זום, פוקוס, ומסגרת; ולקחת TEM תמונות בהגדלה גדולה של 50, 000 X.
  2. גזע הדמיה ו- microanalysis רנטגן לצורך ניתוח ספקטרלי ואת ההלחנה
    1. הכנס את גלאי רנטגן (EDX) ואנליזת אנרגיה החדרה סריקה הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (גזע) הדמיה.
    2. לכוון את החדות של התמונה במצב פוקוס.
    3. לקחת גזע תמונות בהגדלה גדולה של 15, 000 X.
    4. בחר נקודת המדגם עבור microanalysis רנטגן ולאסוף ספקטרה.
    5. לקבל נתונים על-ידי סיכום כל המשקלים עבור כל מרכיבי הטבלה המחזורית המדגם (כ- 100%), המסמלת את התוכן של הרכיבים הנבחרים: Ca, F, קלרנית ו P (לפי % האטום). לאחר מכן, לחשב את היחס של Ca, F או קלרנית כדי P עבור כל דגימה.
  3. מיפוי יון
    1. בחר רכיבים כגון סידן, פלואור, כלור וזרחן לבצע מיפוי יון ולבצע EDX מפות של הרכיבים שנבחרו הדגימות.
    2. לקבל נתונים על-ידי המציין הלוקליזציה של אלמנטים שנותחה: Ca, F, קלרנית ו P (לפי % אטומי) ולחשב לוקליזציה שיתוף (ב %) של Ca, F או קלרנית עם P עבור כל דגימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

TEM-EDX מאפשר במבחנה ההדמיה של מטריקס שלפוחית (MVs) שפורסמו על ידי mineralizing תאים ושל מינרלים המיוצר על ידי מ'לעומת התוצאות המתקבלות בעזרת טכניקה זו להדגים התהליך של מינרליזציה רשאי להמשיך בצורה שונה סוגים שונים של תאים. הקווים תא שני קיבל את אותו הטיפול osteoblastic transdifferentiation, עדיין מגורה Saos-2 תאים על בסיס מינרלים מן ביעילות רבה יותר מאשר hFOB 1.19 תאי העצם, כפי שמעידים AR-S מכתים (איור 2). ייתכן שהדבר נובע פנוטיפ אוסטאובלסט בוגר יותר של תאים Saos-219 לעומת תאים hFOB 1.1920. הפריט החזותי של דגימות באמצעות transilluminator UV גרם הבהירו כי רק fluorapatites יכול להיות שנצפו תחת אור UV (איור 3). תמונות TEM הצביעו על כך מגורה Saos-2 תאים לייצר יותר שלפוחית המכילה מינרלים בהשוואה לתאים hFOB מגורה או עם נח Saos-2 תאים (איור 4, לוחות הימנית והאמצעית). Apatites סינתטי יש צורות שונות של מינרלים (איור 4, לוח נכון). תמונות TEM הראו הנוכחות של שלפוחית hFOB התאים 1.19 ו- Saos-2 תחת נח, מגורה תנאים (איור 5, עזב את החלונית). במפות יון EDX, נקודות אדומות מציינות סידן, נקודות ירוקות הצג זרחן ונקודות כחול הצבע על ההפצות פלואור (איור 5, בחלונית האמצעית). בתנאים מגורה, יש חפיפה חזקה בין התפלגויות של סידן וזרחן שלפוחית מיוצר על ידי תאים Saos-2 ובין פלואור זרחן שלפוחית מיוצר על ידי תאים hFOB 1.19 (איור 5, לוח נכון).

Figure 2
איור 2 . AR-S מכתים של מינרלים (אדום) המיוצר על ידי hFOB 1.19 (החלונית העליונה) ו Saos-2 (פאנל התחתונה) תאים או נח (R) או לאחר 7 ימים של גירוי עם AA וβ-GP (S)- בר: 25 מיקרומטר. תוצאה אופיינית עם n = 3 מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . גלוי (החלונית העליונה), ויזואליזציה אור UV (לוח האמצעי) של מינרלים HA, CA ו- FA סינתטי, של מינרלים המיוצר על ידי hFOB 1.19 (החלונית השמאלית התחתונה), Saos-2 (לוח נכון התחתון) תאים או נח (R) או לאחר 7 ימים של גירוי עם AA וβ-GP (S) . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 4
איור 4 . תמונות TEM של שלפוחית ומינרלים המיוצר על ידי hFOB 1.19 (החלונית הימנית), Saos-2 (לוח האמצעי) תאים או נח (R) או לאחר 7 ימים של גירוי עם AA וβ-GP (S). מינרלים HA, CA ו- FA סינתטי מוצגים פקדים (לוח הנכון). בר: לבן 500 ננומטר, שחור 250 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 5
איור 5 . תמונות TEM (החלונית הימנית) של hFOB 1.19 ו- Saos-2 תאים או נח (R) או לאחר 7 ימים של גירוי עם AA וβ-GP (S). יון מפות עבור Ca (אדום), קלרנית (צהוב), F (כחול) ו- P (ירוק) מ- EDX (לוח האמצעי). שיתוף לוקליזציה של אלמנטים (לוח נכון): סידן, זרחן (Ca), פלואור כדי זרחן (נ), או כלור כדי זרחן (Cl) כדי הייתה לכמת לפי המפות EDX. בר: 500 ננומטר. 3 ניסויים עצמאי עבור שתי שורות תאים בוצעו. עשר תמונות של כל משתנה (נח, מגורה) נלקחו ולאחר מכן 2 עד 6 מהם נבחרו לחישוב נוסף של רכיב משותף לשפות אחרות. תוצאה אחת אופיינית מוצגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בעיתון הנוכחי, אנו המתואר הפרוטוקולים עבור AR-S מכתים, זיהוי אור UV של fluorapatite, TEM-EDX במבחנה הדמיה של MVs שפורסמו על ידי mineralizing תאים ושל מינרלים בהפקת MVs. זה אפשרי להתייחס כל השיטות שהוזכרו לעיל על-ידי ביצוע שלבים לפתרון בעיות נפוצות מסוימות. כדי להשיג תוצאות אופטימליות, מספר שלבים קריטיים צריכה להתבצע בקפידה. ראשית, עדיף להוסיף AA (שהוא חומצי) ואחריו β-GP (וזה אלקליין) כדי לשמר את ה-pH 7.4 של המדיום תרבות. שנית, לאחר AR-S מכתים, ההפקדות סידן מוכתמים הם מאוד שבירים, התאים יש לחפוף כדי למנוע הרס של הגבישים על הוספת PBS. שלישית, תמיד לשמור את אצטט uranyl במיכל עופרת, אל תרים המשקע כי רק השבר מדולל אמור לשמש עבור קיבעון. רביעית, זכור אצטט AA ו- uranyl הם רגישים האור צריך להיות מטופל בחדר חשוך. חמישית, התערובת של LR לבן עם אתנול המוחלט צריך להיות מעורב לפני להתווסף הדגימות. שישית, הדגימות בכמוסות ג'לטין צריך להיקרא באמצעות גיליון קטנות של נייר ועיפרון כך השרף אינו הורס את התוויות. שביעית, הלהב של הסכין יהלום שצריך לנקות היטב של בועות אוויר. ח' דגימות להניחה בזהירות על הצד המבריק של הרשת איפה ממוקם הסרט Formvar/פחמן. הצב התשיעי כראוי את נקודת-אילו רנטגן microanalysis, יון המיפוי מתבצע על התמונה TEM להגביל את בעיות אפשריות עם זיהוי אפטיט.

למרות פרוטוקול הציג התבררה מאהדה ביותר בהתווית שלנו, זה אפשרי לשנות אותם כדי שיתאימו מטרות שונות. כמו עם כל טכניקה אחרת, זה גם יש מגבלות משלו. שיטות נוספות, כגון FTIR, צריך להיות מיושם כדי לאשר או לאמת את קיומו של יחס שהושג בחנו רכיבים8,12,26. השיטה TEM-EDX המובאת כאן היא שיפור משמעותי ביחס השיטה הקיימת, אשר הוא שילוב של מיקרו-ראמאן מבוססי מיפוי chemometric ושיטות והיא דומה להנפשה הדמיה של סילבר חלקיקים (AgNPs) תפוצה שונות משטחים של מינרל, מנגנון מולקולרי האינטראקציות שלהם21. דימות מבוסס ראמאן נבדקו על שני דגמים מינרלי (מאקרו - ו מיקרו בגודל). מפות ראמאן של n = 600-900 spectra עבור כל דגימה/פקד נותחו על ידי תוכנה וספוצ'י התוצאות אומתו באמצעות שיטות אחרות כגון ICP-לגבות, AFM ו- SEM-EDX. TEM-EDX שלנו ממפה הכולל n = 30 מסגרות ו- n = 6 spectra עבור כל דגימה/פקד נותחו גם על ידי תוכנת Microanalysis Suite, התוצאות אומתו באמצעות שיטות אחרות כגון FTIR, FM, TEM, SPM ו- 3D AFM טופוגרפית4 , 5. microanalysis TEM-EDX המוצע, כמו דימות מבוסס ראמאן, מחייב הכנת הדוגמא מינימלי בלבד, הוא ממש רגיש, לא פולשנית וחסכונית, יורחב למערכות אחרות הרלוונטיות. לסביבה האנושית.

הטכניקה הציג עשויה לשמש בתחום רחב של מחקר בעתיד. זה ניתן לשנות עבור החקירה של apatites טבעיים וסינתטיים שונים. זה גם יכול להיות מותאם כדי להתאים את הפרוטוקולים של ניסויים ביולוגיים, כימיים רגשים. יתר על כן, כל רכיבי מהטבלה המחזורית ניתן לנתח על מנת להמחיש לא רק המורפולוגיה של מינרלים, אלא גם לשינויים יון קומפוזיציה ותחליפי שלהם. חילוף יונים ב- apatites הוא הליך ידוע עבור יישומים ביו27. גורם פיזיולוגי אפשרי אחד השולט של Ca, F ו- Cl יונים או Sr, Mg, Mn ו- Zn יון מתכת להחלפת ב- HA במהלך היווצרות המינרלים, אשר היא נקודת מפנה בין פיזיולוגיים ופתולוגיים מינרליזציה, יכול להיות /PPi. Pi יחס7. אם מוחל כראוי, טכניקה זו מאפשרת שמבצע את המיפוי של מספר אלמנטים של האזור הסלולר, vesicular או מינרלי באותו מספר פעמים ברציפות.

בשנים האחרונות, נעשתה התקדמות רבה בנוגע במנגנונים של עצם מינרליזציה28,29,30,31,32,33. הבנו כי שורות תאים שונים יכול להיות ברורים פרופילים של שלפוחית ויצירת מינרלי. בהקשר זה, בחרנו שתי שורות תאים אנושיים: osteoblastic hFOB 1.19 ואוסטאוסרקומה Saos-2, אשר עוברים להשלים את transdifferentiation osteogenic של התפשטות כדי מינרליזציה ולייצר MVs המפעילות אפטיט התגרענות ב- ECM 34 , 35.

AR-S מכתים של פיקדונות סידן גילה כי תאים Saos-2 מגורה על בסיס מינרלים מן באופן שונה מאשר hFOB 1.19 תאי העצם. זה היה בקורלציה עם הייצור של מינרלים על-ידי-Saos-2 תאים שהיו לגילוי תחת אור UV לעומת אלה מיוצר על ידי תאים hFOB 1.19. הנתונים שלנו TEM-EDX גילה כי המינרלים מיוצר שלפוחית של Saos-2 תאים היו הדומה HA סינתטי עקב החפיפה בהתפלגויות סידן וזרחן. לעומת זאת, החפיפה בהתפלגויות פלואור ו זרחן ב שלפוחית מתאי hFOB 1.19 הצביעו על היווצרות של סוגים אחרים של מינרלים בנוסף apatites.

לסיכום, הממצאים שלנו מצביעים על כי השלפוחיות המוגלתיות הם גורמים מרכזיים של התגרענות מינרלי, במיוחד בזמן ברמה התאית5,25. יתר על כן הנתונים שלנו נוטים להסכים תיאוריה קודמת MVs יכול להיחשב כצורה מיוחדת של שלפוחיות זעירות מסוגלים להתחיל מינרליזציה בפנים, כמו גם מחוץ לתא4. ההשוואה של שלפוחית שוחררה מבית Saos-2 תאים, אשר mineralize באופן יעיל יותר, ושלפוחיות שוחרר מתאי hFOB 1.19 בשיטת TEM-EDX microanalytical תומך את ההשערה כי MVs הם עתירי המינרליים שלפוחית. זה משאיר פתוחה את השאלה הנוכחות של MVs נדרש לזירוז התגרענות אפטיט, איך זה עשוי לשנות פיזיולוגיים כדי מינרליזציה פתולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

ח"כ ו- ASK ביצע פעולות ידניות, ספ להכין ציורים ואת יצר את הסרט. שאל כתב היד, ליברות כתבה את התסריט, ח"כ הכנו את השולחן. SM, RB ו- SP באורח קשה לקרוא את הטבלה, ה-script, כתב היד. המחברים רוצה להודות חנה Chomontowska על הסיוע מעולה עם ultramicrotomy וכן שמעון Suski של הנריק בילסקי לסיוע שלהם מעולה עם ניתוח TEM-EDX. המחברים רוצה להודות ד ר פטריק מטעי לתיקון מקצועי בשפה האנגלית, ברברה Sobiak עבור הקלטה לפי ההוראות.

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 140639 N401 N ממשרד הפולני של מדע והשכלה גבוהה לשאול, על ידי מענקים מן המרכז המדע הלאומי, פולין 2016/23/N/NZ4/03313 ליברות ו- 2016/23/N/NZ1/02449 אל ח"כ, האיחוד האירופי האיחוד FP7 פרויקט BIOIMAGINE : הדמיה חדשנות במחקר ובחינוך, GA מס 264173, ועל ידי את הכספים סטטוטורי של Nencki המכון של ניסיוני הביולוגיה, האקדמיה למדעים של פולין.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D
for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5, (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9, (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862, (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38, (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281, (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27, (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31, (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74, (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278, (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10, (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282, (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86, (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13, (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24, (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25, (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23, (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106, (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16, (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23, (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93, (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183, (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12, (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157, (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305, (1), 156-165 (2005).
ניתוח של מינרלים המיוצר על ידי hFOB 1.19 ואלקטרון Saos-2 תאים באמצעות שידור עם אנרגיה ואנליזת רנטגן Microanalysis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter