Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית RNA בחיי עיר זיהוי

Published: March 27, 2018 doi: 10.3791/57444
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא גרעין האקומבנס חיוני שהבהרת בתפקוד קולטן D1 בזמן מחלה במערכת העצבים המרכזית. ביצענו את הרומן RNA בחיי עיר הכלאה assay להמחיש מולקולות RNA יחיד באזור ספציפי במוח.

Abstract

מערכת העצבים המרכזית, הקולטן סוג D1-אלפא (Drd1α) הוא הקולטן דופמין (DA) הנפוץ ביותר, אשר ממלא תפקיד חשוב בוויסות עצביים צמיחה והתפתחות. עם זאת, המנגנונים חריגות קולטן Drd1α תיווכה תגובות התנהגותיות, להתכוונן פונקצית זיכרון העבודה הם עדיין לא ברור. באמצעות ה-RNA הרומן בחיי עיר הכלאה assay, המחקר הנוכחי מזוהה דופמין Drd1α קולטן טירוזין hydroxylase (ה) RNA והביטוי של המעגלים הקשורות DA גרעין האקומבנס (NAc) אזור ואזור הסובסטנציה ניגרה (SNR), בהתאמה. Drd1α ביטוי ה-NAc מראה "דיסקרטית נקודה" צביעת דפוס. מין ברורים ההבדלים בביטוי Drd1α נצפו. לעומת זאת, תאנון מציג תבנית מכתימים "אשכולות". לגבי ביטוי TH, חולדות נקבות מוצגים ביטוי האות גבוה יותר בכל תא יחסית חיות זכר. השיטות המובאות כאן מספקים טכניקה הכלאה הרומן בחיי עיר חוקרת שינויים בתפקוד מערכת הדופמין במהלך ההתקדמות של מחלות מערכת העצבים המרכזית.

Introduction

תפקוד לקוי של מערכת הדופמין striatal מעורב ההתקדמות של סימפטומים קליניים שנצפתה במספר מחלות נוירוקוגניטיבי. קולטני D1 דופמין נוכחים קליפת המוח הקדם חזיתית (PFC) והאזורים striatal של המוח ולהשפיע בכבדות תהליכים קוגניטיביים1, כולל עבודה זיכרון, עיבוד טמפורלית ו-2,קטר התנהגות3 , 4 , 5 , 6 , 7. מחקרים הקודם הובהר כי שינויים של קולטני דופמין D1 היו קשורים עם ההתקדמות של תשומת לב קשב (ADHD) הפרעת8, הסימפטומים נוירוקוגניטיבי סכיזופרניה9, 10 והלחץ הרגישות11. באופן ספציפי, בסכיזופרניה, טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) מחקרים ציינו כי היכולת מחייב של רצפטורים D1 דופמין cortices הקדם חזיתית היה מאוד קשור קוגניטיבית ואת נוכחותם של סימפטומים שליליים11. הגידול דנדריטים של נוירונים סינאפסות בתוך קליפת המוח הקדם חזיתית מוסדר על ידי רצפטור דופמין D1 מקלה על רגישות ללחץ. יתר על כן, נוקאאוט של קולטן D1 בנוירונים המדיאלי הקדם חזיתית בקליפת המוח (mPFC) יכול לשפר מפגינות הימנעות חברתית מפלה חברתית12.

כאן, אנחנו מציגים טכניקה הרומן של RNA בחיי עיר הכלאה להמחיש יחיד מולקולות RNA בתא עם דגימות רקמה מוקפאות. הטכניקה הנוכחית יש מספר יתרונות על פני שיטות הקיימות בתוך הספרות הנוכחי. ראשית, ההליך הנוכחי המשמרת את ההקשר המרחבי, מורפולוגיים של הרקמה, בוצעה על דגימות רקמה מוקפאות כך הליכים אחרים הדורשים טריים, רקמות-מוטבע יכול להיות משולב עם השיטות הנוכחי. נהלים דומים ברקמות פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע יש מאויר כי הרזולוציה שעתוק יחיד המתאפשר באמצעות של RNA בחיי עיר הכלאה טכניקה13. זיהוי של RNA ברמת שעתוק יחיד מספקת רגישות מעולה ביטוי מספר עותק נמוך, כמו גם את ההזדמנות להשוות ביטוי גנים ברמה של תאים בודדים, כי אינה יכולה להיות מושגת על ידי שיטות זיהוי חומצות גרעין אחרות, כגון טכניקות (PCR), תגובת שרשרת של פולימראז. בנוסף, השיטה הנוכחית שומרת על תמונות עם יחס אות לרעש גבוה דרך הגששים RNA ספציפי מאוד hybridized אל יעד בודד RNA תעתיקים, והוא מחויב ברצף עם מפל של מולקולות איתות הגברה זיהוי מערכת. לבסוף, הטכנולוגיה הנוכחי מספק הזדמנות להעריך את מספר מערכות ביולוגיות עם הגששים קניינית שלה במטרה, במקום להגביל את החקירה שלנו לכיתה אחת בלבד הקשורות למערכת סמנים כגון זיהוי חלבונים על ידי אימונוהיסטוכימיה שיטות.

במחקר שלנו, השתמשנו הזה RNA הרומן בחיי עיר הכלאה להעריך ביטוי הקולטן Drd1α גרעין האקומבנס (NAc), טירוזין hydroxylase (ה) ביטוי הסובסטנציה ניגרה (SNR) של חולדות F344/N גם זכר וגם נקבה. RNA חדשני בחיי עיר הכלאה אפשרה לנו לחקור את המנגנונים המשפיעים על ספיגת DA והן שחרור דא בו זמנית, שיפור ההבנה שלנו של המורכבויות של המערכת striatal DA. כאן, אנו מתארים את ההליך עבור המוח קפוא טרי פרוסות ולספק שיטות ניתוח הנתונים עבור צביעת דפוסים שונים: "dot דיסקרטית" או "אשכולות".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול נסיוני אושרה על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC)-מאוניברסיטת דרום קרוליינה (אבטחת פדרלי מספר: A3049-01).

1. הכנת חלקים במוח קפוא טרי

  1. להשתמש המתח F344/N עכברוש: חולדות שלושה מכל מין, גוף 13 חודשים של גיל, משקל כ 320 גרם.
  2. התאם את הריכוז sevoflurane 5% (יתר של sevoflurane). המשך החשיפה sevoflurane לאחר נשימה עוצר לרגע נוסף.
  3. לערוף את החולדה, מסירים את המוח.
  4. להטביע את המוח חולדה בחנקן נוזלי 15 s בתוך 5 דקות של רקמות הקציר.
  5. Equilibrate המוח ל-20 ° C ב- cryostat לשעה.
  6. לחתוך 30 מיקרומטר מקטעים ולהעביר אל מגלשות (ראה טבלה של חומרים).
  7. לבחור קטעים מתוך האזור גרעין האקומבנס, כ- 2.76 מ"מ עד מ"מ 2.28 והשתרשה עמוק בלבה Bregma14.
  8. ללא הרף פורסים את מוח עכברוש מן הנורה הריח דרך האזור גרעין האקומבנס על פי מבנה המוח stereotaxic של העכברוש.
  9. הר דוגמאות על השקופיות. שמור את הסעיפים ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לייבוש.
  10. מיד לטבול שקופיות paraformaldehyde 4% צוננת מראש עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
  11. מקם את השקופיות הצבע אתנול הגוברת בטמפרטורת החדר (RT): 50% EtOH במשך 5 דקות; 70% EtOH במשך 5 דקות; ל- 100% EtOH במשך 5 דקות.
  12. . אני חוזר עם טרי 100% EtOH.
  13. במקום שקופיות על נייר סופג, אוויר יבש.
  14. לצייר חיץ סביב כל מקטע עם עט מכשול (ראה טבלה של חומרים). תן את מחסום יבש לחלוטין עבור 1 דקות.

2. רעלני סעיפים המוח

  1. להדליק את התנור והגדר את הטמפרטורה 40 ° C.
  2. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של ריאגנט רעלני 4 (ראה טבלה של חומרים) על כל המוח מקטע (מקטע אחד לכל שקופית).
  3. דגירה הסעיפים למשך 30 דקות ב- RT.
  4. להטביע את השקופיות עבור 1 דקות ב- RT. חוזר עם PBS טרי 1 x 1 x PBS.
    הערה: שקופיות לא צריך להיות ב- PBS 1 x יותר מ 15 דקות.

3. RNA מולטיפלקס פלורסנט בחיי עיר הכלאה Assay

  1. החללית היעד עבור 10 דקות ב 40 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים חמים ולאחר מכן להצטנן עד RT.
  2. מקום הכימית RNA (למשל, כח 1-4 FL)-RT.
  3. הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).
  4. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המכשיר Drd1α (C1) על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 2 h ב- 40 מעלות צלזיוס.
  5. להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.
  6. הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).
  7. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 1-FL על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.
  8. להטביע שקופיות במאגר שטיפת 1 למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם מאגר 1wash טריים.
  9. הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).
  10. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 2-FL על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 15 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.
  11. להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.
  12. הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).
  13. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 3-FL על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.
  14. להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.
  15. הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).
  16. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 4-FL-Alt A על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 15 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.
  17. להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.
  18. הסרת עודפי נוזלים משקופיות ומניחים מיד 2 טיפות של ריאגנט הרכבה (ראה טבלה של חומרים) על גבי כל מקטע.
  19. מקום coverslip 22 מ"מ 22 מ מ (ראה טבלה של חומרים) מעל כל מקטע המוח.
  20. לאחסן שקופיות בחושך ב 2-8 ° C עד יבש.
  21. הפעלת מיקרוסקופ קונפוקלי ולעבור מטרה X 60.
  22. להשיג תמונות Z-מחסנית עם מיקרוסקופ קונפוקלי. ראו את הוידאו משלימה לניתוח מפורט של הדמיה קונפוקלי.
  23. לרכוש תמונות של Drd1α עם התווית תאים באזור גרעין האקומבנס (עירור: 488 ננומטר; פליטה: 515/30 ננומטר).
    הערה: אל תתנו את המוח מקטעים לייבש בין השלבים הדגירה.

4. ניתוח נתונים

  1. באופן כמותי למחצה לנתח את התבנית מכתימים: "דיסקרטית נקודות".
    1. כדי לזהות את תא בודד מתוך התמונה, לבצע דאפי מכתים כסמן גרעינית. עם זאת, עדיין קשה לנתח חלקים מסוימים של רקמת המוח, שכן יש סוגים שונים של תאים עם צורה לא סדירה של גרעינים ו/או תאים. . הנה, שני חוקרים מנוסים להקצות בנפרד בכל תא מתמונות להגדרת אזור תא.
    2. מבחינה ויזואלית ניקוד לכל תא בתוך הדימויים קונאפוקלית ייצוגית המבוססת על מספר נקודות בכל תא באמצעות קריטריונים מסוימים (איור 1B).
    3. לקבוע את מספר התאים הכולל בכל קטגוריה ולחלק לפי מספר התא סך הכל x100 ליצירת גרפים התדירות היחסית המציגים את תדירות אחוז של תאים בתוך כל קטגוריה עבור כל מקטעי רקמת (איור 2 א) ועבור זכרים ונקבות בנפרד (2E איור).
    4. לחלק את הסכום של תאים בתוך כל הקטגוריות מוקדמת לפי מספר התא סך הכל x100 כדי לקבוע תדירות המצטברת של תאי רקמת כל המקטעים (איור 2B) ועל זכרים ונקבות בנפרד (2F איור).
  2. מבחינה סטטיסטית לנתח את "הנקודות דיסקרטית" צביעת דפוס (אופציונלי).
    1. בדוק את מספר הנקודות בכל תא לספק קטגורית משתנה זה סודר בטבע (קרי, מספר התאים אשר מתחלקים בכל קטגוריה דרגה תא הנמוך הביטוי (1) לביטוי תא הגבוה ביותר (9)) עבור ניתוחים סטטיסטיים נוספים.
    2. לאחר בדיקה של סטטיסטיקה תיאורית, להשתמש שלוש גישות עיקריות: סטטיסטיקה האח-Haenszel, מבחן מאן-ויטני U ו מבחן Kruskal-איי ווליס. למרות הגישה סטטיסטי מדויק יהיה תלוי השאלה ניסיוני, עיצוב ומחקר של עניין, עץ ההחלטה סטטיסטי (איור 4) עשויים לסייע בקבלת החלטות בנוגע לגישה האנליטית של אחד.
  3. לכמת את עוצמת האות באזור של הריבית (ROI) עבור צביעת דוגמת: "אשכולות".
    1. לחשב את עוצמת האות של כל תמונה באמצעות המשוואה הבאה:
      עוצמת אות = סה כ האינטנסיביות של רועי תמונה - (רקע ממוצע עוצמת × הכולל אזור בתמונה)
    2. לספור את המספר הכולל של תאים בתוך התמונה רועי כדי לחשב את הביטוי אות משוער בכל תא. קבוצה הבדלי עוצמת האות/תמונה, כמו גם את מספר התאים/תמונה יכול להיות מעניין לשקול מנגנונים שעשויים לתרום ההבדלים קבוצה ראיתי בתא/אות ביטוי (איור 3B-3D).
  4. מבחינה סטטיסטית לנתח את "אשכולות" צביעת דפוס (אופציונלי).
    1. לבחון את האות הביטוי/התא כדי לספק משתנה רציף לצורך ניתוח סטטיסטי נוסף. שימוש שתי הגישות, כולל מבחן t מדגם עצמאית השונות (ANOVA), בהתבסס על מספר גורמים בין הנושאים הכלולים העיצוב. עץ החלטה סטטיסטי (איור 4) עשויים לסייע בקבלת החלטות לגבי הגישה הסטטיסטית המתאימה ביותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המחקר הנוכחי בחן של "נקודות דיסקרטית" צביעת דפוס להבעה RNA קולטני D1-אלפא דופמין (Drd1α) של ה-NAc בחולדות F344/N (איור 1 א'). אותות פלורסצנטיות בודדים זוהו בקלות, ניתן לראות יחיד "נקודות", שכל אחד מהם מייצג תעתיק רנ א יחיד בתוך התא. עבור תמונות של ה-NAc המציגים את "הנקודות דיסקרטית" צביעת דפוס, אנחנו העריכו את הטווח הדינמי של ביטוי באמצעות ניתוח כמותי למחצה (איור 1A, איור 2A& 2B). כל תא היה הבקיע "0-9" מבוסס על מספר נקודות בכל תא. "האות hybridized" הזה-ציון (ניקוד-H) שיטה שתוכל להעריך ולכן במידה ואת השתנות לביטוי Drd1α על פני תאים בודדים.

הגישה הכמותיים למחצה עבור "dot דיסקרטית" צביעת דפוס מספק קטגורית משתנה זה סודר בטבע (קרי, מספר הנקודות בכל תא המדורגים מן הנמוך ביותר (1) הגבוה ביותר (9)) לצורך ניתוח סטטיסטי נוסף. במחקר הנוכחי, היינו מעוניינים לבחון את ההשפעה של גורם אחד בין-נושאים (קרי, מיני) על Drd1α ביטוי ה-NAc. לקחת בחשבון מבנה הנתונים מקוננים (קרי, שתי תמונות Z-מחסנית של Drd1α עם התווית התאים ב- NAc התקבלו עבור כל חיה), היו ערכי ספירת הממוצע מחושב עבור כל קטגוריה ונועד לשמש ניתוח סטטיסטי (זכר: n= 3, נקבה: n = 3). בהתחשב שלנו מתעניין בוחן הבדלים גורם בין-נושאים אחד (קרי, מיני) עם שתי קבוצות (קרי, זכר, נקבה) U מאן-ויטני המבחן נערך כדי להעריך את ההבדלים בין ספירת התאים החציוני (איור דו-ממדי). מבחן מאן-ויטני U חשף השפעה רבה הראשי של סקס [z=-5.8, p≤0.001], עם חיות הנשי הצגת ציון תא החציוני ירידה יחסית חיות זכר. איור 2E ו- 2F להמחיש את התדירות של תאים בכל קטגוריה באמצעות שתי שיטות: התדירות היחסית ותדירות המצטבר. נקבות להציג שינוי משמעותי בתחום ההפצה, עם תדירות גדול יותר של תאים בקטגוריות מסודרות נמוך יחסית חיות זכר. מבחן מדף-Haenszel של האגודה נערך לבחון מבחינה סטטיסטית ההתפלגות, חשיפת אפקט משמעותי של סקס [χ2MH(1) = 67.3, p≤0.001]. לכן, באופן כללי, מראים תוצאות מין ברורים ההבדלים בביטוי Drd1α ה-NAc.

במקרים בהם מספר עותק של התמליל גבוהה מאוד, הסימנים יכולים להופיע כמו אשכולות. כאן הביטוי hydroxylase טירוזין (ה) באזור SNR הראה את "אשכולות" צביעת דפוס (איור 3 א). לכמת סמן זה ביטוי גבוהה, אנחנו קודם בממוצע עוצמת רקע מתוך שמונה אזורים רקע שונה. לאחר קביעת הסף המינימלי בעוצמה מעל עוצמת רקע הממוצע, ניתחנו את עוצמת התמונה מנוכי עונתיות כמו אות בכל תא של TH.

לאור האינטרס שלנו בבדיקת גורם בין-נושאים אחד (קרי, מיני), מבחן t דגימות עצמאית היא גישה סטטיסטית המתאים. לניתוח, הנתונים היו טרנספורמציה-יומן. לקחת בחשבון מבנה הנתונים מקוננים (קרי, שתי תמונות Z-מחסנית של תאנון שכותרתו בתאים SNR התקבלו עבור כל חיה), היו ממוצע של ערכים מחושבים, המשמש לניתוח סטטיסטי (זכר: n= 2, נקבה: n= 3). נקבות להציג עלייה משמעותית בעוצמת האות הממוצע (איור 3B), רמיזות של רמה גבוהה יותר של ביטוי TH מוחלטת, ביחס חיות זכר (t(3) = 3.3, p≤0.05). עם זאת, אין הבדלים משמעותיים סקס נצפו גם מספר התאים לכל תמונה (t(3) = 2.0, p> 0.05; איור 3C) או הממוצע אות ביטוי בכל תא (t(3) = 2.0, p> 0.05; דמות תלת-ממד). ANOVA מעורב-עיצוב, בהתחשב שלושה מדדים כגורם בתוך הנושא, התגלה גם השפעה רבה הראשי של סקס [F (1, 3) = 10.6, p≤0.05].

Figure 1
איור 1: הקריטריונים של ניתוח כמותי למחצה על המספר הממוצע של נקודות בכל תא עבור צביעת דוגמת: "נקודות דיסקרטית". א נציג קונאפוקלית תמונות (60 X) של ביטוי Drd1α ציונים שונים (מוגבר בהיקף 250% יחסית לגודל התמונה המקורי) B. "ניקוד" קטגוריה ספציפית לכל קריטריון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: רמת הדופמין D1-אלפא קולטן (Drd1α) RNA באזור גרעין האקומבנס של חולדות F344/N. א % התדירות היחסית של כל קטגוריה "ציון". B. עקומת מנה-תגובה sigmoidal סיפקה מתאימים היטב תיאר (r2= 0.99) עם מרווחי ביטחון של 95% (CI; שמציין את הקווים המקווקווים) היה להתאים את % שכיחות מצטברת של כל קטגוריה "ציון". ג. נציג קונאפוקלית תמונות (60 X) Drd1α הביטוי בחולדות זכר ונקבה, אשר יש את "הנקודות דיסקרטית" צביעת דפוס. ד גרף מייצג של הציון תא רשע בחולדות זכר ונקבה. קווי השגיאה לעמוד השגיאה הסטנדרטית של ממוצע (SEM). אי האחוזים התדירות היחסית של כל קטגוריה "ניקוד", השוואה בין ביטוי ברקמות של חולדות זכר ונקבה. פ עקומות מנה-תגובה Sigmoidal סיפקה מתאימים היטב תיאר (r2s = 0.99) עם 95% מרווחי ביטחון % שכיחות מצטברת של כל קטגוריה "ניקוד" בין זכר ונקבה חולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: רמה hydroxylase RNA טירוזין (ה) באזור הסובסטנציה ניגרה (SNR) בחולדות F344/N. א להחליפן בתמונות קונאפוקלית (60 X; עירור: 543 ננומטר; פליטה: 590/50 ננומטר) הביטוי TH בחולדות זכר ונקבה, אשר יש את "אשכולות" צביעת דפוס. B-ממד. ניתוח נציג של עוצמת האות בכל תא. אות ביטוי / התא יכול להיגזר לכימות עוצמת האות של התמונה (עם עוצמת סף מוגדר מעל רקע), מחלקים את מספר התאים בתוך התמונה. קווי השגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: ההחלטה עץ לניתוח סטטיסטי המומלצת. העץ ההחלטה מספק הנחיות לקביעת ניתוח סטטיסטי אשר מתאימה ביותר עבור שאלת המחקר של עניין. העץ ההחלטה אינה ממצה, במקרים מסוימים, ניתוחים אחרים וייתכן שהוא מתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה הרומן של הכלאה בחיי עיר פרוסות המוח מוקפאות להעריך ביטוי הקולטן Drd1α גרעין האקומבנס (NAc) וביטוי hydroxylase (ה) טירוזין באזור הסובסטנציה ניגרה (SNR). כמו כן אנו מספקים שיטות ניתוח הנתונים עבור צביעת דפוסים שונים: "dot דיסקרטית" או "אשכולות".

השלבים הקריטיים קרינה פלואורסצנטית מולטיפלקס מוצלחת RNA בחיי עיר הכלאה assay הינם כלולים. לאחר עריפת ראשו העכברוש והסרה של המוח, להקפיא את המוח של חנקן נוזלי בתוך 5 דק לשמור הסעיפים המוח ב-20 ° C עד 4% paraformaldehyde קיבעון. לאחר 30 דקות של דגירה של רעלני 4, שקופיות לא צריך להיות ב- PBS 1 x יותר מ 15 דקות. אל תתנו המוח מקטעים לייבש בין השלבים הגברה. הדמיה קונאפוקלית שימושי מאוד לאספקת תמונות באיכות גבוהה בסה כ מציג אותות מכתימים ברור בדוגמת רקמה. השימוש בתנור הכלאה במהירות וביעילות יביא את הדגימות 40 ° C.

האותות פלורסצנטיות בודדים לביטוי קולטן Drd1α ב ה-NAc אותרו כנקודות יחיד"," שכל אחד מהם מייצג תעתיק רנ א יחיד בתוך התא. חשוב, גודל "dot" משקף הבדלים בתנאי assay, הכנת הדוגמא, ועל אחרים גורמים ולא רמות הביטוי Drd1α-RNA. בדומה לכך, עוצמת האות של בודדים "נקודות" אינה רלוונטית רמות הביטוי Drd1α-RNA. אנחנו העריכו את הטווח הדינמי של ביטוי זה כמו ניתוח כמותי למחצה הבקיע עם "0-9" מבוסס על מספר נקודות בכל תא, אשר יכול להעריך במידה ואת השתנות לביטוי Drd1α. יתר על כן, בחינת מספר הנקודות בכל תא מספק משתנה קטגורית עוד ניתוחים סטטיסטיים.

בעקבות הבדיקה של סטטיסטיקה תיאורית, פרוטוקול שלנו ממליצה על שלוש גישות עיקריות סטטיסטית לניתוח אותות שמציגים את "dot דיסקרטית" צביעת דפוס, אשר מספק משתנה הסודר לצורך ניתוח נוסף. באופן ספציפי, מומלץ מבחן מאן-ויטני U nonparametric מבחן Kruskal-איי ווליס nonparametric, מבחן מדף-Haenszel של האגודה. מבחן מאן-ויטני U ומבחן Kruskal-איי ווליס הם המתאימים ביותר כאשר בחינת רק אחד בין-נושאים פקטור (למשל, מין). בנוסף, ייתכן מבחן מדף-Haenszel של האגודה המתאים לבחינת משמרות בהפצה. ניתוחים סטטיסטיים מורכבים יותר, כולל של משוואת הערכה כללית או כללי לינארי מודל מעורב עשוי להועיל כאשר גורמים נוספים הינם כלולים. ההמלצות הן לא ממצה, הגישה סטטיסטי מדויק יהיה תלוי עיצוב ניסיוני ואת שאלת המחקר של עניין.

עם זאת, במקרים בהם מספר עותק של התמליל גבוהה מאוד, הסימנים יכולים להופיע כמו אשכולות. כאן, תאנון ביטוי באזור SNR הראה את "אשכולות" צביעת דפוס. לכמת דה מרקר TH ביטוי גבוהה, אנחנו מותאם עוצמת התמונה בהתבסס על הגדרת את הסף המינימלי בעוצמה מעל עוצמת רקע הממוצע, וניתח כמו אות בכל תא של TH. אותות שמציגים "האשכול" צביעת דפוס, כמו תאנון ב SNR, ניתן לנתח סטטיסטית על-ידי שימוש עצמאי דוגם t-בדיקות או ANOVA כדי להשוות בין קבוצות.

קיימות מגבלות של זה RNA הרומן בחיי עיר הכלאה וזמינותו. עבור "דיסקרטית הנקודה" צביעת דפוס, אלה כוללים כיצד להגדיר תא יחיד באופן מדויק יותר. במחקר שלנו, כדי לזהות את תא בודד מתוך התמונה, ביצענו דאפי מכתים כסמן גרעינית. עם זאת, עדיין קשה לנתח חלקים מסוימים של רקמת המוח, שכן יש סוגים שונים של תאים בצורות חריגות של גרעינים ו/או תאים. כאן, שני חוקרים מנוסים להקצות בנפרד בכל תא מתמונות להגדרת האזור התא. עבור "אשכולות" צביעת דפוס, תוכנה ספציפית יש לבחור הגדרת סף או recognization תא אוטומטית.

לפיכך, RNA חדשני בחיי עיר הכלאה וזמינותו אפשרו לנו לחקור את המנגנונים המשפיעים על ספיגת DA והן שחרור דא בו זמנית, שיפור הבנה של המורכבות של מערכת striatal DA. בסך הכל, חוקרים ירוויחו RNA הרומן בחיי עיר הכלאה הטכניקה כאשר חוקרים שינויים לקוי וכולינרגיים סמני במהלך הופעתה ואת ההתקדמות של הפרעות מוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ישנם שאין ניגודי אינטרסים להכריז.

Acknowledgments

העבודות הנוכחי נתמכו על-ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקים HD043680, MH106392, DA013137 ו- NS100624. קרן חלקית סופק על ידי מענק הכשרה NIH T32 במדעים ביו-רפואית-התנהגותי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HybEZ Oven system Advanced Cell Diagnostics  310010
RNAscope Probe - Rn-Drd1a Advanced Cell Diagnostics  317031 Color channel 1, Green
RNAscope Probe - Rn-Th-C2 Advanced Cell Diagnostics  314651-C2 Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics  320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratory H-4000
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154% 
4% paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rack Fisher Scientific NC9837976
Tissue-Tek staining dish Fisher Scientific NC0731403
Precision General Purpose Baths ThermoFisher Scientific TSGP28
Pretreatment 4 Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagent Life Technologies P36930
Amp 1-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 2-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 3-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 4-FL-Alt A Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
EZ-C1 software package Nikon Instruments version 3.81b
SAS/STAT Software SAS Institute, Inc., version 9.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
  2. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  3. Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
  4. Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
  5. Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
  6. Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
  7. Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
  8. Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
  10. Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
  11. Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
  12. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).

Tags

מדעי המוח גיליון 133 הכלאה RNA קולטן הדופאמין D1-אלפא (Drd1α) ב באתרו מדעי המוח מין ביולוגי עכברוש
זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית RNA <em>בחיי עיר</em> זיהוי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Illenberger, J. M.,… More

Li, H., Illenberger, J. M., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology. J. Vis. Exp. (133), e57444, doi:10.3791/57444 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter