Summary
Identificazione del recettore D1-alfa della dopamina nel nucleus accumbens è fondamentale per chiarire la disfunzione dei recettori D1 durante una malattia del sistema nervoso centrale. Abbiamo effettuato un romanzo determinazione del RNA in situ di ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in un'area specifica del cervello.
Abstract
Nel sistema nervoso centrale, il recettore di sottotipo D1-alfa (Drd1α) è il più abbondante recettore della dopamina (DA), che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione dello sviluppo e crescita neuronale. Tuttavia, i meccanismi alla base di Drd1α anomalie di recettori che mediano le risposte comportamentali e modulazione della funzione di memoria di lavoro sono ancora poco chiari. Usando un romanzo RNA in situ ibridazione analisi, lo studio corrente ha identificato dopamina Drd1α del recettore e la tirosina idrossilasi (TH) espressione del RNA da correlati DA circuiti nella zona di nucleo accumbens (NAc) e regione di substantia nigra (SNR), rispettivamente. Drd1α espressione nel NAc Mostra un "discreto punto" modello di macchiatura. Sono state osservate differenze di sesso chiaro nell'espressione di Drd1α. Al contrario, TH Mostra un pattern di colorazione "cluster". Per quanto riguarda l'espressione TH, ratti femminili visualizzata un' più alta espressione di segnale per cella rispetto gli animali maschii. I metodi presentati qui forniscano una tecnica di romanzo in situ di ibridazione per indagare i cambiamenti nella disfunzione del sistema della dopamina durante la progressione di malattie del sistema nervoso centrale.
Introduction
Disfunzione del sistema della dopamina striatale è coinvolto nella progressione dei sintomi clinici osservati nelle malattie neurocognitive multiple. I ricevitori della dopamina D1 sono presenti nella corteccia prefrontale (PFC) e regioni striatal del cervello e influenzano pesantemente i processi cognitivi1, compreso il funzionamento memoria, elaborazione temporale e comportamento locomotiva2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. precedenti studi chiarito che le modifiche dei ricevitori della dopamina D1 sono state associate con la progressione di attenzione iperattività di deficit disorder (ADHD)8, i sintomi neurocognitivi nella schizofrenia9, 10 e lo stress suscettibilità11. In particolare, nella schizofrenia, tomografia a emissione di positroni (PET) studi hanno indicato che la capacità di legame dei recettori D1 della dopamina nelle cortecce prefrontali era altamente relative al deficit cognitivi e la presenza di sintomi negativi11. La crescita dendritica dei neuroni eccitatori nella corteccia prefrontale regolato dal recettore della dopamina D1 allevia lo stress suscettibilità. Inoltre, l'atterramento del recettore D1 in neuroni corticali prefrontale mediale (mPFC) potrebbe migliorare la sconfitta sociale indotta da stress sociale evitare12.
Qui, presentiamo una nuova tecnica di RNA in situ ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in una cella con campioni di tessuto fresco congelato. La tecnica attuale ha molteplici vantaggi rispetto ai metodi che esistono all'interno della letteratura corrente. In primo luogo, l'attuale procedura per mantenere il contesto spaziale e morfologico del tessuto ed è stata effettuata su campioni di tessuto fresco congelato affinché altre procedure che richiedono fresco, non incorporati tessuti possono essere combinati con i metodi attuali. Procedure analoghe nei tessuti formalina-fisso e paraffina-incastonati hanno illustrato che risoluzione singola trascrizione può essere realizzato usando un RNA in situ ibridazione tecnica13. Rilevamento del RNA a livello di singola trascrizione fornisce una sensibilità superiore alla espressione di numero di copia basso così come l'opportunità di confrontare l'espressione genica a livello di singole cellule che non possono essere raggiunti da altri metodi di rilevazione dell'acido nucleico, quali tecniche di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Inoltre, il metodo corrente mantiene immagini con un elevato rapporto segnale-rumore attraverso le sonde del RNA altamente specifiche che sono ibridate di trascritti di RNA bersaglio singolo e associate in sequenza con una cascata di molecole di amplificazione del segnale nella rilevazione sistema. Infine, l'attuale tecnologia offre l'opportunità di valutare più sistemi biologici con sue sonde proprietarie di target-specifici, piuttosto che limitare la nostra ricerca ad una sola classe di indicatori relativi al sistema quali il rilevamento di proteine di metodi di esame immuno-istochimico.
Nel nostro studio, abbiamo usato questa romanzo ibridazione in situ per RNA per valutare l'espressione del ricevitore Drd1α nel nucleus accumbens (NAc) e l'espressione di tirosina idrossilasi (TH) nella substantia nigra (SNR) dei ratti F344/N sia maschili che femminili. L'innovativo ibridazione in situ per RNA permesso di studiare i meccanismi che influenzano sia DA assorbimento e rilascio di DA simultaneamente, migliorando la nostra comprensione della complessità del sistema striatal del DA. Qui, descriviamo la procedura per fette di cervello fresco-congelato e fornire i metodi di analisi dei dati per diversi pattern di colorazione: "discreto punto" o "cluster".
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Protocol
Il protocollo sperimentale è stato approvato dalla cura degli animali e uso Committee (IACUC) presso la University of South Carolina (numero di assicurazione federale: A3049-01).
1. preparazione di sezioni di cervello congelato fresco
- Utilizzare il ceppo di ratti F344/N: tre ratti di ogni sesso, Guida in linea di 13 mesi di età, circa 320 g di peso corporeo.
- Regolare la concentrazione di sevoflurane al 5% (sovradosaggio del sevoflurano). Continuare l'esposizione sevoflurano dopo respiro si ferma per un minuto.
- Decapitare il ratto e rimuovere il cervello.
- Immergere il cervello di ratto in azoto liquido per 15 s entro 5 min di raccolta del tessuto.
- Equilibrare il cervello a-20 ° C in un criostato per 1 h.
- Tagliare 30 µm sezioni e trasferire sui vetrini (Vedi Tabella materiali).
- Scegliere le sezioni della regione di nucleo accumbens, circa 2,76 mm a 2,28 mm anteriore al Bregma14.
- Continuamente fetta cervello del ratto dal bulbo olfattivo attraverso la regione di nucleo accumbens secondo la struttura stereotassica cerebrale del ratto.
- Montare i campioni sulle diapositive. Mantenere le sezioni a-20 ° C per 10 minuti ad asciugare.
- Immediatamente immergere i vetrini nel paraformaldeide 4% pre-refrigerati per 1 h a 4 ° C.
- Porre i vetrini in un gradiente crescente di etanolo a temperatura ambiente (TA): 50% EtOH per 5 min; 70% EtOH per 5 min; e 100% EtOH per 5 min.
- Ripetere con il fresco 100% EtOH.
- Mettere i vetrini su carta assorbente e lasciare asciugare all'aria.
- Disegnare una barriera intorno ogni sezione con una penna di barriera (Vedi Tabella materiali). Lasciate la barriera asciugare completamente per 1 min.
2. pretrattamento delle sezioni del cervello
- Accendere il forno e impostare la temperatura a 40 ° C.
- Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di pretrattamento 4 reagente (Vedi Tabella materiali) su ogni sezione del cervello (una sezione per ogni diapositiva).
- Incubare le sezioni per 30 minuti a TA.
- Immergere i vetrini in 1X PBS per 1 min a RT. Repeat con PBS 1X fresco.
Nota: Diapositive non dovrebbero stare in PBS 1X per più di 15 min.
3. determinazione del RNA In Situ ibridazione fluorescente Multiplex
- Riscaldare la sonda di destinazione per 10 min a 40 ° C a bagnomaria e poi raffreddare a RT.
- Posizionare il reagente di RNA (ad es., Amp FL 1-4) a TA.
- Rimuovere il liquido in eccesso da diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).
- Aggiungere 3 gocce (90 µ l) della sonda Drd1α (C1) sulla fetta di campione. Incubare per 2 ore a 40 ° C.
- Immergere gli scivoli in 1x tampone di lavaggio per 2 minuti a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.
- Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).
- Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 1-FL sulla fetta di campione. Incubare per 30 min a 40 ° C.
- Immergere i vetrini in tampone di 1 lavaggio per 2 min a RT. Repeat con buffer di 1wash fresco.
- Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).
- Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 2-FL sulla fetta di campione. Incubare per 15 min a 40 ° C.
- Immergere gli scivoli in 1x tampone di lavaggio per 2 minuti a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.
- Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).
- Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 3-FL sulla fetta di campione. Incubare per 30 min a 40 ° C.
- Immergere i vetrini in 1x tampone di lavaggio per 2 min a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.
- Rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive con carta assorbente e luogo riaccendi il portavetrini (Vedi Tabella materiali).
- Aggiungere 3 gocce (90 µ l) di Amp 4-FL-Alt A sulla fetta di campione. Incubare per 15 min a 40 ° C.
- Immergere gli scivoli in 1x tampone di lavaggio per 2 minuti a RT. Repeat con fresco 1x tampone di lavaggio.
- Rimuovere il liquido in eccesso da diapositive e collocare immediatamente 2 gocce di reagente di montaggio (Vedi Tabella materiali) su ogni sezione.
- Porre un coprivetrino 22 mm 22 mm (Vedi Tabella materiali) sopra ogni sezione del cervello.
- Archiviare le diapositive al buio a 2-8 ° C fino a secco.
- Accendere il microscopio confocale e passare a un obiettivo 60x.
- Ottenere immagini dello stack Z con un microscopio confocale. Vedere il video supplementare per una procedura di dettaglio dell'imaging confocale.
- Acquisire immagini della Drd1α etichettati cellule nella regione di accumbens del nucleo (eccitazione: 488 nm; Emissione: 515/30 nm).
Nota: Non lasciare che cervello sezioni asciugare tra fasi di incubazione.
4. analisi dei dati
- Semi-quantitativamente analizzare il pattern di colorazione: "punti discreti".
- Per identificare la cella singola dall'immagine, eseguire DAPI colorazione come marcatore nucleare. Tuttavia, è ancora difficile da analizzare alcune parti del tessuto cerebrale, in quanto ha più tipi di cellule con forma irregolare di nuclei e/o cellule. Qui, due ricercatori esperti assegnare separatamente ogni cella da immagini per definire la regione di cella.
- Punteggio visivamente ogni cella all'interno delle immagini confocale rappresentative basato sul numero di punti per cella utilizzando i criteri specifici (Figura 1B).
- Determinare il numero totale delle cellule in ogni categoria e dividere per il numero totale delle cellule x100 per creare grafici di frequenza relativa che visualizzare la frequenza percentuale di cellule all'interno di ogni categoria per tutte le sezioni di tessuto (Figura 2A) e per maschi e femmine separatamente (Figura 2E).
- Dividere la somma delle celle all'interno di tutte le categorie precedenti per il numero totale delle cellule x100 per determinare la frequenza cumulativa delle cellule per tutte le sezioni di tessuto (Figura 2B) e per maschi e femmine separatamente (Figura 2F).
- Analizzare statisticamente i "puntini discreti" metodo di colorazione (facoltativo).
- Esaminare il numero di punti per cella per fornire una variabile categorica che è ordinale in natura (vale a dire, il numero di celle che rientrano in ciascuna categoria di rango da minima espressione delle cellule (1) alla più alta espressione delle cellule (9)) per ulteriori analisi statistiche.
- Dopo l'esame di statistica descrittiva, utilizzare tre approcci principali: una statistica di Mantel-Haenszel, un test di Mann-Whitney U e un test di Kruskal-Wallis. Sebbene l'approccio statistico preciso sarà dipende la domanda di design e ricerca sperimentale di interesse, un albero di decisione statistica (Figura 4) può essere di aiuto nel prendere le decisioni per quanto riguarda di uno approccio analitico.
- Quantificare l'intensità di segnale della regione di interesse (ROI) per il modello di macchiatura: "cluster".
- Calcolare l'intensità del segnale di ogni immagine utilizzando la seguente equazione:
L'intensità del segnale = totale intensità dell'immagine ROI - (zona di immagine totale del × di intensità di fondo media) - Contare il numero totale di celle all'interno di immagine ROI per calcolare l'espressione del segnale approssimativo per la cellula. Le differenze del gruppo in intensità segnale/immagine, nonché il numero di cellule/immagine possono essere di interesse a considerare i meccanismi che possono contribuire alle differenze di gruppo vista in segnale espressione/cella (Figura 3B-3D).
- Calcolare l'intensità del segnale di ogni immagine utilizzando la seguente equazione:
- Analizzare statisticamente i "cluster" metodo di colorazione (facoltativo).
- Esaminare l'espressione/cella di segnale per fornire una variabile continua per ulteriori analisi statistiche. Uso due approcci, tra cui un test t per campioni indipendenti e analisi della varianza (ANOVA), basato sul numero di fattori tra soggetti inclusi nella progettazione. Un albero di decisione statistica (Figura 4) può essere di aiuto nel prendere le decisioni per quanto riguarda l'approccio statistico più appropriato.
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Representative Results
Lo studio corrente ha osservato un "punti discreti" metodo di colorazione per l'espressione di RNA nei recettori della dopamina D1-alfa (Drd1α) del NAc in ratti F344/N (Figura 1A). Segnali di fluorescenza individuali sono stati identificati facilmente e possono essere visto come unica "puntini", ognuno dei quali rappresenta una singola trascrizione di RNA all'interno della cellula. Per le immagini da NAc che visualizzano i "puntini discreti" modello di macchiatura, abbiamo valutato la gamma dinamica di espressione utilizzando un'analisi semi-quantitativa (Figura 1A, Figura 2Ae 2B). Ogni cella è stato segnato da "0-9" in base al numero di punti per cella. Questo segnale"ibridato"-Punteggio (H-Punteggio) metodo può quindi valutare la portata e la variabilità di espressione di Drd1α attraverso le singole celle.
L'approccio semi-quantitativo per il "dot discreti" modello di macchiatura fornisce una variabile categorica che è ordinale in natura (vale a dire, il numero di punti per cella ordinati dal più basso al più alto (9) (1)) per ulteriori analisi statistiche. Nello studio presente, eravamo interessati ad esaminare l'effetto di un fattore tra soggetti (cioè, sesso) sull'espressione di Drd1α nel NAc. Per tenere conto la struttura di dati nidificati (cioè, due immagini dello stack Z di Drd1α etichettati cellule in NAc sono stati ottenuti per ciascun animale), valori di conteggio medio sono stati calcolati per ogni categoria e utilizzati per l'analisi statistica (maschio: n= 3, donna: n = 3). Dato il nostro interesse nell'esaminare le differenze in un fattore tra soggetti (cioè, sesso) con due gruppi (cioè, uomo, donna) un U di Mann-Whitney test è stato condotto per valutare le differenze nel conteggio mediano delle cellule (Figura 2D). Un test di Mann-Whitney U ha rivelato un significativo effetto principale del sesso [z=-5.8, p≤0.001], con donna animali che presentano un punteggio mediano in diminuzione delle cellule rispetto gli animali maschii. Figura 2E e 2F illustrare la frequenza delle cellule in ciascuna categoria utilizzando due metodi: frequenza relativa e frequenza cumulativa. Gli animali femminili visualizzato un significativo cambiamento nella distribuzione, con una maggiore frequenza delle cellule in categorie ordinate inferiore rispetto gli animali maschii. Un test di Mantel-Haenszel dell'associazione sono stati intrapresi per esaminare statisticamente la distribuzione, rivelando un effetto significativo del sesso [χ2MH(1) = 67.3, p≤0.001]. Così, nel complesso, i risultati indicano chiaro le differenze nell'espressione di Drd1α nel NAc.
Nei casi in cui il numero di copia della trascrizione è molto alto, i segnali possono essere visualizzati come cluster. Qui, espressione dell'idrossilasi della tirosina (TH) nella regione SNR ha mostrato i "cluster" metodo di colorazione (Figura 3A). Per quantificare questo marcatore che esprimono alta, abbiamo speso in primo luogo l'intensità di sfondo da otto aree di sfondo diverso. Dopo aver impostato la soglia di intensità minima sopra l'intensità media di fondo, l'intensità dell'immagine adattata è stata analizzata come segnale per la cellula di th
Dato il nostro interesse nell'esaminare un fattore tra soggetti (cioè, sesso), un test t per campioni indipendenti è un approccio statistico appropriato. Per l'analisi, i dati erano trasformate da registro. Per tenere conto la struttura di dati nidificati (cioè, due immagini dello stack Z di TH etichettati cellule in SNR sono stati ottenuti per ciascun animale), i valori medi sono stati calcolati e utilizzati per l'analisi statistica (maschio: n= 2, femmina: n= 3). Gli animali femminili visualizzato un significativo aumento nell'intensità del segnale medio (Figura 3B), indicativi di un livello superiore di espressione totale di TH, riguardante gli animali maschii (t(3) = 3.3, p≤ 0.05). Tuttavia, nessuna differenza significativa del sesso sono stata osservata in entrambi il numero di celle per ogni immagine (t(3) = 2.0, p> 0.05; Figura 3) o il mezzo di espressione per la cellula del segnale (t(3) = 2.0, p> 0.05; Figura 3D). Un disegno misto ANOVA, considerando le tre misure come un fattore di entro-oggetto, ha rivelato anche un significativo effetto principale del sesso [F (1,3) = 10.6, p≤ 0.05].
Figura 1: criteri di analisi semi-quantitativa sul numero medio di punti per cella per modello di macchiatura: "punti discreti". Immagini confocal r. rappresentative (60 X) della espressione di Drd1α a diversi punteggi (amplificato scala 250% relativamente alla dimensione di immagine originale) B. La categoria "Punteggio" specifica per ogni criterio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: livello di dopamina D1-alfa recettore (Drd1α) RNA nel Nucleus Accumbens regione dei ratti F344/N. R. la % di frequenza relativa di ciascuna categoria di "Punteggio". B. una curva sigmoidale dose-risposta fornito una misura ben descritta (r2= 0.99) con intervalli di confidenza 95% (CI; indicato dalle linee tratteggiate) era adatta per il % di frequenza cumulativa di ogni categoria di "Punteggio". C. rappresentante immagini confocal (60 X) dell'espressione di Drd1α in ratti maschi e femmine, che hanno i "punti discreti" modello di macchiatura. D. Grafico rappresentanza del Punteggio medio delle cellule in ratti maschi e femmine. Le barre di errore stanno per l'errore standard della media (SEM). E. la % di frequenza relativa di ciascuna categoria di "Punteggio", espressione in tessuti dai ratti maschi e femmine a confronto. F. curve dose-risposta sigmoidale fornito una misura ben descritta (r2s = 0.99) con intervalli di confidenza di 95% al % frequenza cumulativa di ogni categoria di "Punteggio" tra ratti maschi e femmine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: livello di idrossilasi RNA della tirosina (TH) nella regione di Substantia Nigra (SNR) in ratti F344/N. R. immagini confocal rappresentative (60 X; Eccitazione: 543 nm; Emissione: 590/50 nm) di espressione di TH in ratti maschi e femmine, che con i "cluster" modello di macchiatura. B-D. Analisi rappresentativa dell'intensità del segnale per la cellula. Espressione di segnale / cella può essere derivata da quantificare l'intensità del segnale dell'immagine (con soglia di intensità impostata sopra sfondo) e dividendolo per il numero di cellule all'interno dell'immagine. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: albero delle decisioni per l'analisi statistica consigliato. L'albero di decisione fornisce linee guida per determinare quale analisi statistica sono più appropriata per la domanda di ricerca di interesse. L'albero di decisione non è esaustivo e in alcuni casi, altre analisi potrebbero essere appropriati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo, descriviamo una tecnica novella di ibridazione in situ per fette di cervello fresco congelato per valutare l'espressione del ricevitore Drd1α nel nucleus accumbens (NAc) e l'espressione di tirosina idrossilasi (TH) in regione della substantia nigra (SNR). Forniamo anche i metodi di analisi dei dati per diversi pattern di colorazione: "discreto punto" o "cluster".
I passaggi critici per un'analisi di fluorescenza multisala successo RNA in situ di ibridazione sono inclusi. Una volta decapitare il ratto e la rimozione del cervello, congelare il cervello in azoto liquido entro 5 min è possibile mantenere le sezioni di cervello a-20 ° C fino alla fissazione del paraformaldeide 4%. Dopo 30 min di incubazione di pretrattamento 4, diapositive non dovrebbero stare in PBS 1X per più di 15 min. Non lasciare che cervello sezioni asciugarsi tra i passaggi di amplificazione. Formazione immagine confocal è molto utile per fornire immagini di alta qualità che mostra chiari segnali di colorazione a campione di tessuto. Uso del forno di ibridazione sarà rapidamente e in modo efficiente portare i campioni a 40 ° C.
I segnali di fluorescenza individuali dell'espressione del recettore Drd1α nel NAc sono stati identificati come singoli "puntini", ciascuno dei quali rappresenta una singola trascrizione di RNA all'interno della cellula. D'importanza, "dot" dimensione riflette differenze nelle condizioni di test, preparazione del campione e altri fattori piuttosto che i livelli di espressione di Drd1α-RNA. Allo stesso modo, l'intensità di segnale dei singoli "punti" non è rilevante per i livelli di espressione di Drd1α-RNA. Abbiamo valutato la gamma dinamica di questa espressione come un'analisi semi-quantitativa ha segnata con "0-9" in base al numero di punti per cella, che può valutare la portata e la variabilità di espressione di Drd1α. Inoltre, l'esame del numero di punti per cella fornisce una variabile categoriale per ulteriori analisi statistiche.
In seguito all'esame di statistica descrittiva, il nostro protocollo raccomanda tre approcci principali per analizzare statisticamente i segnali che presentano il "punto discreto" metodo di colorazione, che fornisce una variabile ordinale per ulteriori analisi. In particolare, un test non parametrico di Mann-Whitney U, un test non parametrico di Kruskal-Wallis e un test di Mantel-Haenszel dell'associazione sono raccomandati. Un test di Mann-Whitney U e un test di Kruskal-Wallis sono più appropriati quando esaminando solo uno fattore (es. sesso) tra soggetti. Inoltre, un test di Mantel-Haenszel dell'associazione potrebbe essere appropriato per l'esame di spostamenti nella ripartizione. Analisi statistiche più complesse, tra cui un'equazione di stima generalizzata o modello generale lineare mista potrebbe essere appropriato quando fattori aggiuntivi sono inclusi. Le raccomandazioni non sono esaustive, e l'approccio statistico preciso sarà dipende il disegno sperimentale e la domanda di ricerca di interesse.
Tuttavia, nei casi in cui il numero di copia della trascrizione è molto alto, i segnali possono essere visualizzati come cluster. Qui, l'espressione TH nella regione SNR ha mostrato i "cluster" modello di macchiatura. Per quantificare il marcatore di TH che esprimono alta, abbiamo regolato intensità di immagine basato su impostazione della soglia di intensità minima sopra l'intensità media di fondo ed analizzati come segnale per la cellula di th Segnali che presentano il "cluster" metodo di colorazione, come TH nella SNR, possono essere analizzati statisticamente utilizzando un indipendente campioni t-test o ANOVA per confrontare i gruppi.
Non ci sono limitazioni di questo romanzo determinazione del RNA in situ di ibridazione. Per il "discreto punto" modello di macchiatura, questi includono come definire una singola cella con maggiore precisione. Nel nostro studio, per identificare la cella singola dall'immagine, abbiamo effettuato DAPI colorazione come marcatore nucleare. Tuttavia, è ancora difficile da analizzare alcune parti del tessuto cerebrale, in quanto ha più tipi di cellule con forme irregolari di nuclei e/o cellule. Qui, due ricercatori esperti assegnare separatamente ogni cella da immagini per definire l'area di cella. Per i "cluster" modello di macchiatura, software specifico dovrebbe essere scelto di impostare la soglia o recognization cella automatica.
Così, l'innovativo determinazione del RNA in situ ibridazione permesso di studiare i meccanismi che influenzano sia DA assorbimento e rilascio di DA simultaneamente, migliorando la comprensione delle complessità del sistema striatal del DA. Nel complesso, i ricercatori beneficerebbero dalla tecnica del romanzo RNA in situ ibridazione quando studiando disfunzionale modifiche ai marcatori dopaminergici durante l'emersione e la progressione dei disordini del cervello.
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Disclosures
Non ci sono nessun conflitti di interesse di dichiarare.
Acknowledgments
Le opere presenti sono state sostenute dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute (NIH) HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624. Fondo parziale è stato fornito da una sovvenzione di formazione NIH T32 nella scienza biomedica-comportamentale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe - Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe - Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
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