Summary
Dopamin D1-Alfa reseptör nucleus accumbens tanımlaması D1 reseptör disfonksiyonu bir merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında açıklığa kavuşturulması için önemlidir. Biz bir belirli beyin bölgesinde tek RNA molekülleri görselleştirmek için bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil yapılır.
Abstract
Merkezi sinir sistemi nöronal büyüme ve gelişme düzenlenmesinde önemli bir rol oynar en bol (DA) dopamin reseptör D1-Alfa alt türü reseptör (Drd1α) olduğunu. Ancak, davranışsal yanıt arabuluculuk ve çalışma bellek işlevi modülasyonlu Drd1α reseptör anormallikler temel mekanizmaları hala pek açık değildir. Bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil kullanarak, geçerli çalışma Drd1α dopamin reseptör ve tirozin hidroksilaz (TH) RNA ifadeden DA ilgili devre nucleus accumbens (NAc) alan ve gözlemliyorum nigra bölgesinde (SNR), tespit anılan sıraya göre. Kak Drd1α ifadede "ayrı nokta deseni boyama" gösterir. Drd1α ifade açık cinsiyet farklılıkları tespit edildi. Buna ek olarak, TH "kümelenmiş" boyama desen gösterir. TH ifade ile ilgili dişi rats erkek hayvanlar göreli hücre başına daha yüksek bir sinyal ifadesi görüntülenir. Burada sunulan yöntemleri bir roman situ hibridizasyon Teknik Merkezi sinir sistemi hastalıkları ilerleme sırasında dopamin sistem disfonksiyon değişimler soruşturma için sağlar.
Introduction
Disfonksiyon striatal dopamin sisteminin birden çok nörobilişsel hastalıklarda gözlenen klinik belirtiler ilerlemesini ilgilenmektedir. Dopamin D1 reseptörleri prefrontal korteks (PFC) ve beynin striatal bölgeler varsa ve Bilişsel süreçler1bellek, zamansal işleme ve lokomotif davranış2,3 çalışmak dahil olmak üzere, ağır etkisi , 4 , 5 , 6 , 7. önceki çalışmalar aydınlatılmamıştır değişiklikleri reseptörlerinin dopamin D1 ilerlemesini dikkat eksikliği-hiperaktivite bozukluğu (DEHB)8, şizofreni9, nörobilişsel belirtiler ile ilişkili bulunmuştur 10 ve stres duyarlılık11. Özellikle, şizofreni, Pozitron emisyon tomografisi (PET) çalışmalar dopamin D1 reseptörleri prefrontal cortices bağlama yeteneği son derece bilişsel açıkları ve negatif belirtiler11varlığı ile ilgili belirtti. D1 dopamin reseptör tarafından düzenlenir prefrontal korteks eksitatör nöronlar dendritik büyüme stres duyarlılık azaltır. Ayrıca, D1 reseptör medial prefrontal kortikal (mPFC) nöronlar içinde nakavt sosyal yenilgi sosyal kaçınma stres kaynaklı12geliştirmek.
Burada, tek RNA molekülleri ile taze donmuş doku örneklerini bir hücre görselleştirmek için RNA in situ hibridizasyon roman tekniği tanıtmak. Mevcut teknik içinde geçerli edebiyat mevcut yöntemleri üzerinde birden çok avantajları vardır. İlk olarak, geçerli yordam doku kayma ve morfolojik bağlamında korur ve böylece taze gerektiren diğer yordamlar, gömülü olmayan doku geçerli yöntemleri ile kombine taze donmuş doku örnekleri üzerinde gerçekleştirildi. Formalin sabit ve parafin gömülü dokularda benzer yordamlar tek transkripsiyon çözünürlük bir RNA in situ hibridizasyon tekniği13kullanılarak elde edilebilir gösterildiği. RNA tek transkripsiyon düzeyinde algılanması üstün hassasiyet düşük kopya numara ifadesi hem de diğer nükleik asit algılama yöntemlerle elde tek tek hücre düzeyinde gen ekspresyonu karşılaştırmak için fırsat sağlar, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri gibi. Ayrıca, geçerli yöntem için tek hedef RNA transkript melezleşmiştir ve sıralı olarak algılama sinyali amplifikasyon molekülleri bir çağlayan ile bağlı çok özel RNA probları ile imge ile yüksek sinyal gürültü oranı korur sistem. Son olarak, günümüz teknolojisi soruşturmamız için yalnızca bir sınıf sistemi ile ilgili işaretleri tarafından protein algılaması gibi sınırlama yerine onun hedef özgü özel probları ile birden çok biyolojik sistemleri değerlendirmek için fırsat sağlar immünhistokimya yöntemleri.
Bizim çalışmada, biz bu roman RNA in situ hibridizasyon nucleus accumbens (NAc) Drd1α reseptör ifade ve gözlemliyorum nigra (SNR) tirozin hidroksilaz (TH) ifadesinde değerlendirmek için her ikisi erkek ve dişi F344/N fareler kullandık. Yenilikçi RNA in situ hibridizasyon DA alımı ve DA yayın aynı anda etkileyen, striatal DA sistemin karmaşıklığı anlayışımızı geliştirmek mekanizmaları incelemek için bize etkin. Taze donmuş beyin dilimler ve veri analiz yöntemleri farklı boyama desenleri için sağlamak için burada, biz açıklayınız: "ayrı nokta" veya "kümeler".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel protokol hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) University of South Carolina tarafından kabul edildi (federal güvence numarası: A3049-01).
1. taze donmuş beyin bölümleri hazırlanması
- F344/N sıçan zorlanma kullanın: her seks üç fareler 13 ay-in yaş, vücut ağırlığı yaklaşık 320 g.
- Sevoflurane konsantrasyonu % 5 (sevoflurane dozda) için ayarlayın. Sevoflurane maruz kalma durur bir dakika için nefes sonra devam.
- Fareyi başını kesmek ve beyin kaldırın.
- Sıçan beyin 15 için sıvı azot daldırın doku hasat 5 dk içinde s.
- -20 ° C'de 1 h için cryostat beyne equilibrate.
- 30 µm bölümleri kesilmiş ve ( Tablo malzemelerigörmek) slaytlar aktarın.
- Nucleus accumbens bölgesinden yaklaşık 2,76 mm Bregma14anterior 2.28 mm bölümleri tercih.
- Sürekli dilim olfaktör ampul nucleus accumbens bölgeye göre fare stereotaksik beyin yapısı ile fare beyninden.
- Örnek slaytlar üzerine monte. -20 ° c kuru için 10 dakika için bölümleri tutmak.
- Hemen bırakın önceden soğutulmuş %4 paraformaldehyde 4 ° C'de 1 h için slaytları
- Oda sıcaklığında (RT) artan bir etanol degrade slaytlar yer: % 50 alkol 5 dakika; % 70 alkol 5 dakika; ve %100 5 min için alkol.
- Taze %100 ile tekrar alkol.
- Slaytlar emici kağıt üzerine yerleştirin ve kuru hava.
- Bir bariyer her bölümün bariyer kalemle çizin ( Tablo malzemelerigörmek). 1 dk. tamamen kuru bariyer izin.
2. ön beyin bölümleri
- Fırını ve 40 ° c sıcaklık ayarla
- 3 damla (90 µL) Önarıtma 4 reaktif ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) her beyin bölümünde (slayt başına bir bölüm).
- 30 dk RT. az için bölümleri kuluçkaya
- 1 x PBS RT. tekrar ediyorum, 1 dk. için taze 1 x PBS ile slaytları daldırın.
Not: 1 x PBS 15dk daha uzun süre içinde slayt kalmamalıdır.
3. RNA In Situ hibridizasyon floresan Multiplex tahlil
- Hedef sonda bir su banyosunda 40 ° C'de 10 dakika sıcak ve sonra RT için cool
- RNA reaktif yerleştirin (örneğin, Amp 1-4 FL), RT.
- Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
- 3 damla (90 µL) örnek dilim üzerinde Drd1α inceleyebilirsek (C1) ekleyin. 40 ° C'de 2 h için kuluçkaya
- Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.
- Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
- Amp 1-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- Taze 1wash arabellek ile RT. tekrar 2 min için 1 yıkama tampon içindeki slaytları daldırın.
- Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
- Amp 2-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
- Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.
- Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
- Amp 3-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- Taze 1 yıkama arabellek x ile yıkama arabellek RT. tekrar 2 min için x 1 içindeki slaytları daldırın.
- Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
- Amp 4-FL-Alt A örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
- Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.
- Aşırı sıvı slaytlardan kaldırmak ve hemen montaj reaktif 2 damla yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) her bölüme.
- 22 mm 22 mm coverslip yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) her beyin bölümü üzerinde.
- Slaytları 2-8 ° C'de karanlık kadar kuru depolama.
- Confocal mikroskobunun açmak ve bir 60 X amaç için geçiş.
- Z-yığın görüntü confocal mikroskopla elde. Tamamlayıcı video confocal görüntüleme ayrıntılı yordam için bkz.
- Nucleus accumbens bölgedeki hücreler etiketli Drd1α görüntüleri (uyarma: 488 nm; Emisyon: 515/30 nm).
Not: beyin bölümleri arasında kuluçka adımları kurumasına izin vermeyin.
4. veri analizi
- Boyama desen yarı kantitatif analiz: "ayrık noktalar".
- Görüntü tek hücre tanımlamak için DAPI nükleer bir işareti olarak boyama gerçekleştirmek. Ancak, birden çok türde hücre çekirdeği ve/veya hücreler düzensiz şekli ile olduğundan beyin doku bazı kısımlarını çözümlemek hala zordur. Burada, iki deneyimli araştırmacılar hücre bölgesi tanımlamak için görüntülerden her hücre ayrı olarak atayın.
- Görsel olarak her hücre içinde belirli bir ölçüte uyan (şekil 1B) kullanarak hücre başına nokta sayısını temel alan temsilcisi confocal görüntüleri puan.
- Her kategoride toplam cep numarasını belirlemek ve tüm doku bölümlerin (şekil 2A) hem kadın ve erkek için her kategori içindeki hücreleri yüzde frekans görüntüleyen göreli sıklığı grafikler oluşturmak için toplam hücresini sayı x100 bölmek ayrı ayrı (şekil 2E).
- Tüm önceden kategoriler içinde hücrelerin toplamı ayrı ayrı hücreleri tüm doku bölümlerin (şekil 2B) ve kadın ve erkek için toplu sıklığını belirlemek için toplam hücresini sayıya x100 bölme (şekil 2F).
- "Ayrık noktalar desen (isteğe bağlı) boyama" istatistiksel analiz.
- Sıralı (Yani, her rütbe en düşük hücre ifade (1) yüksek hücre ifadesi (9) kategoriye dahil hücre sayısı) doğada kategorik bir değişken sağlamak için hücre başına nokta sayısını inceleyin daha da İstatistiksel analizler için.
- Tanımlayıcı istatistik muayene sonrasında, üç ana yaklaşım kullanın: bir şömine-Haenszel istatistik, Mann-Whitney U testi ve Kruskal-Wallis testi. Kesin istatistiksel yaklaşım üzerine bağlı olacaktır, ancak faiz, istatistiksel karar ağacı (şekil 4) deneysel tasarım ve araştırma sorusu bir analitik yaklaşım ile ilgili kararların alınmasında yardımcı olabilir.
- Desen boyama için sinyal şiddeti faiz (ROI) bölgesinde ölçmek: "kümeler".
- Aşağıdaki denklemi kullanarak her görüntü sinyali yoğunluğunu hesaplamak:
Sinyal şiddeti toplam yatırım Getirisi görüntü - (ortalama arka plan yoğunluğu × Toplam görüntü alanını) yoğunluğu = - Toplam hücre başına yaklaşık sinyal ifade hesaplamak için yatırım Getirisi görüntü içindeki hücreleri saymak. Sinyal şiddeti/resim hem de hücreleri/resim sayısı grup farklılıkları sinyal ifade/hücrede görülen grup farklılıklara katkıda bulunabilir mekanizmaları dikkate ilgi olabilir (şekil 3B-3D).
- Aşağıdaki denklemi kullanarak her görüntü sinyali yoğunluğunu hesaplamak:
- "Desen (isteğe bağlı) Boyama kümeleri" istatistiksel analiz.
- Daha fazla istatistiksel analiz için bir sürekli değişken sağlamak için sinyal ifade/hücre inceleyin. Kullanım tasarımında bir bağımsız örnek t-Testi ve konular arasındaki faktörler sayısına göre Varyans analizi (ANOVA), dahil olmak üzere iki yaklaşım dahil. İstatistiksel karar ağacı (şekil 4) en uygun istatistiksel yaklaşım ile ilgili kararların alınmasında yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çalışmada "(şekil 1A) F344/N Sıçanlarda NAC desen dopamin D1-Alfa reseptörleri (Drd1α) RNA ifade için boyama bir ayrık noktalar" görülmektedir. Bireysel Floresans sinyalleri kolayca tespit edilmiştir ve görülebilir tek "nokta," her biri tek bir RNA transkript hücre içinde temsil eder. "Ayrık noktalar desen boyama" ekran görüntüleri için Kak, ifade yarı kantitatif analiz (şekil 1A, şekil 2Ave 2B) kullanarak dinamik aralığını değerlendirildi. Her hücre "0-9 hücre başına nokta sayısını temel alan" atan oldu. Bu "melez sinyal"-puanı (H-score) yöntemi böylece değerlendirmek ölçüde ve değişkenlik Drd1α ifade için tek tek hücreler arasında.
"Ayrı nokta deseni boyama" için yarı kantitatif yaklaşım sıralı (Yani, en alt sırada hücreye (1) en yüksek (9) başına nokta sayısı) daha fazla istatistik analiz doğada kategorik bir değişken sağlar. Bu da çalışmanın, bir konular arasında faktör (Yani, seks) etkisi Kak Drd1α ifadede incelenmesiyle ilgileneceğini olduğumuzu. İç içe veri yapısı (NAc hücrelerde etiketli Drd1α iki Z-yığın resim her hayvan için eldeYani ) için hesap için ortalama sayısı değerleri her kategori için hesaplanan ve istatistiksel analiz için kullanılan (erkek: n= 3, erkek: n = 3). Verilen bir konular arasında faktör (Yani, seks) farklılıkları (Yani, erkek, kadın) iki grup ile Mann-Whitney U incelenmesi bizim ilgi test ortalama hücre sayısı (şekil 2B) farklılıkları değerlendirmek için yapılmıştır. Mann-Whitney U testi bir azalma medyan hücre Puan erkek hayvanlar göre görüntüleme dişi hayvanlarla seks [z=-5,8, p≤0.001], önemli bir temel etkisi ortaya koydu. Şekil 2E ve 2F göstermek hücreleri iki yöntem kullanarak her kategoride sıklığı: göreli sıklığı ve toplu frekans. Dişi hayvanlar dağılımıyla daha sık erkek hayvanlar göre daha düşük sıralı kategorilerdeki hücrelerinin önemli bir kayma görüntülenir. Bir şömine-Haenszel test Derneği istatistiksel olarak önemli bir etkisi seks açığa dağıtım, incelemek için yapılmıştır [χ2MH(1) 67.3, p≤0.001 =]. Böylece, genel olarak, sonuçları net seks farklılıklar Kak Drd1α ifadede öneririz.
Transkript kopya sayısı çok yüksek olduğu durumlarda, sinyalleri kümeleri görünebilir. Burada, tirozin hidroksilaz ifade (TH) SNR bölgesinde "desen (şekil 3A) Boyama kümeleri" gösterdi. Bu yüksek ifade işareti ölçmek için ilk sekiz farklı arka plan alanlardan arka plan yoğunluğu ortalama. Ortalama arka plan yoğunluğu en düşük yoğunluk eşiğin ayarladıktan sonra değiştirilmiş görüntü yoğunluğu TH. Hücre başına sinyal olarak analiz edildi
Bir konular arasında faktör (Yani, seks) incelenmesi bizim ilgi göz önüne alındığında, bir bağımsız örnekler t-Testi uygun istatistik yaklaşımıdır. Çözümleme için veri günlük dönüştürdü. İç içe veri yapısı (SNR hücrelerde etiketli TH iki Z-yığın resim her hayvan için eldeYani ) için hesap için ortalama değerleri hesaplanır ve istatistiksel analiz için kullanılan (erkek: n= 2, erkek: n= 3). Dişi hayvanlar ortalama sinyal yoğunluğu (şekil 3B), toplam TH ifade, erkek hayvanlar göre daha yüksek düzeyde düşündüren'önemli bir artış görüntülenir (t(3) 3.3, p≤0.05 =). Ancak, önemli cinsiyet farkı yok ya da görüntü başına hücre sayısı gözlendi (t(3) 2.0, p= > 0,05; Şekil 3 c) veya sinyal ifade hücre başına ortalama (t(3) 2.0, p= > 0,05; Şekil 3D). Üç ölçülerin bir konu içinde faktör olarak dikkate alınarak bir karışık-tasarım ANOVA, aynı zamanda seks önemli bir temel etkisi ortaya [F (1,3) 10.6, p≤0.05 =].
Şekil 1: nokta deseni boyama için hücre başına ortalama sayısı yarı kantitatif analiz kriterleri: "ayrık noktalar". A. temsilcisi confocal görüntüleri (60 X) Drd1α ifade farklı puanları (% 250 ölçek orijinal resim boyutuyla güçlendirilmiş) B. "Puanı" belirli kategori her ölçütü için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: F344/N sıçan Nucleus Accumbens bölgedeki dopamin D1-Alfa reseptör (Drd1α) RNA düzeyi. A. göreli sıklığı % her "puan" Kategorya. B. sigmoidal doz-yanıt eğrisi iyi tarif bir uyum sağladığı (r20,99 =) % 95 güven aralıkları ile (CI; noktalı çizgilerle gösterilir) her "puan" Kategorya toplu frekans % için uygun. C. temsilcisi confocal görüntülerini (60 X) Drd1α ifade içinde "ayrık noktalar desen boyama" var erkek ve dişi rats. ö Temsilcisi grafiği içinde erkek ve dişi rats ortalama hücre skor. Hata çubukları için standart hata değerlerin ortalamasının (SEM) dur. E. göreli sıklığı % erkek ve dişi fareler dokulardan ifadede karşılaştırma her "skor" kategori. F. Sigmoidal doz-yanıt eğrileri iyi tarif bir uyum sağladığı (r2s 0,99 =) % 95 güven aralıkları her "puan" Kategorya erkek ve dişi fareler arasında toplu frekans % ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: tirozin hidroksilaz RNA düzeyi (TH) gözlemliyorum Nigra (SNR) bölgesi F344/N Sıçanlarda. A. temsilcisi confocal görüntüleri (60 X; Uyarma: 543 nm; Emisyon: 590/50 nm) TH ifadesi içinde erkek ve dişi rats, hangi-si olmak "desen boyama kümeleri". B-ö. Sinyal şiddeti hücre başına temsilcisi analizi. Sinyal ifade / hücre resimle (yoğunluk eşik küme arka plan üzerinde) sinyal yoğunluğu miktarının ve onun görüntü içindeki hücreleri tarafından bölücü den türemiş. Hata çubukları standart hata ortalamaya (SEM) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: karar ağacı için önerilen istatistiksel analiz. Karar ağacı hangi istatistiksel analiz faiz araştırma soru için en uygun olduğunu belirlemek için yönergeler sağlar. Karar ağacı ayrıntılı değildir ve bazı durumlarda, diğer analizler uygun olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için in situ hibridizasyon nucleus accumbens (NAc) Drd1α reseptör ifade ve tirozin hidroksilaz (TH) ifade gözlemliyorum nigra (SNR) bölgesinde değerlendirmek için taze donmuş beyin dilimler için roman tekniği tarif. Ayrıca farklı boyama desenleri için veri analizi yöntemleri sağlar: "ayrı nokta" veya "kümeler".
Başarılı multiplex Floresans RNA in situ hibridizasyon tahlil için kritik adımlar dahil edilir. Don sıçan decapitating ve beyin, kaldırma sonra beyin 5 dk. içinde sıvı azot beyin bölümleri-20 ° C'de % 4 paraformaldehyde fiksasyon kadar tutun. Ön 4 kuluçka 30 dk sonra slaytlar 1 x PBS 15dk daha uzun süre kalmamalıdır. Beyin bölümleri arasında amplifikasyon adımları kurumasına izin vermeyin. Confocal görüntüleme için-mek şartıyla yüksek kaliteli görüntüler gösteren açık boyama sinyaller doku örneği de çok yardımcı oldu. Hibridizasyon fırın kullanarak hızla ve verimli bir şekilde örnekleri 40 ° C'ye getirecek
Kak Drd1α reseptör ifade bireysel floresan sinyallerini "tek nokta, her biri tek bir RNA transkript hücre içinde temsil" olarak tespit edilmiştir. Önemlisi, "nokta" boyutu tahlil koşulları farklılıklar, numune hazırlama ve diğer faktörler yerine Drd1α-RNA ifade düzeylerini yansıtır. Benzer şekilde, tek tek "nokta" sinyal yoğunluğu Drd1α-RNA ifade seviyelere konuyla ilgisi yok. Bu ifade "0-9 ölçüde ve değişkenlik Drd1α ifade değerlendirir hücre başına nokta sayısını temel alan" ile attı bir yarı kantitatif analiz olarak dinamik aralığını değerlendirildi. Ayrıca, hücre başına nokta sayısı incelenmesi kategorik bir değişken daha da İstatistiksel analizler için sağlar.
Tanımlayıcı istatistik muayene, bizim Protokolü "ayrı nokta deseni, daha fazla çözümleme için sıralı bir değişkeni sağlayan boyama" mevcut sinyalleri istatistiksel analiz için üç ana yaklaşım önerir. Özellikle, parametrik olmayan Mann-Whitney U testi, nonparametrik Kruskal-Wallis testi ve dernek bir şömine-Haenszel test tavsiye edilir. Tek inceleyerek arasında-faktörü (Örneğin, seks) konular Mann-Whitney U testi ve Kruskal-Wallis testi en uygun olduğunda. Ayrıca, bir şömine-Haenszel test Derneği dağıtım nöbetleşe incelenmesi için uygun olabilir. Ek etkenler dahil olduğunda daha karmaşık istatistiksel analizler, genelleştirilmiş tahmin denklemi veya genel doğrusal karma modeli de dahil olmak üzere uygun olabilir. Önerileri ayrıntılı değildir ve hassas istatistiksel yaklaşım deneysel tasarım ve araştırma soru ilgi bağlı olacaktır.
Ancak, transkript kopya sayısı çok yüksek olduğu durumlarda, sinyalleri kümeleri görünebilir. Burada, TH ifade SNR bölgesinde "desen boyama kümeleri" gösterdi. Yüksek ifade TH işaretçiyi ölçmek için biz ortalama arka plan yoğunluğu en düşük yoğunluk eşiğin ayarlama konusunda temel ve sinyal TH. Hücre başına olarak analiz görüntü yoğunluğu ayarlanabilir Bağımsız bir kullanarak gibi SNR TH istatistiksel analiz "desen, boyama küme" mevcut sinyalleri örnekler t-testleri veya ANOVA grupları karşılaştırmak için.
Bu roman RNA in situ hibridizasyon testin sınırlamalar vardır. "Desen boyama ayrı nokta için", bu daha doğru bir şekilde tek bir hücrenin tanımlama içerir. Bizim çalışmada, görüntüden, tek hücre tanımlamak için DAPI nükleer bir işareti olarak boyama yapılır. Ancak, birden çok türde hücre çekirdeği ve/veya hücreler düzensiz şekillerle olduğundan beyin doku bazı kısımlarını çözümlemek hala zordur. Burada, iki deneyimli araştırmacılar hücre bölgesi tanımlamak için görüntülerden her hücre ayrı olarak atayın. "Desen boyama kümeleri için" özel bir yazılım eşik veya otomatik hücre recognization kurulum için seçilmelidir.
Böylece, yenilikçi RNA in situ hibridizasyon tahlil DA alımı ve DA yayın aynı anda etkileyen, striatal DA sistem karmaşıklığı anlayış iyileştirilmesi mekanizmaları incelemek için bize etkin. Genel olarak, araştırmacılar araştırma dopaminerjik işaretleri işlevsel olmayan değişiklikler ortaya çıkması ve beyin bozukluklarının ilerlemesini sırasında zaman roman RNA in situ hibridizasyon tekniği yararlanırlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir bildirmek için çıkar çatışması vardır.
Acknowledgments
Mevcut işleri Sağlık (NIH) hibe HD043680, MH106392, DA013137 ve NS100624 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklendi. Kısmi Fonu Biyomedikal davranış bilimleri NIH T32 eğitim grant tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe - Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe - Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
- Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
- Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
- Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
- Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
- Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
- Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
- Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
- Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).
