Summary
Identifikasjon av dopamin D1-alfa reseptoren i nucleus accumbens er avgjørende for å avklare D1 reseptor dysfunksjon under en sentralnervesystemet sykdom. Vi utførte en roman RNA i situ hybridisering analysen for å visualisere enkelt RNA molekyler i et bestemt hjernen.
Abstract
I sentralnervesystemet er D1-alfa undertype reseptoren (Drd1α) den mest tallrike dopamin (DA) reseptoren, som spiller en viktig rolle i å regulere dannes hemmer nevronal vekst og utvikling. Mekanismene bak Drd1α reseptor unormalt formidling atferdsdata svar og modulerende arbeider minnefunksjon er imidlertid uklart. Bruker en roman RNA i situ hybridisering analysen, identifisert denne studien dopamin Drd1α reseptoren og tyrosin hydroksylase (TH) RNA uttrykk fra DA-relaterte kretsene i nucleus accumbens (NAc) området og substantia nigra-regionen (SNR), henholdsvis. Drd1α uttrykk i NAc viser en "diskret dot" flekker mønster. Klart Kjønnsforskjeller i Drd1α uttrykket ble observert. Derimot viser TH et "klynger" flekker mønster. Om TH uttrykk vises hunnrotter et høyere signal uttrykk per celle i forhold til mannlig dyr. Metodene presenteres her gi en roman i situ hybridisering teknikk for å undersøke endringer i dopamin systemet dysfunksjon under utviklingen av sentralnervesystemet sykdommer.
Introduction
Dysfunksjon av dopamin striatal er involvert i utviklingen av kliniske symptomer i flere nevrokognitive sykdommer. Dopamin D1 reseptorer finnes i prefrontal cortex (PFK) og striatal områder av hjernen og påvirke tungt kognitive prosesser1, inkludert minne, timelige behandling og lokomotiv atferd2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. forrige studier belyst at endringer av dopamin D1 reseptorer var knyttet til utviklingen av oppmerksomhet underskudd hyperaktivitet disorder (ADHD)8nevrokognitive symptomene i schizofreni9, 10 og stress mottakelighet11. Spesielt i schizofreni indikerte fantes et positron utslipp tomografi (PET) studier at bindingen evne til dopamin D1 reseptorer i prefrontal halvdelene var svært knyttet til kognitiv underskudd og tilstedeværelsen av negative symptomer11. Dendrittiske veksten av eksitatoriske nerveceller i prefrontal cortex regulert av dopamin D1 reseptoren lindrer stress mottakelighet. Videre kan knockdown D1 reseptoren i mediale prefrontal kortikale (mPFC) neurons forbedre de sosiale nederlag stress-indusert sosiale unngåelse12.
Her introduserer vi en teknikken av RNA i situ hybridisering visualisere enkelt RNA molekyler i en celle med frisk-frosne vevsprøver. Nåværende teknikken har flere fordeler fremfor metoder som finnes i gjeldende litteratur. Først gjeldende prosedyre bevarer romlige og morfologiske sammenheng av vev og ble utført på frisk-frosne vevsprøver slik at andre prosedyrer krever friske, ikke-innebygd vev kan kombineres med gjeldende metoder. Lignende fremgangsmåter i formalin-fast og parafin-embedded vev har illustrert at enkelt transkripsjon oppløsning kan oppnås ved hjelp av en RNA i situ hybridisering teknikk13. Påvisning av RNA på enkelt transkripsjon nivå gir overlegen følsomhet til lav kopi talluttrykk samt muligheten til å sammenligne genuttrykk nivået av individuelle celler som kan oppnås ved andre nukleinsyre gjenkjenningsmetoder som polymerase kjedereaksjon (PCR) teknikker. I tillegg opprettholder det aktuelle metoden bilder med høy signal-til-støy forholdet gjennom svært spesifikke RNA sonder som hybridiserte til enkelt mål RNA transkripsjoner, og sekvensielt bundet med en kaskade av signal forsterkning molekyler i deteksjon system. Til slutt gir den nåværende teknologien mulighet til å vurdere flere biologiske systemer med sin mål-spesifikke proprietære sonder, i stedet for å begrense våre undersøkelser bare én klasse av systemrelaterte markører som proteinet oppdagelsen av immunohistochemistry metoder.
I vår studie brukte vi denne romanen RNA i situ hybridisering for å evaluere Drd1α reseptor uttrykk i nucleus accumbens (NAc) og tyrosin hydroksylase (TH) uttrykk i substantia nigra (SNR) av både mannlige og kvinnelige F344/N rotter. Nyskapende RNA i situ hybridization aktivert vi mekanismer påvirke både DA opptak og DA utgivelsen samtidig, forbedre vår forståelse av striatal DA systemets kompleksiteten. Her beskriver vi prosedyren for frisk-frosne hjernen skiver og gir metoder for analyse for ulike flekker mønstre: "diskret dot" eller "klynger".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentell protokollen ble godkjent av Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of South Carolina (føderale forsikring nummer: A3049-01).
1. forberedelse av fersk frosne hjernen
- Bruk F344/N rotte belastningen: tre rotter av hvert kjønn, 13 måneders alder, kropp vekt ca 320 g.
- Justere desflurane konsentrasjonen 5% (overdose av desflurane). Fortsette desflurane eksponering etter puster stopper for en ekstra minutt.
- Halshugge rotta og fjerne hjernen.
- Senk rotte hjernen i flytende nitrogen for 15 s i 5 minutter for vev.
- Equilibrate hjernen til 20 ° C i en kryostaten 1t.
- Skjær 30 µm deler og overføre på lysbilder (se Tabell for materiale).
- Velge deler fra nucleus accumbens regionen, ca 2.76 mm 2.28 mm anterior Bregma14.
- Kontinuerlig skive rotte hjernen fra olfactory pære gjennom nucleus accumbens regionen i henhold til stereotaxic hjernen strukturen av rotte.
- Montere eksempler på lysbildene. Hold delene på 20 ° C i 10 min å tørke.
- Umiddelbart fordype lysbilder i den pre kjølt 4% paraformaldehyde 1t på 4 ° C.
- Plasser lysbildene i en økende etanol gradient ved romtemperatur (RT): 50% EtOH etter 5 min; 70% EtOH etter 5 min; og 100% EtOH etter 5 min.
- Gjenta med fersk 100% EtOH.
- Plassere lysbilder på absorberende papir og lufttørke.
- Tegn en barriere rundt hver del med en barriere (se Tabell for materiale). La barriere tørke helt 1 min.
2. forbehandling av hjernen
- Slå på ovnen og sette temperaturen til 40 ° C.
- Legge 3 dråper (90 µL) forbehandling 4 reagens (se Tabell for materiale) på hver hjernen delen (én del per lysbilde).
- Inkuber delene i 30 min på RT.
- Senk lysbildene i 1 x PBS for 1 min på RT. Gjenta med fersk 1 x PBS.
Merk: Lysbilder bør ikke bo i 1 x PBS lenger enn 15 min.
3. RNA i Situ hybridisering fluorescerende Multiplex analysen
- Varme målet sonden i 10 min på 40 ° C i et vannbad, og deretter avkjøles til RT.
- Plasser RNA reagensen (f.eks Amp 1-4 FL) på RT.
- Fjerne overflødig væske fra lysbilder med tørkepapir og plassere tilbake på objektglasstativet (se Tabell for materiale).
- Legge 3 dråper (90 µL) av Drd1α sonden (C1) på eksempel sektoren. Inkuber 2 h på 40 ° C.
- Senk lysbilder i 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT. Gjenta med fersk 1 x vaskebuffer.
- Fjerne overflødig væske fra lysbildene med tørkepapir og plassere tilbake på objektglasstativet (se Tabell for materiale).
- Legge 3 dråper (90 µL) Amp 1-FL på eksempel sektoren. Inkuber i 30 min på 40 ° C.
- Senk lysbilder i 1 vaskebuffer i 2 minutter på RT. Gjenta med fersk 1wash buffer.
- Fjerne overflødig væske fra lysbildene med tørkepapir og plassere tilbake på objektglasstativet (se Tabell for materiale).
- Legge 3 dråper (90 µL) Amp 2-FL på eksempel sektoren. Inkuber i 15 min på 40 ° C.
- Senk lysbilder i 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT. Gjenta med fersk 1 x vaskebuffer.
- Fjerne overflødig væske fra lysbildene med tørkepapir og plassere tilbake på objektglasstativet (se Tabell for materiale).
- Legge 3 dråper (90 µL) Amp 3-FL på eksempel sektoren. Inkuber i 30 min på 40 ° C.
- Senk lysbilder i 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT. Gjenta med fersk 1 x vaskebuffer.
- Fjerne overflødig væske fra lysbildene med tørkepapir og plassere tilbake på objektglasstativet (se Tabell for materiale).
- Legge 3 dråper (90 µL) Amp 4-FL-Alt A på eksempel sektoren. Inkuber i 15 min på 40 ° C.
- Senk lysbilder i 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT. Gjenta med fersk 1 x vaskebuffer.
- Fjerne overflødig væske fra lysbilder og umiddelbart plassere 2 dråper montering reagens (se Tabell of Materials) til hver del.
- Plasser en 22 mm 22 mm dekkglassvæske (se Tabell for materiale) over hver hjernen inndeling.
- Lagre lysbilder i mørket på 2-8 ° C til tørr.
- Slå på AC confocal mikroskopet og bytte til en 60 X-målet.
- Få Z-stakk bilder med AC confocal mikroskop. Se supplerende videoen for en detaljert fremgangsmåte for AC confocal imaging.
- Hente bilder av Drd1α merket cellene i regionen nucleus accumbens (eksitasjon: 488 nm; Utslipp: 515/30 nm).
Merk: Ikke la hjernen deler tørke ut mellom inkubasjon trinn.
4. dataanalyse
- Analysere semi kvantitativt flekker mønsteret: "diskret prikker".
- For å identifisere individuelle cellen fra bildet, kan du utføre DAPI flekker som en kjernefysisk markør. Men er det fortsatt vanskelig å analysere enkelte deler av hjernevevet siden det har flere typer celler med uregelmessig form av kjerner og/eller celler. Her, tilordne to erfarne forskere separat hver celle fra bilder til å definere celle regionen.
- Visuelt score hver celle i representant AC confocal bildene basert på antall prikker per celle etter bestemte vilkår (figur 1B).
- Fastslå hvor total-cellen i hver kategori og dele det totale celle nummeret x100 opprette relative hyppigheten diagrammer som viser prosent antallet celler i hver kategori for alle vev deler (figur 2A) og for menn og kvinner separat (figur 2E).
- Dividere summen av celler i alle tidligere kategorier av total-celle nummer x100 å bestemme kumulativ celler for alle vev deler (figur 2B) og for menn og kvinner separat (figur 2F).
- Statistisk analysere "diskret kuler" flekker mønster (valgfritt).
- Undersøke antall prikker per celle å gi en kategoriske variabel som ordenstall i naturen (dvs. antall celler som faller i hver rang kategori fra laveste celle uttrykk (1) til høyeste cellen uttrykk (9)) for videre statistiske analyser.
- Etter undersøkelse av beskrivende statistikk, bruker tre viktigste tilnærminger: en Mantel-Haenszel statistikk, en Mann-Whitney U test og en Kruskal-Wallis-test. Selv om nøyaktig statistisk tilnærming vil være avhengig av kan eksperimentell design og forskning spørsmålet av interesse, en statistisk beslutningstreet (Figur 4) hjelpe i beslutninger om en analytisk tilnærming.
- Kvantifisere signal intensiteten i regionen rundt (ROI) for farging mønster: "klynger".
- Beregne signal intensiteten på hvert bilde ved hjelp av følgende ligning:
Signal intensitet = totalt intensiteten av Avkastningen bilde - (gjennomsnittlig bakgrunn intensitet × Total bildeområde) - Tell antall celler i Avkastningen bildet for å beregne omtrentlig signal uttrykket per celle. Gruppe forskjeller i signal intensitet/bilde samt antall celler/bilde kan være av interesse å vurdere mekanismer som kan bidra til gruppen forskjeller i signal uttrykkscellen (figur 3B-3D).
- Beregne signal intensiteten på hvert bilde ved hjelp av følgende ligning:
- Statistisk analysere "klynger" flekker mønster (valgfritt).
- Undersøke signal/uttrykkscellen for å gi en kontinuerlig variabel for ytterligere statistisk analyse. Bruk to tilnærminger, inkludert en t-test med uavhengige utvalg og variansanalyse (ANOVA), basert på antall mellom-temaer faktorer inkludert i utformingen. En statistisk beslutningstreet (Figur 4) kan hjelpe i beslutninger om passende statistiske tilnærming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien observert en "diskret prikker" flekker mønster for RNA uttrykk i dopamin D1-alfa receptors (Drd1α) av NAc i F344/N rotter (figur 1A). Individuelle fluorescens signaler var lett identifiseres og kan sees som enkelt "prikker", hver representerer en enkelt RNA transkripsjon i cellen. For bilder fra NAc som viser "diskret kuler" flekker mønster, vurdert vi det dynamiske utvalget av uttrykk med en semi kvantitativ analyse (figur 1A, figur 2Aog 2B). Hver celle ble scoret fra "0-9" basert på antall prikker per celle. Denne "hybridisert signal"-score (H-score) metoden kan derfor vurdere omfanget og variasjon for Drd1α uttrykk i individuelle celler.
Semi kvantitativ tilnærming til "diskret dot" flekker mønster gir en kategoriske variabel som ordenstall i naturen (dvs. antall prikker per celle rangert fra lavest (1) til høyest (9)) for videre statistisk analyse. Studien var vi interessert i å undersøke effekten av en mellom-temaer factor (dvs. sex) på Drd1α uttrykk i NAc. Kontoen for nestede datastrukturen (dvs. to Z-stakk bilder av Drd1α merket celler i NAc ble innhentet for hvert dyr), var gjennomsnittlig antall verdiene beregnes for hver kategori og brukt til statistisk analyse (mannlige: n= 3, kvinnelige: n = 3). Gitt vår interesse i å undersøke forskjellene i en mellom-temaer faktor (dvs. sex) med to grupper (dvs., mannlige, kvinnelige) en Mann-Whitney U ble testen gjennomført for å vurdere forskjeller i median celletall (figur 2D). En Mann-Whitney U test avslørte en betydelig viktigste effekt av sex [z=-5.8, p≤0.001], med kvinnelige dyr viser en redusert median cellen poengsum i forhold til mannlig dyr. Figur 2E og 2F illustrere frekvensen av celler i hver kategori med to metoder: relative hyppigheten og kumulativ. Kvinner dyrene vises et betydelig skift i distribusjonen, med større frekvens av celler i lavere sorterte kategorier i forhold til mannlig dyr. En Mantel-Haenszel test av Foreningen ble gjennomført for å undersøke statistisk distribusjon, avslører en signifikant effekt av sex [χ2MH(1) = 67.3, p≤0.001]. Dermed samlet tyder resultatene klart Kjønnsforskjeller i Drd1α uttrykk i NAc.
I tilfeller hvor kopien antall transkripsjon er svært høy, kan signalene vises som klynger. Her viste tyrosin hydroksylase uttrykk (TH) i SNR regionen "klynger" flekker mønster (figur 3A). For å måle denne høy-uttrykke markøren, gjennomsnitt vi først bakgrunn intensiteten fra åtte forskjellige bakgrunn områder. Når minimum intensitet terskelen over gjennomsnittlig bakgrunn intensiteten, ble justert bildet intensiteten analysert som signal per celle av th
Vår interesse i å undersøke en mellom-temaer faktor (dvs. sex) er, en uavhengig prøver t-test en passende statistiske tilnærming. For analyse var data Logg-forvandlet. Kontoen for nestede datastrukturen (dvs. to Z-stakk bilder av TH merket celler i SNR ble innhentet for hvert dyr), ble gjennomsnittlige verdiene beregnes og brukt til statistisk analyse (mannlige: n= 2, kvinnelige: n= 3). Kvinner dyrene vises en betydelig økning i gjennomsnittlig signal intensitet (figur 3B), som kan tyde på et høyere nivå av total TH uttrykk, i forhold til mannlig dyr (t(3) = 3.3, p≤0.05). Men ingen betydelig kjønnsforskjeller ble observert i enten antall celler per bilde (t(3) = 2.0, p> 0,05; Figur 3 c) eller gjennomsnittet signal uttrykk per celle (t(3) = 2.0, p> 0,05; Figur 3D). En blandet design ANOVA, vurderer de tre tiltakene som innen faget faktor, avslørte også en betydelig viktigste effekt av sex [F (1,3) = 10.6, p≤0.05].
Figur 1: kriteriene for semi kvantitativ analyse på gjennomsnittlig antall prikker per celle til farging mønster: "diskret prikker". A. representant AC confocal bilder (60 X) Drd1α uttrykk på ulike score (forsterket 250% skala i forhold til opprinnelig bildestørrelse) B. Den spesifikke "score" kategorien for hvert kriterium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: dopamin D1-alfa reseptor (Drd1α) RNA nivå i Nucleus Accumbens regionen F344/N rotter. A. den relative hyppigheten % av hver "score" kategori. B. en sigmoidal dose-respons kurve gitt en godt beskrevet plass (r2= 0,99) med 95% sikkerhet intervaller (CI, angitt med prikkete) var egnet til kumulativ % av hver "score" kategori. C. representant AC confocal bilder (60 X) av Drd1α uttrykk i mannlig og kvinner rotter, som har "diskret kuler" flekker mønster. D. Representant graf mener cellen poengsum i mannlig og kvinner rotter. Feilfeltene stå for standard feil av gjsnitt (SEM). E. den relative hyppigheten % av hver "score" kategori, sammenligner uttrykket i vev fra mannlig og kvinner rotter. F. Sigmoidal dose-respons kurver gitt en godt beskrevet plass (r2s = 0,99) med 95% sikkerhet intervaller til kumulativ % av hver "score" kategori mellom mannlig og kvinner rotter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: tyrosin hydroksylase RNA nivå (TH) i Substantia Nigra (SNR) regionen i F344/N rotter. A. representant AC confocal bilder (60 X; Eksitasjon: 543 nm; Utslipp: 590/50 nm) TH uttrykk i mannlig og kvinner rotter, som har "klynger" flekker mønster. B-D. Representant analyse av signal per celle. Signal uttrykk / cellen kan utledes fra kvantifisere signal intensiteten i bildet (med intensitet terskelen sett ovenfor bakgrunn) og dele det med antall celler i bildet. Feilfeltene representerer standard feil av gjsnitt (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: beslutningstre for anbefalte statistisk analyse. Beslutningstreet gir retningslinjer for å avgjøre hvilke statistisk analyse er mest hensiktsmessig for problemstillingen rundt. Beslutningstreet er ikke uttømmende og i noen tilfeller andre analyser kan være hensiktsmessig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi romanen teknikk i situ hybridisering for frisk-frosne hjernen skiver å evaluere Drd1α reseptor uttrykk i nucleus accumbens (NAc) og tyrosin hydroksylase (TH) uttrykk i regionen substantia nigra (SNR). Vi tilbyr også metoder for analyse for ulike flekker mønstre: "diskret dot" eller "klynger".
Kritisk trinnene for en vellykket multiplex fluorescens RNA i situ hybridisering analysen er inkludert. Når decapitating rotta og fjerne hjernen, Frys hjernen i flytende nitrogen i 5 min. holde delene hjernen på 20 ° C til 4% paraformaldehyde fiksering. Etter 30 min med inkubering av forbehandling 4, bør lysbilder ikke bo i 1 x PBS lenger enn 15 min. Ikke la hjernen deler tørke ut mellom forsterkning trinn. AC confocal imaging er svært nyttig for å gi høy kvalitet profilen viser klart flekker signaler i Vevsprøve. Bruke hybridisering ovnen vil raskt og effektivt bringe prøvene til 40 ° C.
Individuelle fluorescens signaler om Drd1α reseptor uttrykk i NAc ble identifisert som enkelt "prikker," som representerer en enkelt RNA transkripsjon i cellen. Viktigere, gjenspeiler "dot" størrelse forskjeller i analysen forhold, prøve forberedelser, og andre faktorer stedet Drd1α-RNA uttrykk nivåer. Tilsvarende er signal intensiteten av personlige "prikker" ikke relevant for Drd1α-RNA uttrykk nivåer. Vi vurderte det dynamiske spekteret av denne uttrykket som en semi kvantitativ analyse scoret med "0-9" basert på antall punkt per celle, som kan vurdere omfanget og variasjon for Drd1α uttrykk. Videre inneholder undersøkelse av antall prikker per celle en kategoriske variabel for ytterligere statistiske analyser.
Etter eksamen for beskrivende statistikk anbefaler våre protokollen tre viktigste tilnærminger å statistisk analysere signaler som presenterer den "diskrete dot" flekker mønster, som gir en ordenstallet variabel for videre analyse. Spesielt anbefales en parametriske Mann-Whitney U-test, en parametriske Kruskal-Wallis-test og en Mantel-Haenszel test av foreningen. En Mann-Whitney U test og en Kruskal-Wallis test er passende når undersøke bare en mellom-temaer factor (f.eks Sex). I tillegg kan en Mantel-Haenszel test av foreningen være passende for å undersøke endringer i distribusjonen. Mer komplekse statistiske analyser, inkludert en generalisert estimering ligningen eller generell lineær blandet modell kan være hensiktsmessig når flere faktorer er inkludert. Anbefalingene er ikke uttømmende, og nøyaktig statistisk tilnærming vil være avhengig av eksperimentell design og problemstilling rundt.
Men i tilfeller der kopien antall transkripsjon er svært høy, kan signalene vises som klynger. Her viste TH uttrykk i regionen SNR "klynger" flekker mønster. For å kvantifisere høy-uttrykke TH markøren, justert vi bildet intensitet basert på angi minimum intensitet terskelen over gjennomsnittlig bakgrunn intensiteten og analysert som signal per celle av th Signaler som presenterer "klyngen" flekker mønster, som TH i SNR, statistisk kan analyseres ved hjelp av en uavhengig eksempler t-tester eller ANOVA sammenligne grupper.
Det er begrensninger på denne romanen RNA i situ hybridisering analysen. For den "diskrete dot" flekker mønster, inkluderer disse å definere en enkeltcelle mer nøyaktig. I vår studie for å identifisere individuelle cellen fra bildet utført vi DAPI flekker som en kjernefysisk markør. Men er det fortsatt vanskelig å analysere enkelte deler av hjernevevet siden det har flere typer celler for ujevne former av kjerner og/eller celler. Her, tilordne to erfarne forskere separat hver celle fra bilder til å definere regionen cellen. For "klynger" flekker mønster, valgt spesifikk programvare setup terskelen eller automatisk celle recognization.
Dermed aktivert nyskapende RNA i situ hybridisering analysen vi mekanismer påvirke både DA opptak og DA utgivelsen samtidig, bedre forståelse av kompleksiteten i striatal DA systemet. Samlet ha forskere nytte fra romanen RNA i situ hybridisering teknikken når undersøke dysfunksjonelle endringer dopaminergic markører under fremveksten og utviklingen av hjernen lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen konflikter av interesse å erklære.
Acknowledgments
Nåværende verkene ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd HD043680, MH106392, DA013137 og NS100624. Delvis fondet ble levert av NIH T32 trening stipend i biomedisinsk-atferdsterapi vitenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe - Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe - Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
- Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
- Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
- Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
- Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
- Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
- Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
- Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
- Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).
