Summary
Tumor-Suche nach therapeutischen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) vielversprechend zur Behandlung von invasiven Glioblastom. Optimale Transplantation umfasst Lieferung von MSCs in den Tumor Resektion Hohlraum auf Gerüsten. Hierbei sind präklinische Techniken, MSC Behandlung des Glioblastoms zu studieren vorgesehen, einschließlich: bildgebende Tumor Resektion; Implantation von MSC ausgesät Gerüste; und postoperative Therapie verfolgen.
Abstract
Glioblastom (GBM), der am weitesten verbreitete und aggressive primäre Hirntumoren, trägt eine Lebenserwartung von 12-15 Monate. Die geringe Lebenserwartung ist zum Teil auf die Unfähigkeit der aktuellen Behandlung, bestehend aus chirurgische Resektion gefolgt von Bestrahlung und Chemotherapie, invasiven Tumor Herde zu beseitigen. Behandlung von diese Herde kann mit Tumoricidal humaner mesenchymaler Stammzellen (MSCs) verbessert werden. MSCs potente Tumor Tropismus aufweisen und können zu express therapeutischer Proteine, die Tumorzellen zu töten konstruiert werden. Fortschritte in der präklinischen Modellen zeigen, dass chirurgische Resektion induziert vorzeitigen Verlust der MSC und therapeutische Wirksamkeit reduziert. Wirksamkeit der MSC Behandlung kann durch Aussaat MSCs auf einem Gerüst von biologisch abbaubaren Poly(lactic acid) (PLA) verbessert werden. MSC-Lieferung in der chirurgischen Resektion Hohlraum auf einem PLA-Gerüst stellt Zelle Aufbewahrung, Persistenz und Tumor töten. Um die Auswirkungen der MSC ausgesät PLA Implantation auf GBM zu studieren, braucht man ein genaues Präklinisches Modell. Hier bieten wir eine präklinische chirurgische Protokoll für bildgestützte Tumor-Resektion der GBM in immundefiziente Mäuse gefolgt von MSC ausgesät Gerüst Implantation. MSCs sind so konstruiert, mit Lentivirale Konstrukte konstitutiv auszudrücken und sezernieren therapeutische TNF-bezogene Apoptose induzierenden Liganden (TRAIL) sowie grün fluoreszierendes Protein (GFP), fluoreszierenden Tracking ermöglichen. Ebenso sind die Tumorzellen U87 express mCherry und Firefly Luciferase, Bereitstellung von dual fluoreszierenden/leuchtenden tracking entwickelt. Während derzeit verwendet für die Untersuchung von Stammzellen vermittelte Lieferung von Therapeutika, konnte dieses Protokoll geändert werden, untersuchen die Auswirkungen der chirurgischen Resektion zu anderen GBM-Interventionen.
Introduction
Glioblastom (GBM) ist der häufigste primäre Hirntumoren bei Erwachsenen mit einem düsteren mediane Überlebenszeit von nur 12-15 Monaten1,2,3,4,5. Überleben ist nicht deutlich verbessert, seit 2005 als der aktuelle klinischen Standard maximale chirurgische Resektion, gefolgt von Bestrahlung und damit einhergehende und adjuvanten Temozolomid Chemotherapie war6,7angenommen. Während dieser Behandlung Patienten mit eine vorübergehende Linderung der Symptome bietet, führt Standard der Behandlung immer Rezidiv da angriffskrebs Brennpunkte Resektion zu entziehen und aus systemische Therapien durch die Blut - Hirn-Schranke (BBB) geschützt sind. Strategien, die invasiven Tumor Herde Ziel unter Umgehung der BBB werden dringend benötigt, um gegen diese aggressiven und schwächenden Krankheit Fuß fassen.
Humane mesenchymaler Stammzellen (MSCs) vielversprechend als Medikament auslieferfahrzeuge für GBM aufgrund ihrer nativen Tumor Tropismus8,9. MSCs besitzen Rezeptoren für und Wandern in Richtung lösliche Faktoren, die Tumoren, einschließlich Stromazellen Zelle abgeleitet Faktor 1α absondern (SDF-1α), Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP-1) und Monocyte lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) u.a.10, 11 , 12 , 13. engineering MSCs zum Ausdruck bringen und sezernieren Zytostatika ermöglicht es ihnen, als Tumor-Homing Medikament Lieferfahrzeuge nutzbar gemacht werden. Veränderter MSCs Annäherung an invasiven Tumor Herde und therapeutischer Proteine liefern. Dieser Ansatz hat Machbarkeit in einer Vielzahl von präklinischen GBM Modelle9,14gezeigt. Die überwiegende Mehrheit dieser Modelle beinhalten jedoch keine chirurgische Resektion trotz die klinische Relevanz dieser Komponente. Neue Studien mit neuen Modellen der Resektion ergab, dass chirurgische Tumor Entfernung reduziert die Persistenz von Stammzellen, die direkt in die chirurgische Hohlraum15injiziert werden. Verlust der Rentabilität führte zu verminderten Wirksamkeit, wahrscheinlich wegen der Abnahme der Dosis und Dauer der Droge geliefert, die invasiven Tumor Herde.
Zur Steigerung von Stammzellen Lebensfähigkeit und Drug-Delivery können MSCs auf Gerüsten vor der Implantation ausgesät werden. In diesem Protokoll, biokompatibel und resorbierbaren Electrospun Nanofibrous Poly(lactic acid) (PLA) dient als Gerüst für die MSCs. PLA beugt und passt sich der Form des Hohlraums Resektion bei Implantat, das therapeutische Reichweite maximiert und minimiert die Entfernung MSCs reisen muss, um Tumorzellen zu erreichen. MSCs bleiben auf dem Schafott während der Implantation und migrieren Sie anschließend aus dem Gerüst gegen Tumorzellen nach Implantation16,17. MSCs und die zytotoxische Medikamente, die sie dann tragen sammeln sich im Tumor Brennpunkte. Lieferung von zytotoxischen Droge zum Tumor erfordert MSC Lebensfähigkeit und Beharrlichkeit, die durch Implantation auf Gerüsten unterstützt werden.
In diesem Verfahren Lentivirale Vektoren werden verwendet, um stabile Expression von Leuchtstofflampen (in-vitro- tracking) und Biolumineszenz (in Vivo tracking) induzieren Marker in der Krebs- und Stammzellforschung Linien. Die menschliche GBM Linie U87 ist mit mCherry und Firefly Luciferase (U87 mCh-Fl) und die nichttherapeutische MSCs mit GFP und Renilla-Luciferase (MSC GFP-Rluc) infiziert. Die therapeutische Variante des MSCs express TNF-bezogene Apoptose induzierenden Liganden (MSC-TRAIL). TRAIL, ein konstitutiv sezerniert Protein bindet an in der Nähe todesrezeptoren auf Krebs Zellen und Caspase-vermittelten Apoptose18initiiert.
Hier bieten wir ein Protokoll für präklinische bildgestützten GBM chirurgische Resektion und Implantation von MSC ausgesät Gerüste. In Kürze erhalten nackte Mäusen eine Kraniotomie, drei Tage später folgte Stereotaktische orthotopen Injektion von U87 mCh-Fl, den Primärtumor zu etablieren. Die eingepflanzt Tumor wächst für einen Zeitraum von etwa einer Woche. PLA-Gerüste sind mit MSCs 48 h vor der Resektion Operation ausgesät. Der Tumor ist dann unter fluoreszierenden Anleitung reseziert, und das MSC geladen Gerüst ist in den Hohlraum der Resektion implantiert. Tumor-Belastung und Maus überleben werden dann postoperativ mit Biolumineszenz imaging (BLI) verfolgt. Ein Zeitplan für diese Verfahren nachfolgend (Abbildung 1).
Abbildung 1: Timeline Verfahren. Mäuse erhalten zunächst ein kranialen Fenster (Tag 0). Nach einer Erholungszeit von drei Tagen, Tumoren sind implantiert (Tag3) und für ca. eine Woche wachsen. Gerüste sind mit MSCs (Tag 8) zwei Tage vor der Tumor-Resektion und Implantation-Verfahren (Tag 10) ausgesät. Tumorprogression und therapeutische Wirksamkeit werden per Post-Operative imaging danach (Tag 10 +) bewertet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of North Carolina in Chapel Hill genehmigt.
Hinweis: Dieser Vorgang wird durchgeführt an Mäusen mit einem offenen Kraniotomie, das Gehirn verlassen als eine modifizierte Version des Protokolls durch Mostany und Tür-Cailliau19 , wobei das Knochengewebe, das chirurgisch entfernt wird verworfen, zugänglich für Einrichtung und eventuelle Resektion von GBM Tumoren. Nach Kraniotomie sind Tumoren über Stereotaktische Implantation hergestellt, wie im Ozawa und James20beschrieben. Wir implantieren 1 x 105 U87 mCh-Fl Zellen an den folgenden stereotaktischen Koordinaten (in mm von Bregma): (2,5, 0 -0,5).
(1) Zellkultur und Gerüst Vorbereitung
Hinweis: Gerüste sollten 48 h vor der Implantation bei Mäusen vorbereitet werden. Die folgenden Bände sind auf einer Basis pro Gerüst zur Verfügung gestellt. Multiplizieren Sie Mengen Bedarf für zusätzliche Gerüste.
- Schneiden Sie PLA-Gerüste in Resektion Hohlraum-Größe (ca. 2 mm x 2 mm) Stücke. Gerüste können von Hand mit einer Schere oder mit einem Locher für Wiederholbarkeit geschnitten werden.
- Sterilisieren Sie durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol für 15 min, gefolgt von Eintauchen in PBS. Legen Sie Gerüst in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin beim Zellen für die Aussaat vorbereiten.
- Heben Sie kultivierten MSCs mit 0,05 % Trypsin (3-5 mL für ein T75-Fläschchen). Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Stellen Sie sicher, das die Zellen gehoben haben, dann fügen Sie 7-10 mL DMEM in den Kolben, Trypsin zu inaktivieren.
- Eine 15-mL Zentrifugenröhrchen übermitteln Sie Flasche Inhalt. Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer. Pellet-5 x 105 MSCs für jedes Gerüst durch Zentrifugation bei 100 X g für 5 Minuten.
- Aspirieren Sie überstand und Aufschwemmen Sie MSCs in 5 µL DMEM pro 5 x 105 Zellen.
- Bereiten Sie die Gerüste für die Aussaat durch klopfen sie trocken.
- Entfernen Sie ein Gerüst aus DMEM eintauchen mit der Pinzette und legen Sie es vorübergehend auf dem Deckel des 6-Well-Platte. Heben Sie das Gerüst den Deckel, hinterlässt ein Tröpfchen von überschüssigen DMEM.
- Setzen Sie das Gerüst wieder auf den Deckel wieder in einem neuen, trockenen Ort. Wiederholen Sie 3 - 5 Mal, dann legen Sie das teilweise getrocknete Gerüst in eine neue 6-Well-Platte für die Aussaat. Wiederholen Sie für jedes Gerüst.
Hinweis: Ein teilweise getrocknet Gerüst bietet optimale Zelle Aussaat Ergebnisse. Wenn das Gerüst zu nass ist, werden Zellen abrutschen das Gerüst und die well-Platte unten halten. Wenn das Gerüst zu trocken ist, wird der Tropfen nicht auf das gesamte Gerüst, was zu schlechten ersten Zelle Verteilung verteilt.
- Mit einer Pipette, vorsichtig mischen Sie das Fläschchen von Stammzellen, die Aussetzung zu homogenisieren, da einige Zellen nach unten angesiedelt haben können.
- Langsam pipette 2,5 µL frisch gemischt MSC Aufhängung direkt auf dem Schafott, erstellen ein kleines Tröpfchen über die Oberseite des Gerüstes.
- Kanten von jeweils gut 300 µL DMEM hinzufügen. Dies verhindert rasche Verdunstung der Zelle Tropfens. Inkubation bei 37 ° C für 30 min, so dass die Zellen zum Schafott zu befestigen.
- Umdrehen Sie mit der Pinzette vorsichtig die Gerüste in der well-Platte. Samen 2,5 µL frisch gemischt MSC Aussetzung (Dies führt zu insgesamt 5 x 105 Zellen pro Gerüst ausgesät). Inkubation bei 37 ° C für 30 min, so dass die Zellen zum Schafott zu befestigen.
- Decken Sie die Gerüste in DMEM durch Zugabe von 2 mL in jede Vertiefung des 6-Well-Platte. Heben Sie vorsichtig die Gerüste um Medien unter ihnen fließen zu lassen. Inkubation bei 37 ° C für 48 h vor der Implantation Operation in diesem Zustand.
- Überprüfen Sie die Gerüste nach 24 h und ändern oder hinzufügen/Medien, wenn überschüssige Verdampfung oder verfärbte Medien durch pH-Ungleichgewicht beobachtet werden.
(2) Fluoreszenz-geführte Resektion und Gerüst Implantation
Hinweis: Sterilisieren Sie alle Werkzeuge vor der Operation zu initialisieren. Verwalten Sie prophylaktische Analgesie, wie in Ihren institutionellen IACUC Protokoll beschrieben.
- Setzen Sie die stereotaktischen Rahmen auf der Bühne eine Fluoreszenz Stereomikroskop sezieren.
- Die Maus unter inhalativen Isofluran in einer Induktion Kammer zu betäuben. Sobald betäubt, sichern Sie die Maus in der stereotaktischen Rahmen mit kontinuierlichen inhalativen Anästhesie Versorgung über einen Isofluran bugnase Adapter. Pflegen Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen und/oder Sonde.
Hinweis: 4-5 % Isofluran ist geeignet für Induktion und 2-3 % eignet sich für Wartung, aber dies angepasst und für jede Maus überwacht werden muss. - Gelten Sie ophthalmologische Salbe für die Augen, um zu verhindern, Trocknen der Hornhaut. Die Schnitt-Website der Kopfhaut mit einer Reihe von drei Alkohol und drei Betadine Tücher zu sterilisieren.
- Durchführen Sie Zehe Prise reflex-Test auf jede Extremität und bestätigen Sie negative Antwort um angemessene Anesthetization zu gewährleisten. Eine stetige Atemfrequenz bei ca. 55-65 Atemzüge/min zu gewährleisten.
- Mit Pinzette, Kneifen Sie und heben Sie vorsichtig an der Kopfhaut. Machen Sie einen Mittellinie linear rostral-kaudalen Schnitt mit chirurgische Scheren. Die Schnitt-Website mit PBS zu bewässern und Subdermale Fett mit einem Baumwolle Spitze Applikator in einer Kreisbewegung Bürsten zu entfernen. Ordnen Sie die Haut so, dass die vorher festgelegten kraniale Fenster vollständig sichtbar ist.
- Durchstechen Sie sanft die Dura nur innen bis an die Grenzen des kranialen Fensters mit einem 18-G-Nadel. Wiederholen Sie, bis der Schnitt voll das Innere des Fensters zeichnet.
- Entfernen Sie die Dura durch Schälen entfernt mit feinen Pinzette, enthüllt die zugrunde liegenden Parenchym und Tumor.
- Suchen Sie den U87 mCh-Fl Tumor durch Raumbeleuchtung ausschalten und den Stereomikroskop Fluoreszenz-Modus einschalten. Bereiten Sie für Resektion durch das Laden einer PIPETTENSPITZE 1-200 µL in das Ende des Schlauches einer Vakuumpumpe.
- Schalten Sie die Vakuumpumpe. Resezieren Sie den Tumor durch fluoreszierende Gewebe sanft absaugen, bis kein Signal bleibt. Schalten Sie die Vakuumpumpe aus und entsorgen Sie die PIPETTENSPITZE. Schalten Sie die Fluoreszenz aus und das Zimmer, das Licht wieder auf.
Hinweis: Um Blutungen zu kontrollieren, spülen Sie mit kaltem PBS und Auftragen Sie gleichmäßigen Druck mit einem Baumwolle Spitze Applikator. In schwereren Fällen kann die Resektion Hohlraum auch vorübergehend mit einem blutstillende Mittel verpackt werden, solange es entfernt wird, nachdem die Blutung, gefolgt von einem anderen PBS Bewässerung aufgehört hat. - Unmittelbar vor der Implantation Tauchen Sie langsam ein MSC-ausgesät PLA-Gerüst mit PBS-Puffer, unerwünschte Medien und damit verbundenen Komponenten zu entfernen. Implantat-das Gerüst in den Hohlraum der Resektion. Bei Bedarf fügen Sie an Stelle 1 µL Fibrinogen (67-106 mg/mL), gefolgt von 1 µL Thrombin (400-625 U/mL), das Gerüst zu sichern.
- Mit der Dura entfernt und die Knochen-Klappe vom kranialen Fenster bereits verworfen, die Wunde einfach durch das Schließen der Haut und Anbringen von chirurgischen Leim abdichten. Entfernen Sie das Tier aus inhalierte Betäubungsmittel und lassen um auf einer beheizten Fläche zu erholen.
- Einmal ambulant, Rückkehr Maus Käfig. Analgetikum IACUC genehmigt termingerecht zu verwalten. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Maus.
3. postoperative Bildgebung
- Mit der 28-G Insulin Spritze, Spritzen Sie Mäuse mit D-Luciferin (150 mg/kg intraperitoneal).
- Warten Sie 10 Minuten. Dadurch wird das Luciferin im ganzen Körper zirkulieren und reagieren mit der Luciferase exprimierenden Krebszellen im Gehirn zu Spitzenzeiten Ausdruck zu erhalten.
- Isoflurane Narkose (wie zuvor erwähnt) Bild Mäuse in einer Biolumineszenz imaging-System (BLI) um die Tumoren zu visualisieren. Variieren Sie Belichtungszeiten als benötigte (Sekunden bis Minuten) je nach Größe des Tumors.
- Wiederholen Sie bildgebendes Verfahren Bedarf Tumor Wachstum Kinetik zu bestimmen. Weiterhin Tiergesundheit überwachen.
Hinweis: Die therapeutische MSCs bekunden konstitutiv TRAIL, Krebszellen zu töten und insgesamt Tumorwachstum unterdrücken. Alle 2-5 Tage Imaging bietet ausreichenden Häufigkeit für diesen Zweck. - Bei vorgegebenen Endpunkte des IACUC-Protokolls erfüllt sind, Mäuse durch Transcardial Perfusion zu Opfern und Gewebe für die Analyse zu sammeln.
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Representative Results
U87 Tumorzellen wurden entwickelt, um ausdrückliche mCherry und Firefly Luciferase (U87 mCh-Fl) vor der Injektion und zur bildgestützten Resektion und Biolumineszenz tracking (Abbildung 2A-C). Stammzellen wurden ebenso entwickelt mit diagnostischen GFP-Rluc (MSC-GFP) oder GLP-THERAPIEVERSUCH (MSC-TRAIL) und ausgesät auf die PLA-Gerüste, Befestigung und Verbreitung (Abb. 2D-F) zu bestätigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder von fluoreszierenden Krebszellen und MSCs ausgesät auf PLA. A-C) Phase, fluoreszierende und kombinierten Bilder bzw. Show U87 Krebszellen mit Lentivirale Konstrukte zu express mCh-Fl-Markern entwickelt. D-F) Entsprechende Bilder von Stammzellen entwickelt, GFP-Rl auszudrücken oder therapeutische GFP-TRAIL ausgesät auf das PLA-Gerüst-Material. Skalieren von Balken = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Intraoperative Bilder sind unten aufgeführt, um Teile des chirurgischen Eingriffs für Tumor-Resektion und Gerüst Implantation (Abbildung 3). Das Tier ist zunächst betäubt und in der stereotaktischen Instrument (Abbildung 3A) ausgerichtet. Die Haut wird geöffnet, und die Dura ist wieder offen. Der Tumor reseziert (Abb. 3 b), und wenn unter untersucht weißes Licht wird vollständig entfernt werden. Jedoch fluoreszierende Bilder des Tumors vor (Abbildung 3) und nach (Abbildung 3D) Resektion anzugeben, während der Großteil der Tumor entfernt wurde, bleibt eine Restmenge. Dieses Phänomen ähnelt klinische Fälle, wobei Chirurgen nicht in der Lage sind, Tumorzellen zu entfernen, die schnell weg von der Primärmasse und in inoperablen Bereiche im Gehirn zu migrieren. Wandernde therapeutische MSCs in Richtung residual Tumor Herde bleiben, die nach der chirurgischen Resektion. MSCs in den Hohlraum der Resektion zu liefern, die MSCs sind zuerst auf PLA entkernt und dann befindet sich das Gerüst Konstrukt in den Hohlraum der Resektion. Vorhandensein von MSCs auf dem Schafott bestätigt nach der Implantation von eindringmittel imaging GFP Signal (Abbildung 3E). Ex-Vivo ganze Gehirn Bilder zeigen Gerüst Abmessungen im Verhältnis zu den Resektion Hohlraum (Abbildung 3F-H). Das Gerüst erscheint wesentlich größer, wenn flach gelegt, aber kann während der Implantation in die Gestalt der Resektion Kavität geformt werden. Durch die Beschichtung des gesamten Hohlraums, ist die Distanz, die therapeutische MSCs migrieren um Tumor Herde zu erreichen müssen minimiert. Nach der Operation ist BLI zur Tumor-Wachstum im Laufe der Zeit zu verfolgen und Gerüst geliefert MSC-TRAIL Wirksamkeit zu bestimmen.
Abbildung 3: Repräsentative intraoperative und postoperative Bilder. A) Intraoperative Serie zeigt Maus vor dem Schnitt. B) Incised Maus mit kranialen Fenster enthüllt Tumor Masse. ( C) Hellfeld und fluoreszierende Overlay-Bild zeigt die Lage des Tumors. D) Post-chirurgische Resektion Hohlraum mit Rest-Tumor-Schwerpunkten. E) implantiert PLA Gerüst ausgesät mit MSC-TRAIL. F) Post-Mortem Gehirn Gewebe mit Gerüst überlagert. G) fluoreszierende Overlay GFP-TRAIL Zellen hervorheben. H) Magnified Version von G. Maßstabsleisten = 5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Chirurgie kann in der Regel innerhalb von 30 min per Mausklick, abgeschlossen werden, angesichts der Tatsache, dass die folgenden Punkte berücksichtigt werden, maximale Präzision und zeitraubende Fallstricke zu vermeiden. Zunächst sicherstellen Sie, dass die Maus in der stereotaktischen Instrument vor Beginn des Verfahrens richtig positioniert ist. Unerwünschte Kopfbewegungen schränkt chirurgischer Genauigkeit der Kraniotomie, Lage des Tumors Implantation und Grad der Tumor-Resektion. Entfernen Sie vor der Resektion vollständig Teil der Deckung des Tumors Dura. Die harte, faserige Dura härtet wie es bei Aspiration entwässert. Wenn nicht vollständig entfernt, kann die gehärtete Dura Absauganlage Tipp Mobilität zu begrenzen und verhindern komplette Tumor-Resektion. Während der Resektion sind Blutgefäße oft versehentlich zusammen mit dem Tumor verursacht erhebliche Blutungen reseziert. Überschüssige Blut verringert sich die Intensität der das Fluoreszenzsignal und verdeckt den Tumor. Erhalt der Tumor Sichtbarkeit während Resektion sorgt für angemessene Ausmaß der Resektion und die Entfernung von gesundem Gewebe und übermäßige Blutungen begrenzt. Für kleinere blutet bewässern Sie das beschädigte Schiff mit kalten Kochsalzlösung zu und üben Sie sanften Druck mit einem Baumwolle Spitze Applikator. Wenn die Blutung anhält, packen Sie eine blutstillende Mittel in den Hohlraum für 2 – 3 min. und dann mit einer Pinzette entfernen. Spülen Sie mit PBS physiologischen pH-Wert vor der Implantation der Zelle ausgesät Gerüst danach wiederherstellen. Resektion ist beendet und die Blutung aufgehört hat, ist der letzte Fallstrick unzureichend Hautwunden Schließung. Dies ist meist durch überschüssige Feuchtigkeit (PBS oder Blut), die verhindert, dass die chirurgische Leim kleben die eingeschnittene Haut verursacht. Vermeiden Sie dies durch sanft trocknen die Haut mit einem Baumwolle Spitze Applikator vor dem Auftragen des Klebers. Es ist auch möglich, versehentlich die Haut direkt an den Schädel zu kleben, wenn die Wunde Lücke nicht zuerst mit der Pinzette vor dem Kleben in einer geschlossenen Position gehalten wird.
Mit diesen Überlegungen im Auge produziert das obige Protokoll konsistente und zuverlässige GBM chirurgischen Resektionen, die Standardbehandlung für präzise in Vivo Tests der aufstrebenden Zell- und niedermolekularer Therapien zu imitieren. Dennoch können mehrere Komponenten geändert werden, um experimentelle Bedürfnisse dienen. Zum Beispiel Tumor-Eigenschaften wie Größe, Lage und Ausmaß der Invasion durch Änderung der anfängliche Anzahl und Tiefe der injizierten Zellen, die Zeit zwischen Tumor-Einrichtung und Resektion oder durch den Wechsel der Tumor-Zell-Linie selbst einstellbar. Darüber hinaus erfolgt dieser Studie in den Athymic nackten Mäusen dessen Beeinträchtigung des Immunsystems System menschliche Zellen toleriert. Immunsystem zuständigen Mäuse möglicherweise besser geeignet für Studien mit Mauszellen.
Im Vergleich zu einem geschlossenen System (d.h., der Knochen oder ein Deckglas ist setzen Sie wieder ein), die offenen Kraniotomie durchgeführt in diesem Protokoll reduziert intrakraniellen Druck (ICP). Erhöhten ICP ist verantwortlich für das Auftreten von Symptomen wie Krampfanfälle, erleben Mäuse eine künstliche Verlängerung des Überlebens in diesem Modell. Während die Auswirkungen wegen der Verzögerung für Behandlung und Eindämmung der Gruppen minimiert ist, könnte zukünftige Modelle wieder schließen die Knochen-Klappe für die Wiederherstellung von ICP und die Rolle in der Zelltherapie für GBM zu bestimmen.
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Disclosures
DRS. Sheets, Bagó und Hingtgen verfügen über Eigenkapital in Falcon-Therapeutika, die Aspekte der Stammzellforschung und Gerüst-Technologie von UNC Chapel Hill lizenziert hat.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen redaktionelle Beiträge von Dr. Kathryn Pietrosimone. PLA-Gerüste wurden von Dr. Elizabeth Loboa Lab an der North Carolina State University hergestellt. Diese Arbeit wurde von der UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center der University Cancer Research Fund und die UNC-translationale und Clinical Sciences Institute (KL2TR001109, UL1TR001111) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Just for mouse stereotaxic instrument | Stoelting | 51730 | Maintains steady head positioning during surgery |
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Leica | M165 FC | Allows real-time imaging of tumor during resection |
| Motorized integrated stereotaxic injector (ISI) system | Stoelting | 53315 | Allows precise tumor cell injection volume and rate |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469 | Sugical glue to close skin wound |
| Artificial tears | Akorn | 664268 | Prevents eyes from drying during surgery |
| Webcol alcohol preps | Covidien | 6818 | Sterilize incision site |
| Betadine surgical scrub | Purdue Fredick Company | 6761815117 | Sterilize incision site |
| Cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | Surgery tool |
| E-vac aspirating system | Argos | EV310 | Vacuum pump used to resect tumor |
| Fibrinogen and thrombin extracted from as-received TISSEEL | Baxter | To temporarily secure the scaffold in the resection cavity | |
| IVIS Kinetic in vivo optical imaging system | Caliper Life Science | Bioluminescent Imager | |
| D-Luciferin potassium salt | PerkinElmer | 122799 | In vivo imaging agent |
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