Summary
क्रोमेटिन लूप जीन विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; हालांकि, वहां कोई तकनीकी प्रगति कि क्रोमेटिन छोरों के चयनात्मक और प्रतिवर्ती संशोधन के लिए अनुमति दी गई है । यहाँ हम क्रोमेटिन पाश पुनः के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली का वर्णन संगठन CRISPR का उपयोग-dCas9 (CLOuD9), चुनिंदा और reversibly लक्षित loci पर जीन अभिव्यक्ति का नियमन करने के लिए प्रदर्शन किया.
Abstract
हाल के अध्ययनों से स्पष्ट रूप से पता चला है कि लंबी दूरी की, तीन आयामी क्रोमेटिन पाश बातचीत जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लेकिन क्या looping के लिए जिंमेदार है या जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का परिणाम अभी भी है अज्ञात. हाल ही में जब तक, कैसे क्रोमेटिन looping जीन गतिविधि और सेलुलर समारोह के विनियमन को प्रभावित करता है अपेक्षाकृत अस्पष्ट है, और इन संरचनाओं में हेरफेर करने के लिए मौजूदा तरीकों में सीमाओं इन बातचीत की गहराई से अंवेषण में रोका । इस अनिश्चितता को हल करने के लिए, हम चुनिंदा और प्रतिवर्ती क्रोमेटिन पाश पुनः संगठन CRISPR-dCas9 (CLOuD9) का उपयोग करने के लिए एक विधि इंजीनियर । CLOuD9 प्रणाली के गतिशीलता को CLOuD9 construction के सफल स्थानीयकरण द्वारा प्रदर्शन किया गया है जीनोमिक loci को लक्षित स्थानीय क्रोमेटिन अनुरूपता । महत्वपूर्ण बात, प्रेरित संपर्क रिवर्स और अंतर्जात क्रोमेटिन अनुरूप बहाल करने की क्षमता भी पुष्टि की गई है । इस पद्धति के साथ जीन अभिव्यक्ति का मॉडुलन सेलुलर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता स्थापित करता है और स्थिर de नोवो क्रोमेटिन छोरों कि स्पष्ट रूप से जीन को प्रभावित बनाने में इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों के लिए महान क्षमता को रेखांकित करता है कैंसर और विकास के संदर्भों में अभिव्यक्ति.
Introduction
नाभिक में क्रोमेटिन तह और जीनोम के विशिष्ट संगठन के बीच संबंध हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण ब्याज की हुई है, क्योंकि यह बारीकी से जीन1,2अभिव्यक्ति के साथ जुड़े होना दिखाया गया है । जबकि जीन गतिविधि और क्रोमेटिन संरचना के मॉडुलन के बीच सटीक संबंध स्पष्ट नहीं रहता है, यह कल्पना की गई है कि गतिशील तीन आयामी क्रोमेटिन संगठन के एक परिणाम के रूप में गुणसूत्र संपर्कों के बीच बातचीत एक सेवा जीन विनियामक समारोह3. दरअसल, इस तरह के एक प्रभाव है अच्छी तरह से मानव ग्लोबिन जीन लोकस, जहां लोकस नियंत्रण क्षेत्र (LCR) में प्रदर्शन किया गया है एक विकास विशेष तरीके से दो क्षेत्रों के बीच एक ग्लोबिन पाश बनाने के द्वारा क्रोमेटिन जीन की गतिविधि को नियंत्रित4। हालांकि, दोनों इस और अंय क्षेत्रों में, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या क्रोमेटिन looping एक कारण है या जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का परिणाम है ।
अब तक, इस घटना का अध्ययन करने में चुनौतियां अनसुलझी रह गई । उदाहरण के लिए, क्रोमेटिन उत्प्रेरण में अंय प्रयास रैखिक डीएनए अनुक्रम या जटिल विशिष्ट तत्वों पर पृष्ठभूमि ज्ञान के एक बहुतायत की आवश्यकता होती है प्रक्रियाओं को संशोधित करने में शामिल छोरों5,6, 7,8. साथ ही, जबकि पिछले काम का सुझाव दिया है कि क्रोमेटिन छोरों एक विशिष्ट और प्रतिबंधित संदर्भ7,8में जीन अभिव्यक्ति ड्राइव, स्तर जिस पर क्रोमेटिन looping को प्रभावित करता है प्रतिलेखन दुनिया भर में अनिश्चित है. हालांकि जीन की अभिव्यक्ति पर लंबी दूरी के छोरों के प्रभाव में रुचि हाल के वर्षों में लगातार हो गया है, की स्थापना और क्रोमेटिन संपर्कों को बनाए रखने के बारे में अनुत्तरित सवाल जीन गतिविधि को बदलने के लिए जारी रहती है ।
तकनीक है कि हम इंजीनियर है nuclease कमी संकुल नियमित रूप से अंतराल लघु palindromic दोहराता है (CRISPR)-CRISPR-एसोसिएटेड प्रोटीन 9 (dCas9), के लिए अनुमति देने के लिए व्यापक रूप से लागू किसी भी जीनोमिक loci9के लक्ष्यीकरण । इस प्रौद्योगिकी जटिल रैखिक डीएनए अनुक्रम के संशोधनों से संबंधित मुद्दों को समाप्त और विशेष looping घटकों के महत्वपूर्ण पूर्व ज्ञान के बिना सुलभ है । सबसे विशेष रूप से, उपकरण सार्वभौमिक और मोटे तौर पर क्रोमेटिन के विकास में मांयता प्राप्त छोरों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैंसर के रूप में रोगों की एक किस्म में लागू है । CLOuD9 की शक्ति को प्रभावी ढंग से जीन अभिव्यक्ति का नियमन करने के लिए छोरों की संरचना फेरबदल reversibly द्वारा प्रदर्शन किया है.
Protocol
1. gRNA डिजाइन
- गाइड RNAs10डिजाइन करने के लिए एक मानक gRNA डिजाइन उपकरण का चयन करें । पहले से विकसित CLOuD9 के पूरक जोड़े का प्रयोग करें9 (यानी, कम से कम 1 एस aureus (CSA) और 1 एस. pyogenes (CSP) का निर्माण) प्रत्येक प्रयोग के लिए ।
- चयनित ऑनलाइन डिजाइन उपकरण के भीतर, Protospacer सन्निकट आकृति (पाम) अनुक्रम का उपयोग करें "NGG" CSP और पाम अनुक्रम के लिए 20 बीपी की एक गाइड की लंबाई के साथ "NNGRRT" CSA के लिए 21 की एक गाइड की लंबाई के साथ ।
- एक काम गाइड प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम करने के लिए दोनों किस्में पर विशिष्टता स्कोर और डिजाइन गाइड के आधार पर गाइड चुनें ।
- एक oligo निर्माता से गाइड प्रति 2 oligonucleotides आदेश: आगे oligo के लिए, जोड़ें "caccg" गाइड अनुक्रम के 5 ' अंत करने के लिए, और रिवर्स oligo के लिए, जोड़ें "aaac" 5 अंत करने के लिए और "c" आदेश देने से पहले 3 ' अंत करने के लिए.
- शुरू में, डिजाइन 3-5 gRNAs ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए, एक 250-1000 बीपी क्षेत्र में फैले । gRNA लक्ष्यीकरण दक्षता का आकलन निम्नानुसार करें:
- क्लोन एक सक्रिय Cas9 प्लाज्मिड में gRNAs की पहचान (चरण 3 देखें) और 293T कोशिकाओं में क्षणिक transfect (4 कदम देखें)11।
- Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन-streptomycin (पेन strep), तो फसल और निकालने जीनोमिक डीएनए12के साथ 2-3 d के लिए सेल बढ़ाएँ.
- पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा लक्षित क्षेत्रों बढ़ाना । एक १.५% agarose जेल पर उत्पादों को चलाने और उपयुक्त बैंड शुद्ध ।
- एक T7 endonuclease परख प्रदर्शन के रूप में Guschin, एट अलमें वर्णित है । प्रोटोकॉल13,14.
नोट: कुशल गाइड उन लक्ष्य साइट पर डीएनए में कटौती निर्धारित कर रहे हैं ।
2. सेल संस्कृति
- एक स्वस्थ और सक्रिय रूप से विभाजित राज्य में कोशिकाओं को बनाए रखने ।
- K562s के लिए, रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) में संस्कृति 10% FBS और 1% कलम strep के साथ १६४० मीडिया ।
- एक 25 सेमी2 खिचड़ी भाषा के रखरखाव के लिए गर्दन कुप्पी में K562s बढ़ने और प्रति मिलीलीटर ४००,००० कोशिकाओं के लिए सेल घनत्व समायोजित प्रत्येक दिन ।
- K562s के बाद CLOuD9 के साथ transduced किया गया है, 2 µ g/ml puromycin और १०० µ g/ml hygromycin को मेंटेनेंस मीडिया में जोड़ें ।
- 293Ts के लिए, Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM) में कल्चर 10% FBS और 1% पेन strep के साथ ।
- 10 सेमी2 प्लेट में 293Ts बढ़ने और विभाजन जब धाराप्रवाह ।
- K562s के लिए, रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) में संस्कृति 10% FBS और 1% कलम strep के साथ १६४० मीडिया ।
3. प्लाज्मिड वडा और gRNA लन15
नोट: प्लाज्मिड नक्शे परिशिष्ट में उपलब्ध है और उदाहरण प्रयोगों में उपयोग प्राइमरों अनुपूरक तालिका 1में उपलब्ध हैं ।
- lentiviral CRISPR प्लाज्मिड के 5 µ g को µ के 3 BsmBI l के साथ मिक्स करें, क्षारीय µ के 3 फॉस्फेट l, 10x बफर के 6 µ l, और हौसले से तैयार १०० mM µ के ०.६ डीटीटी l ddH2हे और पचाने के लिए 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर और प्लाज्मिड dephosphorylate के साथ ६० µ l के लिए कुल मात्रा लाओ ।
- जेल ddH2ओ में पच प्लाज्मिड और elute को शुद्ध करें ।
- 1 µ l को १०० µ मीटर पर 1 µ एल के साथ मिलाकर प्रत्येक के एल 4 बंधाव बफर, ६.५ µ एल के ddH2ओ, और ०.५ µ एल टी-4 PNK, 10 µ एल कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए । 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन, तो 5 मिनट के लिए ९५ ° c, तो नीचे 25 ° c के लिए रैंप पर 5 ° c/
नोट: यह गाइड की जोड़ी ऐनी होगा । - पतला annealed गाइड (३.३ चरण से) 1:200 में ddH2हे ।
- मिश्रण 1 µ l के साथ ३.२ कदम से पच प्लाज्मिड के ०.५ µ l से पतला ligated गाइड के चरण ३.४, २.५ µ l के 2x बफर, 1 µ l के ddH2हे, और ०.५ µ l के Ligase, एक ५.५ µ l कुल प्रतिक्रिया करने के लिए. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इस मशीन BsmBI पच प्लाज्मिड के लिए गाइड ligate करने के लिए ।
- Stbl3 बैक्टीरिया में ३.५ कदम से नव ligated प्लाज्मिड रूपांतरण और किसी भी प्लाज्मिड तैयारी विधि का उपयोग बढ़ाना ।
4. Lentivirus उत्पादन
- ७५०,००० 293T कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक छह अच्छी थाली के लिए एक hemocytometer का उपयोग करके गिनती और DMEM में उंहें बीज के साथ 10% FBS और 1% कलम strep । प्रत्येक निर्माण के लिए एक अच्छी तरह से प्रयोग करें ।
- 24 एच बोने के बाद, 10% FBS के साथ ताजा एंटीबायोटिक मुक्त DMEM के लिए मीडिया बदल जाते हैं ।
- एक ट्यूब में, 11 µ एल की लिपिड आधारित अभिकर्मक रिएजेंट के साथ १५० µ l के OptiMEM माध्यम से, प्रति प्रतिक्रिया11पतला.
- एक अलग ट्यूब में, पतला 2 µ जी का CLOuD9 lentiviral वेक्टर प्लाज्मिड स्टेप ३.६ से, ०.३५ µ जी का pMDLg/pRRE का, 1 µ जी का pRSV-फिरना, और ०.६५ µ जी का १५० pMD2 g के साथ µ मीडियम का, प्रति प्रतिक्रिया11.
- प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, पतला लिपिड के लिए पतला lentiviral प्लाज्मिड मिश्रण जोड़ने के लिए एक 1:1 अनुपात में अभिकर्मक एजेंट आधारित है, और 5 मिनट11के लिए मशीन ।
- चरण ४.२ से एंटीबायोटिक मुक्त 293T कोशिकाओं के संबंधित कुओं में ४.५ कदम से प्रत्येक मिश्रित परिसर के पूरे खंड जोड़ें ।
- ४८ ज बाद में, एक ताजा ट्यूब में pipetting द्वारा वायरल उत्पादन मीडिया इकट्ठा और 5 मिनट के लिए ३०० एक्स जी में नीचे स्पिन । केंद्रापसारक के बाद, एक ताजा ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरित करने के लिए अवशिष्ट कोशिका मलबे को हटाने ।
- लक्षित कोशिकाओं के transduction के लिए तुरंत वायरल उत्पादन मीडिया का उपयोग करें या भविष्य के उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज ।
5. कोशिकाओं की Lentivirus Transduction
- प्रत्येक वायरल ब्याज के निर्माण के २५० µ एल जोड़ें (पूरक CLOuD9 plasmids के शामिल) के लिए एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब CLOuD9 आवेदन के लिए ८०,००० कोशिकाओं से युक्त.
- प्रत्येक शंकु में मीडिया की कुल मात्रा एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया के साथ 1 मिलीलीटर लाने के लिए, और 1-8 µ g/एमएल के बीच की एक अंतिम एकाग्रता के लिए polybrene जोड़ने (उपयोग किए गए कक्ष प्रकार द्वारा सहन polybrene की अधिकतम एकाग्रता की आवश्यकता होगी प्रयोग किया जाता) ।
- कक्ष के तापमान पर 30 मिनट के लिए ८०० एक्स जी में स्पिन कोशिकाओं, तो वायरल supernatant को हटाने के बिना pipetting द्वारा resuspend । पूरे सेल सस्पेंशन को एक सेल कल्चर प्लेट में ले जाएं ।
- 24 एच के बाद transduction, कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर नीचे स्पिन कोशिकाओं ।
- महाप्राण वायरल supernatant और नियमित सेल कल्चर मीडिया में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड ।
- अगले दिन, 293T कोशिकाओं के लिए puromycin (1 µ g/ml) और hygromycin (25 µ g/ml कोशिकाओं के लिए) सेल कल्चर मीडियम को दुगना 293T कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए जोड़ें । प्रयोग शुरू करने से पहले किसी दिए गए कक्ष प्रकार के लिए puromycin और hygromycin की उचित सांद्रता का निर्धारण करें ।
- किसी भी बहाव प्रयोगों से पहले चयन मीडिया में कम से 3 d के लिए कोशिकाओं रखें और सभी प्रयोगों की अवधि के लिए चयन मीडिया में बनाए रखने.
6. सेल Dimerization और बाहर धोने
- dimerize चयनित और CLOuD9 कोशिकाओं को transduced करने के लिए सेल संस्कृति के लिए नियंत्रण के लिए 1 मिमी Abscisic एसिड (आबा) या dimethyl sulfoxide (DMSO) के एक समकक्ष मात्रा जोड़ें. प्राप्ति की तारीख के 6 महीने के भीतर आबा का उपयोग करें, ठंडा रखें, और इसे उपयोग में प्रकाश से बचाने के । 2 मिमी आबा यदि जरूरत हो तो उपयोग किया जा सकता है ।
- प्रयोग की अवधि के लिए ताजा आबा (या नियंत्रण के लिए DMSO) प्रदान करने के लिए दैनिक मीडिया बदलें ।
नोट: dimerization की लंबाई पर कोई सीमा अभी तक स्वीकार्य नहीं किया गया है ।
- प्रयोग की अवधि के लिए ताजा आबा (या नियंत्रण के लिए DMSO) प्रदान करने के लिए दैनिक मीडिया बदलें ।
- पर्याप्त फॉस्फेट के साथ आबा और वाशिंग सेल युक्त मीडिया को हटाने के माध्यम से रिवर्स dimerization, दो बार प्लेट की सतह को कवर करने के लिए खारा (पंजाब). इसके बाद, एक अन-dimerized राज्य को बनाए रखने के लिए आबा-फ्री मीडिया में कल्चरल सेल ।
7. Immunoprecipitation और सह-immunoprecipitations
नोट: सभी बफ़र्स ताजा और उपयोग करने के लिए तुरंत पहले करें ।
- dimerization प्रयोगों के पूरा होने के बाद, इकट्ठा और कोशिकाओं नीचे स्पिन, तो महाप्राण supernatant.
- कक्षों को Crosslink और फ़्रीज़ करें
- ताजा सामग्री का उपयोग कर कमरे के तापमान पर पंजाब में 1% formaldehyde का एक ताजा स्टॉक बनाओ । हर २,०००,००० कोशिकाओं के लिए, धीरे ठीक 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1% formaldehyde के 1 मिलीलीटर के साथ resuspend, जबकि घूर्णन ।
नोट: १०,०००,००० कक्षों से कम crosslinking के लिए 10 मिलीलीटर की ंयूनतम मात्रा का उपयोग करें । - ०.१२५ मीटर के अंतिम एकाग्रता के लिए glycine के अलावा के साथ बुझाने crosslinking, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन द्वारा पीछा किया, जबकि घूर्णन.
- कोशिकाओं नीचे स्पिन और 1-2x बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ धो लो । सेल छर्रों फिर तरल नाइट्रोजन में जमे हुए स्नैप हो सकता है और पर संग्रहित-८० डिग्री सेल्सियस या तुरंत इस्तेमाल किया ।
नोट: हीट रिवर्स formaldehyde crosslinks होगा । यदि लपके, तो कोशिकाओं को सीधे-८० ° c स्नैप फ्रीज के बिना संग्रहित किया जा सकता है ।
- ताजा सामग्री का उपयोग कर कमरे के तापमान पर पंजाब में 1% formaldehyde का एक ताजा स्टॉक बनाओ । हर २,०००,००० कोशिकाओं के लिए, धीरे ठीक 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1% formaldehyde के 1 मिलीलीटर के साथ resuspend, जबकि घूर्णन ।
- एंटीबॉडी/मनका संयुग्मी तैयार
नोट: चुना एंटीबॉडी के लिए अनुकूलन शर्तों (यानी, सेल lysis और प्रदर्शन आईपी के लिए अलग lysis बफ़र्स परीक्षण) सार्थक हो सकता है । दो आम बफ़र्स, Farnham lysis बफ़र और संशोधित RIPA बफ़र, IP दक्षता और sonication दक्षता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है । सभी बफर रचनाओं सामग्री की तालिकामें पाया जा सकता है । साथ ही, ध्यान रखें कि क्रोमेटिन sonication पूरा करने के लिए कई घंटे लग सकते हैं ।- चुने हुए एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त के रूप में संक्षेप में भंवर द्वारा मोतियों को resuspend ।
- एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए प्रयोग के लिए मोतियों की एक उचित राशि हस्तांतरण । एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, एंटीबॉडी के हर 1 µ g के लिए मोतियों की 20 µ l का उपयोग करें । एंटीबॉडी अभी तक जोड़ नहीं है ।
नोट: एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में कुल lysate के 1 मिलीग्राम के लिए मोतियों की २०० µ एल के साथ 10 µ जी एंटीबॉडी का प्रयोग करें, जब तक यह पता चला है कि एंटीबॉडी अधिक या कम कुशल इस से मतलब होता है । कम बहुतायत प्रोटीन के लिए, इस अनुपात को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । - यदि Farnham lysis बफर का प्रयोग, आईपी कमजोर पड़ने बफर में 3x धो लो । यदि RIPA lysis बफर का प्रयोग, RIPA lysis बफर में 3x धो लो ।
- चरण 7.3.3 (या तो आईपी कमजोर पड़ने या RIPA बफर) है कि > 1x और < 5x प्रारंभिक मात्रा से ही बफर के एक अंतिम मात्रा में मोतियों को फिर से स्थगित । यानी १०० µ एल प्रारंभिक मनका मात्रा के लिए, १०० और ५०० µ एल अंतिम निलंबन मात्रा के बीच का उपयोग करें ।
- एक उचित एकाग्रता पर अब धोया मोतियों को एंटीबॉडी जोड़ें । के लिए एक अच्छा हा या एंटीबॉडी फ्लैग करें आईपी CLOuD9 constructs करने के लिए, उपयोग एंटीबॉडी पर 1:50 (µ ग्राम प्रोटीन: µ ग्राम प्रोटीन lysate) और 8 + एच और रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस, जबकि घूर्णन के बीच मशीन । वैकल्पिक रूप से, कमरे के तापमान पर 2-4 घंटे के लिए मशीन ।
- मोतियों से supernatant निकालें और त्यागें.
- धोने बफर के साथ 3x मनका धो लें ।
- एंटीबॉडी (आईपी कमजोर पड़ने या RIPA बफर) के साथ रात भर की मशीन के लिए उपयोग बफर की एक न्यूनतम मात्रा में resuspend । जब तक प्रोटीन lysate के साथ संयुक्त ठंडा रखें ।
- Sonicate क्रोमेटिन
- 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेल छर्रों के लिए सूजन बफर के अलावा के साथ पहली लाइसे कोशिकाओं, हर कुछ मिनट के लिए बसने को रोकने के लिए कोशिकाओं को फ़्लिक ।
नोट: सामान्यतया, ५०० µ l की सूजन बफ़र २५,०००,००० कक्षों के लिए जोड़ा गया है और वहाँ से स्केल कर दिया है, लेकिन < 25 लाख कक्षों के लिए ५०० से कम µ l बफ़र का उपयोग न करें । - Dounce दोनों दक्षिणावर्त और उल्टी, 13x प्रत्येक ।
- फिर 4 ° c पर नाभिक नीचे स्पिन 5 मिनट के लिए १,५०० x g. महाप्राण supernatant पूरी तरह से और शेष supernatant को हटाने के लिए दोहराने के लिए, तो मिलीग्राम में सेल गोली वजन ।
- नाभिक lysis बफर (Farnham बफर या RIPA बफर, इसके बाद के संस्करण, एक का चयन करने के लिए) को छेड़ने वाला अवरोधक जोड़ें ।
- (उदाहरण के लिए, ०.१०० g गोली करने के लिए नाभिक lysis बफ़र की 1 मिलीलीटर जोड़ें) पुनर्स्थगित करने के लिए नाभिक lysis बफ़र की 10x राशि जोड़ें । संक्षेप में भंवर और बर्फ पर 10 मिनट के लिए लाइसे ।
नोट: sonication ट्यूब के आकार को ध्यान में रखें । आदर्श मात्रा अक्सर है < 1 मिलीलीटर, तो नमूने की आवश्यकता हो सकती है अगर छर्रों बहुत बड़ी है विभाजित करने के लिए ।- सह के लिए, sonicate नाभिक संक्षेप में solubilize सामग्री और बुझाने एसडीएस एक स्तर है कि कमजोर पड़ने बफर के 2-3 संस्करणों के साथ immunoprecipitation परमिट के लिए, तो कदम 7.4.6 के लिए आगे बढ़ना । बहुत ही संवेदनशील एंटीबॉडी के लिए, और अधिक कमजोर पड़ने बफर जोड़ने के लिए आगे एसडीएस की एकाग्रता को कम करने ।
नोट: lysate साफ़ करता है जब sonication रोकें; यह एक अपारदर्शी/पारदर्शी सफेद से पूरी तरह से पारदर्शी करने के लिए बदल जाएगा । संभव के रूप में ठंड के रूप में नमूने रखें और sonicate पर नहीं है । - चिप के लिए, अच्छी तरह से sonicate डीएनए 150-1000 बीपी डीएनए टुकड़े प्राप्त करने के लिए, तो कदम 7.4.6 के लिए आगे बढ़ना ।
- सह के लिए, sonicate नाभिक संक्षेप में solubilize सामग्री और बुझाने एसडीएस एक स्तर है कि कमजोर पड़ने बफर के 2-3 संस्करणों के साथ immunoprecipitation परमिट के लिए, तो कदम 7.4.6 के लिए आगे बढ़ना । बहुत ही संवेदनशील एंटीबॉडी के लिए, और अधिक कमजोर पड़ने बफर जोड़ने के लिए आगे एसडीएस की एकाग्रता को कम करने ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से अघुलनशील सामग्री बाहर स्पिन ।
- स्थानांतरण घुलनशील सामग्री एक ताजा ट्यूब करने के लिए ।
- के लिए सह आईपी, उपाय प्रोटीन की एकाग्रता और कदम ७.५ में pulldown के लिए आगे बढ़ना ।
- चिप के लिए, द्वाा lysate के 10 µ l aliquot को निकालें और ४० µ l IP रेफरेंस बफ़र और 6 µ l 5 M NaCl को उस कुल के लिए 56ul में जोड़ें । ९५ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए उबाल लें, 3 एम NaOAc पीएच 5 के 5-10 µ एल जोड़ें, और एक पीसीआर शुद्धि कॉलम पर साफ । २६० एनएम पर अवशोषक को मापने और नमूनों के पार मानकीकरण द्वारा डीएनए की एकाग्रता को मापने । उसके बाद चरण ७.५ में pulldown के लिए आगे बढ़ें ।
नोट: अतिरिक्त lysate-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए स्नैप किया जा सकता है और एक बाद में समय पर इस्तेमाल किया, लेकिन सबसे अच्छा परिणाम ताजा lysate से प्राप्त कर रहे हैं । यदि ठंड, फ्रीज/गल lysate एक बार से अधिक नहीं है ।
- 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेल छर्रों के लिए सूजन बफर के अलावा के साथ पहली लाइसे कोशिकाओं, हर कुछ मिनट के लिए बसने को रोकने के लिए कोशिकाओं को फ़्लिक ।
- Pulldown
- एक ताजा ट्यूब करने के लिए प्रोटीन lysate की एक उचित राशि हस्तांतरण । यदि Farnham lysis बफर का उपयोग कर, आईपी कमजोर पड़ने बफर के २.१ संस्करणों में पतला (ऊपर) ।
- इनपुट नियंत्रण के लिए supernatant के १०० µ एल अलग सेट, और अगले दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- मनका/एंटीबॉडी संयुग्मी से कदम 7.3.8 अब नमूने के लिए जोड़ें ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात नमूने घुमाएं और सुनिश्चित करें कि १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में तरल आंदोलन के लिए पर्याप्त मात्रा में है ।
- धो और Elute
- रात भर रोटेशन के बाद, supernatant को बाध्यकारी अंश के रूप में सहेजें । फिर धो मोती 3-5x आईपी कमजोर पड़ने बफर में ।
- अवरोधकों के बिना, कमरे के तापमान पर आईपी रेफरेंस बफर तैयार करें ।
- ५० µ एल रेफरेंस के साथ Elute परिसर एक भंवर पर हिल के लिए ६७ ° c 15 min. Transfer एक नई ट्यूब के लिए रेफरेंस और एक और ५० µ एल के साथ दोहराने के लिए उन्हें एक कुल १०० µ एल रेफरेंस के लिए दोनों गठबंधन ।
नोट: यदि इस रेफरेंस प्रक्रिया से बहुत अधिक पृष्ठभूमि है, गर्मी को कम किया जा सकता है या मिलाने के दौरान समाप्त/ यह आम तौर पर लक्ष्य प्रोटीन की उपज कम कर देता है लेकिन काफी पृष्ठभूमि कम करता है ।
- > 4 एच के लिए ६७ डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग से रिवर्स crosslinks
नोट: यह सख्ती से सह-आईपीएस के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन सहायक हो सकता है ।- सह के लिए, ब्याज के लक्ष्यों के बीच पूर्ण dimerization सुनिश्चित करने के लिए, एक एसडीएस-पृष्ठ जेल पर eluates चलाने के लिए और एंटीबॉडी के साथ हा टैग या ध्वज टैग के खिलाफ जांच, संकेत के रूप में, सभी 1:१,००० पर । उसके बाद चरण 8 पर जारी रखें ।
- चिप-qPCR के लिए, सही स्थानीयकरण और प्रत्येक CRISPR-dCas9 घटक, एक कॉलम और 10 µ एल में elute पर स्वच्छ रेफरेंस उत्पाद के लक्ष्यीकरण सुनिश्चित करने के लिए वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) शुद्ध डीएनए प्रदर्शन । प्रस्तुत आंकड़ों में उपयोग प्राइमर अनुपूरक तालिका 1में उपलब्ध हैं । उसके बाद चरण 8 पर जारी रखें ।
8. आरएनए निष्कर्षण और मात्रात्मक पीसीआर
- जीन अभिव्यक्ति में CLOuD9 प्रेरित परिवर्तन की जांच करने के लिए, पहले, अलग और दोनों नियंत्रण सेल छर्रों और dimerized सेल छर्रों से कुल आरएनए शुद्ध.
- प्रतिलेखन17 रिवर्स द्वारा शुद्ध आरएनए से पूरक डीएनए (सीडीएनए) बनाओ और qPCR विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं । प्राइमरों अनुपूरक तालिका 1में उपलब्ध हैं ।
9. गुणसूत्र अनुरूप कब्जा परख
- CLOuD9 द्वारा प्रेरित जीनोमिक loci संपर्कों की आवृत्ति में परिवर्तन का पालन करने के लिए, गुणसूत्र अनुरूप कब्जा (3 सी)8परख प्रदर्शन करते हैं ।
- मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर से तीन जैविक प्रतिकृति के प्रत्येक के लिए डुप्लिकेट के दो सेट में 3 सी बंधाव उत्पादों को बढ़ाता है । tubulin लोकस से 3 सी संकेतों को नमूनों को सामान्य. प्राइमरों अनुपूरक तालिका 1में उपलब्ध हैं ।
Representative Results
CLOuD9 प्रतिवर्ती β-ग्लोबिन प्रमोटर-LCR looping लाती है । CLOuD9 प्रणाली का उपयुक्त उपयोग पूरक CSA के प्रतिवर्ती संपर्क और CSP CLOuD9 के माध्यम से और सेल संस्कृति मीडिया के लिए आबा को हटाने के माध्यम से constructs (आंकड़ा 1a) लाती है । CSA और CSP constructs (आरेख 1b) मानक CRISPR gRNAs का उपयोग कर उपयुक्त जीनोमिक क्षेत्रों के लिए अनुवादित हैं । मानव ग्लोबिन लोकस के विशाल प्रलेखन के साथ ही अक्सर गुणसूत्र तह और पुनर्व्यवस्था है कि वहां विकास के दौरान होता है पर विचार, इस क्षेत्र को CLOuD9 प्रणाली की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए चुना गया था । इसके अतिरिक्त, K562 सेल लाइन का चयन किया गया क्योंकि यह लगातार भ्रूण γ के उच्च स्तर को व्यक्त करने के लिए दिखाया गया है-ग्लोबिन जीन, के रूप में β-ग्लोबिन जीन है कि आम तौर पर स्वस्थ वयस्क erythroid वंश कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है का विरोध किया । K562 कोशिकाओं का उपयोग करके, CLOuD9 की क्षमता जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए इस सेल लाइन में β-ग्लोबिन जीन की अभिव्यक्ति बहाल करने का प्रयास द्वारा जांच की जा सकती है ।
dimerization की प्रेरण से पहले, क्रोमेटिन immunoprecipitation-मात्रात्मक पीसीआर (चिप qPCR) के लिए सटीक स्थानीयकरण और प्रत्येक CLOuD9 घटक (अनुपूरक चित्रा 1)के लक्ष्यीकरण सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया गया था । साथ ही, सह-immunoprecipitation (co-IP) के साथ और बिना आबा सत्यापित CSA और CSP dimerization की उपस्थिति में ligand साथ ही reversibility के अभाव में ligand (चित्रा 1c और अनुपूरक चित्रा 2). 24 एच जोड़ने के बाद आबा, β-ग्लोबिन और LCR के बीच अधिक से अधिक संपर्क दोनों dimerization भागों के साथ कोशिकाओं में गुणसूत्र अनुरूप कब्जा (3 सी) द्वारा मापा के रूप में दिखाई दिया, लेकिन नहीं केवल दो CSA या CSP constructs युक्त नियंत्रण, इस प्रकार मान्य लक्षित साइटों के लिए क्रोमेटिन परिवर्तन की विशिष्टता (चित्रा 1c और अनुपूरक आंकड़े 3, 4) । LCR-β-ग्लोबिन बातचीत का निर्माण पूरी तरह से अंतर्जात LCR-ग्लोबिन संपर्क को समाप्त नहीं किया, लेकिन इसके बजाय, मूल संपर्क करने के लिए जोड़ा, के रूप में पहले8की सूचना दी । β-ग्लोबिन/LCR संपर्कों में बढ़ जाती है dimerization के ७२ ज, लक्षित LCR और β-ग्लोबिन प्रमोटर क्षेत्र (अनुपूरक आंकड़े 5, 6) के भीतर सटीक क्षेत्र की परवाह किए बिना के लिए मनाया गया । अन्त में, आबा को हटाने के बाद 3 सी के साथ प्रणाली के reversibility की पुष्टि की गई, जो अंतर्जात अनुरूपता (चित्रा 1 डी और अनुपूरक आंकड़े 3-6) का एक पूर्ण नवीकरण दिखाया ।
हमने माना कि K562 कोशिकाओं में दिखाया सफलता euchromatin (चित्रा 1 डी) के एक क्षेत्र में ग्लोबिन लोकस स्थान का परिणाम हो सकता है, तो एक दूसरे सेल लाइन इस विचार का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था. CLOuD9 प्रणाली को उन क्षेत्रों में HEK 293T कोशिकाओं पर लागू किया गया जो heterochromatic हैं और ग्लोबिन जीन (फिगर 1e) व्यक्त नहीं करते. परिणाम क्या K562s में मनाया गया था के समान था; अधिक β-ग्लोबिन LCR संघों 3 सी से 24 एच के बाद आबा (चित्रा 1e और अनुपूरक आंकड़ा ३) के साथ मापा गया था, CLOuD9's मजबूत करने के लिए अलग सेलुलर वातावरण में कार्य करने की क्षमता के लिए सबूत उपलब्ध कराने, मूल क्रोमेटिन राज्य के बावजूद या अनुरूपता ।
अतिरिक्त loci CLOuD9 की व्यापक प्रयोज्यता सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया गया, Oct4 प्रमोटर और 293T कोशिकाओं के भीतर एक बाहर 5 ' बढ़ाने सहित । पहले, इस सेल लाइन में कोई जासूसी Oct4 अभिव्यक्ति किया गया है और आगे, कोई अंतर्जात संपर्क वर्णित । भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के बाहर 5 ' बढ़ाने के साथ संपर्क से जिसके परिणामस्वरूप में Oct4 अभिव्यक्ति का सबूत इस प्रयोग से प्रेरित है, और एक ही परिणाम β-ग्लोबिन लोकस18पर मनाया गया । Oct4 बाहर बढ़ाने और प्रमोटर के बीच संपर्क CLOuD9 सक्षम कोशिकाओं में पहचाना गया था, लेकिन नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 1f) नहीं. इसके अतिरिक्त, यह देखा गया कि Oct4 प्रमोटर और बाहर 5 ' बढ़ाने संपर्क भी एक 3 ' बढ़ाने के लिए प्रेरित Oct4 प्रमोटर से संपर्क करें । इस घटना के सबूत है कि 3 ' बढ़ाने के साथ संगत है Oct4 प्रमोटर/5 ' अंतर्जात जीन सक्रियकरण10के दौरान बाहर बढ़ाने के परिसर के बाहर ।
CLOuD9 जीन loci में संदर्भ विशिष्ट परिवर्तन लाती है । पुष्टि करने के बाद कि CLOuD9 प्रणाली वास्तव में जीन loci में गुणसूत्र संपर्क प्रेरित करता है, हम जीन अभिव्यक्ति पर ' छोरों प्रभाव की जांच की मांग की । यह प्रलेखित किया गया है कि ग्लोबिन और Oct4 जीन के लिए प्रतिलेखन LCR और ग्लोबिन जीन loci और बाहर 5 ' बढ़ाने और Oct4 प्रमोटर, क्रमशः1,11के बीच संपर्कों पर आकस्मिक रहे हैं । इस प्रकार, हम की कल्पना की है कि CLOuD9 प्रणाली का उपयोग करने के लिए इन क्षेत्रों में से प्रत्येक में क्रोमेटिन पाश गठन ड्राइव मजबूर जीन अभिव्यक्ति में परिणाम होगा ।
दोनों loci में, RT-qPCR प्रदर्शन किया है कि आबा प्रेरित क्रोमेटिन छोरों तादाद 293T कोशिकाओं में Oct4 अभिव्यक्ति में बढ़ जाती है, और ग्लोबिन कोशिकाओं में β-K562 अभिव्यक्ति में, हालांकि 293Ts में नहीं (चित्रा 2a). हालांकि के रूप में छोटे रूप में 24 एच के लिए सेल संस्कृति को आबा के अलावा β-ग्लोबिन अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई गौरतलब है, अभिव्यक्ति के लिए तेजी से वृद्धि ७२ घंटे तक जारी रखा और आबा वॉशआउट पर प्रतिवर्ती (चित्रा 2a) । नियंत्रण के अलावा K562 कोशिकाओं के सभी इस प्रवृत्ति का पालन किया, कोई फर्क नहीं पड़ता कि जहां dimerization घटक LCR और β-ग्लोबिन प्रवर्तक क्षेत्रों में स्थित थे (चित्रा 2a और अनुपूरक आंकड़े 7, 8). इन निष्कर्षों के समर्थन में, K562s और 293Ts में β-ग्लोबिन लोकस में H3K4me3 और आरएनए पोल-द्वितीय के चिप-qPCR (चित्रा 2cएफ) प्रतिलिपि में परिवर्तन मनाया के साथ संगत ।
CLOuD9 स्थिर क्रोमेटिन छोरों स्थापित करता है । हालांकि CLOuD9 के साथ अल्पकालिक पाश प्रेरण स्पष्ट रूप से उंमीदों का पालन किया, चाहे लंबे समय से looping की अवधि के प्रेरण प्रभाव था मनाया गया । इसकी जांच करने के लिए कक्षों को 10 दिनों के लिए आबा की उपस्थिति में कल्चरित किया गया । जबकि दोनों K562s और 293Ts β-ग्लोबिन लोकस और नियंत्रण के सापेक्ष LCR (आंकड़ा 3 ए, बी और अनुपूरक आंकड़े 9, 10) के बीच बढ़ी हुई संपर्क आवृत्ति प्रदर्शित, β-ग्लोबिन अभिव्यक्ति में परिवर्तन अभी भी केवल मनाया गया K562 कोशिकाओं में (चित्रा 3सी) । दिलचस्प है, तथापि, यह देखा गया है कि लंबे समय तक K562s में dimerization, जहां प्रतिलेखन दृढ़ता से विनियमित था, अब प्रतिवर्ती (आंकड़ा 3 ए और अनुपूरक आंकड़े 9-11) था । हालांकि, 293Ts में, जहां प्रतिलेखन में कोई परिवर्तन दीर्घकालिक dimerization, क्रोमेटिन संपर्कों में प्रेरित परिवर्तन के बाद मनाया गया प्रतिवर्ती (आंकड़ा 3 बी और अनुपूरक आंकड़ा 9) ।
कुल मिलाकर, केवल जीन अभिव्यक्ति में एक छोटी सी कमी को आबा हटाने के 10 दिनों के बाद मनाया गया था, जो dimerization (चित्रा 3सी) से पहले जीन अभिव्यक्ति के स्तर से काफी अधिक बनी रही । इस के साथ ध्यान में रखते हुए, K562 कोशिकाओं, लेकिन नहीं 293T कोशिकाओं, H3K4me3 और आरएनए पोल-द्वितीय में निरंतर परिवर्तन दिखाया-β-ग्लोबिन लोकस चिप-qPCR द्वारा, नियंत्रण की तुलना में, यहां तक कि आबा हटाने के 10 दिनों के बाद (चित्रा 3 डी-एफ). इस प्रकार, हमारे परिणाम संकेत मिलता है कि क्रोमेटिन लूप की स्थिरता और अधिक टिकाऊ जीन अभिव्यक्ति का तात्पर्य है ।
चित्रा 1: CLOuD9 प्रतिवर्ती β-ग्लोबिन प्रमोटर-LCR looping लाती है । (क) abscisic अम्ल के अतिरिक्त (आबा, हरे) दो पूरक CLOuD9 constructs (CLOuD9 s. pyogenes (CSP), CLOuD9 s. aureus (CSA), लाल और नीला, क्रमशः निकटता में, पुन: मॉडलिंग क्रोमेटिन संरचना लाता है । आबा को हटाने अंतर्जात क्रोमेटिन अनुरूपता पुनर्स्थापित करता है । (ख) CLOuD9 का निर्माण CRISPR-dCas9 तकनीक से एस. aureus और एस. pyogenes के साथ reversibly dimerizeable PYL1 और ABI1 डोमेन से जुडा है. (ग) CLOuD9 dimerization प्रयोगों की समयरेखा. (घ) सी 3 सी परख को मापने β-ग्लोबिन लोकस-वाइड crosslinking आवृत्तियों K562 कोशिकाओं में आबा (लाल) और बाद में वॉशआउट के साथ उपचार के h के बाद (नीला) प्रेरित β-reversibility/ग्लोबिन संपर्कों के LCR दिखा (ग्रे में प्रकाश डाला) । ऑरेंज ऐरोहेड संकेत विशिष्ट CLOuD9 निर्माण लक्ष्य क्षेत्रों । अतिसंवेदनशीलता साइटों 1-4 के LCR (काली पट्टी) युक्त EcoRI टुकड़ा लंगर क्षेत्र के रूप में इस्तेमाल किया गया था । अंय संकेत EcoRI टुकड़े के साथ इसकी crosslinking आवृत्ति (ग्राफ के शीर्ष पर नाम) का मूल्यांकन किया गया । मानव β-ग्लोबिन जीन और LCR अतिसंवेदनशीलता साइटों गुणसूत्र स्थिति निर्देशांक के साथ ग्राफ के तल पर चित्रित कर रहे हैं. H3K4me3 और H3K9me3 के चिप-seq से डेटा प्रदर्शित करता है कि इस क्षेत्र K562s में euchromatic है । (ङ) क्रोमेटिन संरचना में समान प्रतिवर्ती परिवर्तन HEK 293T कोशिकाओं में देखा जाता है, H3K4me3 और H3K9me3 चिप seq डेटा से सबूत के बावजूद कि ग्लोबिन क्षेत्र इस कक्ष प्रकार में heterochromatic है । (f) सी 3 सी Oct4 लोकस-वाइड crosslinking आवृत्तियों को मापने 293T कोशिकाओं में आबा के साथ उपचार के ७२ एच (लाल) दिखा प्रेरित Oct4/बाहर बढ़ाने संपर्क (ग्रे में प्रकाश डाला) । ऑरेंज ऐरोहेड संकेत विशिष्ट CLOuD9 निर्माण लक्ष्य क्षेत्रों । Oct4 प्रमोटर (ब्लैक बार) युक्त MboI टुकड़ा लंगर क्षेत्र के रूप में इस्तेमाल किया गया था । अंय संकेत MboI टुकड़े के साथ इसकी crosslinking आवृत्ति (ग्राफ के शीर्ष पर नाम) का मूल्यांकन किया गया । मानव Oct4 क्षेत्रों गुणसूत्र स्थिति निर्देशांक के साथ ग्राफ के तल पर चित्रित कर रहे हैं. 3 सी परिणाम के सभी कम से तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किया गया । 3 सी मान tubulin करने के लिए सामान्यीकृत थे । β-ग्लोबिन के लिए, के बीच संपर्क आवृत्तियों एंकर टुकड़ा और अंश β/HS अंश को शामिल शूंय करने के लिए सेट किए गए थे । Oct4 के लिए, एंकर अंश और Oct4 सहभागिता क्षेत्र के बाहर एक नकारात्मक नियंत्रण अंश के बीच सहभागिता आवृत्तियों शून्य करने के लिए सेट किए गए थे । त्रुटि पट्टियां s.d. n = 3 इंगित करती हैं । यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अल में चित्रा 1 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 2: CLOuD9 जीन अभिव्यक्ति और क्रोमेटिन राज्य में संदर्भ विशिष्ट परिवर्तन लाती है । (क) ग्लोबिन में β-K562s अभिव्यक्ति की प्रतिवर्ती प्रेरण में β-ग्लोबिन लोकस परिणाम पर CLOuD9-प्रेरित क्रोमेटिन लूप नहीं बल्कि 293Ts. माहात्म्य में इलाज कोशिकाओं के नियंत्रण के सापेक्ष दिया । दो-पुच्छ विद्यार्थी का t-परीक्षण * P < 0.05, t = ३.४१८, df = 5; P < 0.0001, t = १०.४२ df = 5; एन एस गैर भरपुर । त्रुटि पट्टियां s.d. n = 3 इंगित करती हैं । (ख) Oct4 अभिव्यक्ति की प्रेरण एक ही लोकस में CLOuD9-प्रेरित looping निंनलिखित 293Ts में मनाया गया । माहात्म्य का इलाज कक्षों को नियंत्रित करने के सापेक्ष दिया गया है. दो-पुच्छ विद्यार्थी का t-परीक्षण * P < 0.05, t = ४.५६२, df = 2 । त्रुटि पट्टियां संकेत s.d. (ग) β-ग्लोबिन जीन शरीर के साथ चिप-qPCR प्राइमर स्थानों की योजनाबद्ध । (डी, ई) चिप qPCR K562s में β-ग्लोबिन लोकस में H3K4me3 में प्रतिवर्ती परिवर्तन को दर्शाता है, लेकिन 293Ts के बाद CLOuD9-प्रेरित looping में नहीं. दो-पुच्छ छात्र का t-परीक्षण * p < 0.05, * * p < 0.001, * * * p < 0.0001 । त्रुटि पट्टियों से संकेत मिलता है s.d. (f) CLOuD9 में मध्यस्थ परिवर्तन β-ग्लोबिन प्रतिलेखन में K562s में वृद्धि के साथ संगत β-ग्लोबिन जीन शरीर की पूरी तरह से द्वितीय अधिभोग । दो-पुच्छ छात्र का t-परीक्षण * p < 0.05, * * p < 0.001, * * * p < 0.0001 । त्रुटि पट्टियां संकेत s.d. यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें चित्रा 2 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 3: CLOuD9 स्थिर क्रोमेटिन छोरों कि दीर्घकालिक dimerization के बाद मजबूत जीन अभिव्यक्ति को बनाए रखने स्थापित करता है । (a, b) 3 c परख दर्शाता है कि K562s में नहीं बल्कि 293Ts, CLOuD9-प्रेरित क्रोमेटिन looping आबा उपचार के 10 दिनों के बाद अपरिवर्तनीय हो जाता है, यहां तक कि जब आबा को 10 अतिरिक्त दिनों के लिए निकाल दिया जाता है. सभी 3 सी परिणाम कम से तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किया गया । 3 c मान tubulin के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और एंकर अंश और β/HS अंश को शामिल अंश के बीच सहभागिता आवृत्तियों शूंय करने के लिए सेट किए गए थे । त्रुटि पट्टियां s.d. n = 3 इंगित करती हैं । (ग) β-ग्लोबिन की निर्बाध अभिव्यक्ति में K562s परिणामों में पाश स्थिरीकरण, यहां तक कि आबा वॉशआउट के 10 दिनों के बाद. β-ग्लोबिन अभिव्यक्ति में कोई परिवर्तन 293Ts. माहात्म्य इलाज कक्षों को नियंत्रित करने के लिए सापेक्ष दिया में स्वीकार्य हैं । दो-पुच्छ छात्र का t-परीक्षण * * * P < 0.0001, t = ५.९६३, df = 5; एन एस गैर भरपुर (डी) चिप-qPCR लोकस में CLOuD9 ligand के 10 दिनों के बाद निरंतर कर रहे है β-ग्लोबिन वॉशआउट पर H3K4me3 के निशान में बढ़ रहा है K562s-प्रेरित looping । दो-पुच्छ छात्र का t-परीक्षण * p < 0.05, * * p < 0.001, * * * P < 0.0001 । (ङ) लंबी अवधि के dimerization के बाद H3K4me3 संकेतों में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन 293Ts में चिप qPCR द्वारा मनाया गया । (च) बढ़ी हुई आरएनए पोल-β-ग्लोबिन लोकस के द्वितीय अधिभोग निम्नलिखित दीर्घकालिक लूप प्रेरण K562s में बनाए रखा गया था ligand वॉशआउट के 10 दिन बाद । दो-पुच्छ छात्र का t-परीक्षण * p < 0.05, * * p < 0.001, * * * p < 0.0001 । सभी त्रुटि पट्टियां संकेत s.d. यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें चित्रा 3 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
अनुपूरक आंकड़ा 1: CLOuD9 construction information to his उद्दिष्ट लक्ष्य क्षेत्र । क्रोमेटिन immunoprecipitation व मात्रात्मक पीसीआर च्या CLOuD9 गावातील प्रदर्शने तातडीने स्थानीयकरण करताना ते त्यांच्या उद्दिष्ट जीनोमिक loci. यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक चित्रा 1 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक आंकड़ा 2: आबा के इलाज के जवाब में CLOuD9 का कंस् reversibly एसोसिएट । सह immunoprecipitations dCas9 प्रोटीन के संघ का प्रदर्शन ७२ आबा उपचार के बाद एच ligand वॉशआउट के बाद ७२ ज बाद उलट है । यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक चित्रा 2 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक आंकड़ा 3: नियंत्रण उपचार क्रोमेटिन संपर्कों में कोई परिवर्तन लाती है । DMSO के साथ उपचार, एक नियंत्रण एजेंट, 24 घंटे के लिए या तो K562 कोशिकाओं या HEK 293Ts में 3 सी द्वारा अंतर्जात क्रोमेटिन अनुरूपता में कोई परिवर्तन लाती है. 3 सी मान tubulin करने के लिए सामान्यीकृत किया गया, और एंकर अंश और अंश के बीच सहभागिता आवृत्तियों β/HS अंश को शामिल शूंय करने के लिए सेट किए गए थे । त्रुटि पट्टियां SD. n = 3 इंगित करती हैं । यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक चित्रा 3 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक आंकड़ा 4: नियंत्रण CLOuD9 transduced कोशिकाओं क्रोमेटिन looping में कोई परिवर्तन नहीं दिखा । LCR या β-ग्लोबिन प्रवर्तक के लिए दो CLOuD9 का निर्माण निर्देशन 3 सी द्वारा क्रोमेटिन संरचना में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन लाती है आबा इलाज के सापेक्ष उपचार नियंत्रण के लिए रिश्तेदार । 3 c मान tubulin के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और एंकर अंश और β/HS अंश को शामिल अंश के बीच सहभागिता आवृत्तियों शूंय करने के लिए सेट किए गए थे । त्रुटि पट्टियां SD. n = 3 इंगित करती हैं । यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक चित्रा 4 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक चित्रा 5: CLOuD9 क्रोमेटिन looping dimerization के ७२ घंटे के बाद प्रतिवर्ती रहता है । K562s में 3 सी परख reversibility आबा उपचार के ७२ घंटे के बाद CLOuD9 प्रेरित β-ग्लोबिन/LCR संपर्कों का प्रदर्शन करता है । 3 c मान tubulin के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और एंकर अंश और β/HS अंश को शामिल अंश के बीच सहभागिता आवृत्तियों शूंय करने के लिए सेट किए गए थे । त्रुटि पट्टियां SD. n = 3 इंगित करती हैं । यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक चित्रा 5 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक आंकड़ा 6: CLOuD9 प्रेरित β-ग्लोबिन/LCR looping ग्लोबिन लक्ष्य साइट द्वारा प्रभावित नहीं है । CSA और CSP को निर्देशित करने से LCR के वैकल्पिक क्षेत्रों या β-ग्लोबिन प्रवर्तक परिणामों में समान प्रतिवर्ती परिवर्तन लूप प्रेरण में 3 सी के बाद ७२ आबा उपचार के घंटे का निर्माण करता है । 3 c मान tubulin के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और एंकर अंश और β/HS अंश को शामिल अंश के बीच सहभागिता आवृत्तियों शूंय करने के लिए सेट किए गए थे । त्रुटि पट्टियां SD. n = 3 इंगित करती हैं । यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक चित्रा 6 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक आंकड़ा 7: जीन अभिव्यक्ति में CLOuD9 प्रेरित परिवर्तन ग्लोबिन लक्ष्य साइट की परवाह किए बिना निरंतर कर रहे हैं । CSA और CSP को निर्देश β-ग्लोबिन प्रवर्तक और LCR के वैकल्पिक क्षेत्रों के लिए निर्माण dimerization के ७२ एच निम्नलिखित जीन अभिव्यक्ति की प्रेरण पर कोई प्रभाव नहीं है. हालांकि, लंबी अवधि के बाद (10 दिन) dimerization जीन अभिव्यक्ति की शक्ति पर कुछ प्रभाव मनाया गया था, जबकि इलाज कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए संबंधित β-ग्लोबिन के उच्च स्तर 10 अतिरिक्त दिनों के लिए बाद में ligand वॉशआउट के बाद निरंतर थे । माहात्म्य का इलाज कक्षों को नियंत्रित करने के सापेक्ष दिया गया है. * *p < ०.००१, t = १०.२५, df = 5; p < ०.०००१, बाएं से दाएं t = ८.६९७, df = 6, t = ४०.३१, df = 7; एन एस गैर भरपुर । सभी त्रुटि पट्टियां SD इंगित करती हैं । यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक चित्रा 7 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक चित्रा 8: नियंत्रण CLOuD9 transduced कोशिकाओं β-ग्लोबिन अभिव्यक्ति में कोई परिवर्तन दिखाएँ. LCR या β-ग्लोबिन प्रवर्तक के लिए दो CLOuD9 constructs निर्देशन β-ग्लोबिन अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन के बाद आबा उपचार नियंत्रण उपचार के सापेक्ष लाती है । माहात्म्य का इलाज कक्षों को नियंत्रित करने के सापेक्ष दिया गया है. एन एस गैर भरपुर । यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक आंकड़ा 8 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक आंकड़ा 9: दीर्घकालिक नियंत्रण उपचार क्रोमेटिन संपर्कों में कोई परिवर्तन लाती है । DMSO के साथ उपचार, एक नियंत्रण एजेंट, 10 दिनों के लिए या तो K562 कोशिकाओं या HEK 293Ts में 3 सी द्वारा अंतर्जात क्रोमेटिन अनुरूपता में कोई परिवर्तन नहीं लाती. 3 सी मान tubulin करने के लिए सामान्यीकृत किया गया, और एंकर अंश और अंश के बीच सहभागिता आवृत्तियों β/HS अंश को शामिल शूंय करने के लिए सेट किए गए थे । त्रुटि पट्टियां SD. n = 3 इंगित करती हैं । यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक चित्रा 9 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक आंकड़ा 10: दीर्घकालिक CLOuD9 प्रेरित β-ग्लोबिन/LCR looping ग्लोबिन लक्ष्य साइट द्वारा प्रभावित नहीं है । CSA और CSP को निर्देशित करना LCR के वैकल्पिक क्षेत्रों में या β-ग्लोबिन प्रवर्तक परिणाम इसी प्रकार निरंतर लूप प्रेरण के रूप में 3 सी के बाद 10 आबा उपचार और बाद में ligand वॉशआउट के 10 दिनों के द्वारा प्रदर्शित किया जाता है । 3 c मान tubulin के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और एंकर अंश और β/HS अंश को शामिल अंश के बीच सहभागिता आवृत्तियों शूंय करने के लिए सेट किए गए थे । त्रुटि पट्टियां SD. n = 3 इंगित करती हैं । यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक चित्रा 10 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
supplement figure 11: लम्बे समय से आबा के इलाज के जवाब में CLOuD9 construction अचल एसोसिएट । सह immunoprecipitations का प्रदर्शन CSA और CSP dCas9 प्रोटीन के अपरिवर्तनीय एसोसिएशन के 10 दिनों के आबा उपचार और 10 ligand वॉशआउट के बाद के दिनों के बाद. यह आंकड़ा मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक चित्रा 11 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक तालिका 1: gRNAs, qRT-पीसीआर, 3 सी, और चिप qPCR के लिए प्राइमर दृश्यों की सूची । इस तालिका मॉर्गन, Stefanie एल, एट अलमें अनुपूरक तालिका 1 से संशोधित किया गया है । 9. कृपया यहां क्लिक करें इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए
Discussion
CLOuD9 क्रोमेटिन लूप्स में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) डिजाइनिंग या सही gRNAs का उपयोग कर, 2) CLOuD9-transduced कोशिकाओं पर प्रतिदिन बदलते मीडिया, आबा या DMSO सहित, 3) आबा की ताजगी बनाए रखने, और 4) के सटीक और सावधान आकलन प्रदर्शन क्रोमेटिन क्षेऽ ।
CLOuD9 की सीमा मुख्य रूप से पसंद के लक्ष्य क्षेत्र के लिए गाइड डिजाइन करने की क्षमता में रहते हैं । गाइड RNAs डीएनए क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए dCas9 घटकों का स्थानीयकरण करने के महत्वपूर्ण कार्य निष्पादित dimerized और गाइड की प्रभावकारिता उनके विशिष्ट लक्ष्य साइट पर आधारित हैं । उचित gRNA घटकों के बिना, CLOuD9 प्रणाली reversibly प्रेरित छोरों फार्म करने में सक्षम नहीं होगा. इस प्रकार, ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए कई गाइड डिजाइन और 250-1000 बीपी के एक क्षेत्र पर गाइडों के प्रसार के द्वारा, कम से एक सफल गाइड सुनिश्चित किया जाएगा । गाइड स्थान भी सटीक परिणाम का अभिंन अंग है । यह प्रतिलेखन कारक बंधन साइटों या अंय महत्वपूर्ण क्षेत्रों में स्थित गाइड से बचने के लिए इस तरह के ऊपर या नीचे प्रतिलेखन के विनियमन के रूप में पृष्ठभूमि प्रभाव को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, CLOuD9 के सटीक स्थान का निर्माण थोड़ा लक्ष्य जीन की प्रतिलिपि प्रभाव कर सकते हैं । यह प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए सबसे मजबूत जोड़ी की पहचान करने के लिए, प्रत्येक लक्ष्य क्षेत्र के लिए गाइड के कई जोड़े परीक्षण के महत्व पर जोर देती है । इसके अलावा, लक्ष्य क्षेत्रों के प्रत्येक जोड़ी में, CSA निर्माण gRNAs के साथ एस aureusके लिए लक्षित किया जाना चाहिए, और CSP निर्माण विशिष्टता लक्ष्यीकरण के लिए एस pyogenes के लिए gRNAs के साथ निशाना बनाया जाना चाहिए ।
सटीक परिणाम और सही dimerization सुनिश्चित करने के लिए, यह भी CLOuD9 constructs के transduction के बाद सेलुलर वातावरण की ताजगी बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । दैनिक मीडिया परिवर्तन और ताजा dimerizer (या नियंत्रण) के अलावा यह सुनिश्चित करता है कि पूरक निर्माण निकटता में रहेगा और बदल क्रोमेटिन अनुरूपता बनाए रखेंगे । इसके अलावा, आबा की गारंटी ताजा है और उचित रूप से निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार संग्रहीत किया गया है (6 महीने के भीतर खोला, ठंडा रखा, प्रकाश से सुरक्षित) प्रामाणिक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
विशेष रूप से, CLOuD9 के लिए आबा dimerizer अबी और PYL dimerization प्रोटीन के साथ प्रयोग किया जाता था, बल्कि अधिक सामांयतः उपयोग FRB और FKBP प्रणाली से । FRB/FKBP प्रणाली के लिए एक rapalog की आवश्यकता CLOuD9 की प्रयोज्यता, कैंसर की कोशिकाओं को विषाक्तता के कारण सीमित होगा । वैकल्पिक अबी/PYL प्रणाली इस सीमा को दरकिनार, प्रभावी ढंग से CLOuD9 को सक्षम करने के लिए और अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाएगा ।
सामूहिक रूप से, हम CLOuD9, एक अद्वितीय और मजबूत प्रौद्योगिकी है कि जबरन लेकिन reversibly लंबी दूरी के लक्ष्य जीनोमिक loci के बीच संपर्क बनाने के लिए कर सकते है विकसित किया है । क्रोमेटिन छोरों उत्प्रेरण के माध्यम से, हम यह भी है कि CLOuD9 उपयुक्त सेलुलर संदर्भ में जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है प्रदर्शित करता है । प्रौद्योगिकी के अनुकूलन की अनुमति देता है किसी भी दो जीनोमिक loci के बीच बातचीत के अप्रतिबंधित अध्ययन के लिए, पाश क्षेत्रों या looping तंत्र के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता के बिना । इसके अलावा, CLOuD9's अनोखा प्रदर्शन किया reversibility रोग और विकास में पाश तंत्र के आगे परीक्षा में सक्षम बनाता है । जबकि क्रोमेटिन looping के पर लक्ष्य प्रभाव स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया गया है, वहां अभी तक के लिए रवाना लक्ष्य looping और पर लक्ष्य छोरों पर बाद के प्रभाव के प्रभाव में अंतर्दृष्टि की पेशकश डेटा हो रहा है ।
हमारे डेटा इस उपकरण के केवल कुछ अनुप्रयोगों को दिखाता है लेकिन प्रमुख अंतर्निहित विचार है कि क्रोमेटिन व्यवस्था जीन अभिव्यक्ति का संकेत है तात्पर्य है । हमारी प्रौद्योगिकी के अध्ययन और जीन विनियमन में क्रोमेटिन संरचना की बारीकियों का पता चलता है, जिससे जीन की प्रतिलेखन में क्रोमेटिन तह की भूमिका की समग्र समझ में सुधार किया जा सकता है । transcriptional गतिशीलता के बारीकियों की एक बेहतर समझ के अनुसंधान और कैंसर के उपचार में जिस तरह से नेतृत्व कर सकते हैं, वंशानुगत रोगों, और जन्मजात विकारों, जिसमें विशिष्ट क्रोमेटिन विधानसभा निस्संदेह बदल जीन अभिव्यक्ति20, 21,22,23. बाद काम CLOuD9 प्रौद्योगिकी का उपयोग व्यवस्था और क्रोमेटिन डोमेन की गतिशीलता और कैसे वे दोनों के विकास और रोग में स्थिर जीन अभिव्यक्ति को बनाए रखने के तह ड्राइव के बारे में अधिक जानकारी रोशन करेंगे ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम एच चांग, टी ओरो, एस Tavazoie, आर फ्लिन, पी Batista, ई. Calo, और तकनीकी सहायता और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए पूरे वैंग प्रयोगशाला धंयवाद । S.L.M. को NSFGRF (डीजीई-११४७४७), NDSEGF (FA9550-11-सी-0028), और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (1F99CA222541-01) के माध्यम से इस कार्य में सहयोग दिया गया है । K.C.W. बरोज वेलकम फंड से चिकित्सा वैज्ञानिकों के लिए एक कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित है, और एक डोनाल्ड ई. और डेलिया बी तीत फाउंडेशन संकाय विद्वान है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | For K562 cell culture |
| DMEM media | Life Technologies | 11995-065 | 1X, for 293T cell culture |
| lentiCRISPR v2 | Addgene plasmid | #52961 | For CLOuD9 plasmid development |
| pRSV-Rev | Addgene plasmid | #12253 | For lentivirus production |
| pMD2.G | Addgene plasmid | #12259 | For lentivirus production |
| pMDLg/pRRE | Addgene plasmid | #12251 | For lentivirus production |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | For lentivirus production |
| anti-HA antibody | Cell Signaling | 3724 | For immunoprecipitation |
| anti-Flag antibody | Sigma | F1804 | For immunoprecipitation |
| DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For DNA extraction |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | For RNA extraction |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA extraction |
| Superscript VILO | Life Technologies | 11754-050 | For cDNA |
| SYBR Green I MasterMix | Roche | 4707516001 | For qPCR analysis |
| Light Cycler 480II | Roche | For qPCR analysis | |
| anti-H3K4me3 antibody | AbCam | ab8580 | For ChIP-qPCR |
| anti-RNA Pol-II antibody | Active Motif | 61083 | For ChIP-qPCR |
| EDTA free protease inhibitor | Roche | 11873580001 | For protein extraction |
| 4-12% Tris Glycine gel | Biorad | Any size, For western blot | |
| anti-Rabbit HRP antibody | Santa Cruz | sc-2030 | For western blot |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling | 7076S | For western blot |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000AKU | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000APE | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000FCJ | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | GEO | GSM1479215 | For ChIP-seq analysis |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10001D | For immunoprecipitation |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10004D | For immunoprecipitation |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | For RNA purification |
| Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | For crosslinking |
| PX458 Plasmid | Addgene | 48138 | Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For PCR purification |
| FastDigest BsmBI | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | For cloning guide RNAs |
| FastAP | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | For cloning guide RNAs |
| 10X FastDigest Buffer | Thermo Fisher Scientific | B64 | For cloning guide RNAs |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For cloning guide RNAs |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | B0202S | For cloning guide RNAs |
| T4 PNK | NEB | M0201S | For cloning guide RNAs |
| 2X Quick Ligase Buffer | NEB | B2200S | For cloning guide RNAs |
| Quick Ligase | NEB | M2200S | For cloning guide RNAs |
| Buffers | |||
| Farnham lysis buffer | 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water | ||
| Modified RIPA buffer | 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4 | ||
| IP dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor | ||
| Wash buffer | 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate | ||
| Swelling buffer | 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40 | ||
| Dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl | ||
| IP elution buffer | 1% SDS, 10% NaHCO3 |
References
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