Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تسلسل ميكرورنا أثر رجعي: الحمض النووي التكميلية المكتبة إعداد بروتوكول باستخدام عينات الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الحمض النووي الريبي

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57471
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 3, 4
1Department of Research, Hackensack University Medical Center, 2Department of Medical Sciences, Seton Hall University, 3Department of Epidemiology and Population Health, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Nephrology and Hypertension, Hadassah - Hebrew University Medical Center

Summary

الفورمالين--الثابتة العينات جزءا لا يتجزأ من البارافين تمثل مصدرا قيماً للمؤشرات الحيوية الجزيئية للأمراض التي تصيب الإنسان. نقدم هنا كدنا المستندة إلى مختبر مكتبة إعداد بروتوكول، في البداية مصممة مع الحمض النووي الريبي مجمدة طازجة، والأمثل لتحليل microRNAs المؤرشفة من أنسجة تخزين تصل إلى 35 عاماً.

Abstract

– جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة (FFPE) أرشفة، تصنيف سريرياً الفورمالين--الثابتة يمكن أن توفر الأحماض النووية للدراسات الجزيئية الاستعادي للتنمية سرطان. باستخدام الآفات غير الغازية أو ما قبل الخبيثة من المرضى الذين يصابون بالمرض الغازية في وقت لاحق، قد يساعد تحليل التعبير الجيني التعرف المبكر التعديلات الجزيئية التي تعرض لخطر الإصابة بالسرطان. وقد وصفت جيدا أن الأحماض النووية المستردة من الأنسجة FFPE خضعت لأضرار مادية والتعديلات الكيميائية، مما يجعل من الصعب تحليلها وعموما يتطلب تكييف فحوصات. ميكرورناس (ميرناس)، ومع ذلك، التي تمثل فئة صغيرة من جزيئات الحمض النووي الريبي التي تمتد فقط إلى ~ 18 – 24 النيوكليوتيدات، قد ثبت أن تحمل التخزين على المدى الطويل، وقد تم تحليلها بنجاح في عينات فب. نقدم هنا 3 ' المراقب مكملة الحمض النووي (كدنا) مكتبة إعداد بروتوكول على وجه التحديد الأمثل لتحليل الكشف الصغيرة المستخرجة من الأنسجة المحفوظة في الأرشيف، والذي تجلى مؤخرا أن تكون قوية واستنساخه بدرجة عالية عند استخدام الأرشيف تخزين لمدة 35 عاماً من العينات السريرية. هذا إعداد مكتبة أيضا تكييف متعدد وتحليل المواد الخطر المتدهورة حيث متصلة مع المراقب محولات الفردية 3 ' عينات الحمض النووي الريبي (حتى 18) وثم تجميعها معا للتحضيرات الانزيمية والبيوكيميائية اللاحقة قبل التحليل. وتجري تنقية جميع بالتفريد جل polyacrylamide (صفحة)، الذي يسمح للتحديدات الخاصة بالحجم والفاسدون من الأنواع الصغيرة من الحمض النووي الريبي المراقب. هذا إعداد مكتبة كدنا أيضا تكييف دقيقة الحمض النووي الريبي المدخلات، تجريبية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تتيح تصميم دورة التضخيم محددة على إنتاج كميات الأمثل من المواد للجيل التالي التسلسل (خ ع). هذا النهج الأمثل لاستخدام الحمض النووي الريبي FFPE المتدهورة من العينات المحفوظة لمدة 35 عاماً، وتوفر البيانات خ ع استنساخه بدرجة عالية.

Introduction

ميرناس هي المصانة ملحوظ أيضا في الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) العينات1،،من23. العمل السابقة قد أثبتت أن التعبير عن هذه قصيرة التنظيمية غير ترميز واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي جزيئات يمكن تقييمها بنجاح باستخدام مجموع الجيش الملكي النيبالي من عينات فب وتقديم بيانات تعبير الجينات ذات الصلة بالمقارنة مع الطازجة الأصلي الأنسجة4،،من56،،من78. عند مقارنة بالحجم الكبير رسول الكشف، التي أظهرت أن تتأثر خطيرة FFPE تجهيز الأنسجة (فورمالدهايد، والحرارة، وجفاف، إلخ)، رنسيس الذاتية، والسن من العينات، صغر حجم ميرناس (~ 18 – 24 النيوكليوتيدات) يظهر لجعلها مقاومة للتحلل ومرونة للتخزين على المدى الطويل، كما أثبتت من خلال دراسات التعبير ميرنا أن يتفوق الدراسات مرناً الفائق في العينات المحفوظة9. دراسات التعبير ميرنا باستخدام العينات السريرية المؤرشفة، التي أجريت معظمها في تحليلات الصغيرة، قد أثبتت أن الواحد أو متعدد الكمي PCR فحوصات، يمكن لأنواع مختلفة من تقنيات ميكرواري، وآخرها خ ع تستخدم لتقييم التعبير عن ميرناس يتم الحفاظ عليها بعد التحسين لهذه الاختبارات10،،من1112،،من1314.

وبالنظر إلى أن التقلبات ميرنا التعبير ارتبط بتطوير مجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة البشرية وأن هناك يحتمل أن تكون كمية هائلة من سريرياً المشروح العينات المحفوظة في الأرشيف، أصبح من الواضح أن هذه الصغيرة من الحمض النووي الريبي وتمثل الجزيئات مصدرا واعداً من احتمال السرطان المؤشرات الحيوية15،16،،من1718. ويمتاز استخدام تكنولوجيا التعبير الجيني الفائق مثل خ ع تقديم تقييم شامل لجميع النصوص ميرنا بالمقارنة مع التكنولوجيات المستهدفة مثل PCR و/أو [ميكروارس]19. ولهذا السبب، بروتوكولا الأمثل وميسورة التكلفة ويسهل تطبيقها لإعداد مكتبة كدنا الكشف صغير من العينات المحفوظة القديمة خ ع الأمثل لتمكين دراسات واسعة النطاق أثر رجعي20.

وأنشأنا سابقا بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي/الحمض النووي متزامنة لاسترداد منفصلة من الجيش الملكي النيبالي والحمض النووي من عينات المحفوظة القديمة، التي وجدنا أن يتفوق مجموعات التجارية المعاصرة21. باستخدام هذا البروتوكول الاستخراج، للحصول على مجموع الجيش الملكي النيبالي من الأنسجة FFPE المحفوظة لفترة طويلة من أوقات، نحن الأمثل إعداد مكتبات كدنا خ ع ميرناس الحفاظ عليها في العينات السريرية ليصل إلى 35 عاماً. وعلاوة على ذلك، في دراسة نشرت مؤخرا حيث أعددنا كدنا المكتبات من تصنيف سريرياً سرطان الأقنية في الموقع (دسيس) العينات، حددنا ميرناس خلطات المعلنة التي تم التحقق من صحتها قبل PCR الكمي، الذي أشار إلى أن يغير التعبير ميرنا محددة قد تكون قابلة للكشف في الآفات دسيس من المرضى الذين يصابون بسرطان الثدي بالمقارنة مع آفات دسيس من المرضى الذين لم يصبن بسرطان الثدي.

ونظرا لتكلفة مجموعات تجارية لإعداد مكتبات كدنا الصغيرة في الجيش الملكي النيبالي، واحتمال وقف العمل بها، فضلا عن استخدام الكواشف المؤلف/براءات الاختراع-المحمية التي لا يمكن أن يكون الأمثل، قررنا أن تكييف المنشورة سابقا يسمح تحليل متزامنة من 18 عينات المختبري وخال من المجموعة 3 ' مكتبة كدنا المراقب إعداد بروتوكول خ ع الكشف الصغيرة المؤرشفة في عينات فب،22. هذا البروتوكول تنص على إجراء خطوة بخطوة مثالية وقوية مع نقاط التفتيش التقييم البصرية والتقنية، والتي تعتبر حاسمة بالنسبة للتكيف مع عينات من "الحمض النووي الريبي فب"، ولديه إمكانات قوية للتطبيق إلى مصادر أخرى للخطر أو صعبة لاستخدام مادة الحمض النووي الريبي. تم تحسين انطباق البروتوكول الأصلي باستبدال علامات الحجم المسمى إشعاعيا بنيون (مثلاً، سيبر الذهب) يمكن كشفها الجيش الملكي النيبالي حجم علامات المستخدمة أثناء اختيار مكتبات الواصلة على المواد الهلامية polyacrylamide كبيرة. هذا البروتوكول الأمثل يعتمد على ربط المراقب محولات 3 'إلى 18 عينات"الحمض النووي الريبي فب"الفردية، التي ثم تجميعها معا للخضوع لمحول ربط 5'، عكس النسخ، وإجراء تحليل PCR تجريبية لتضخيم كدنا النهائي مصممة خصيصا مكتبة قبل واسعة النطاق التضخيم بكر وتنقية وخ ع في التسلسل إنتاجية عالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد جميع الكواشف والإشعال

  1. ترتيب جميع أجهزة الإشعال ومحولات كما هو موضح في الشكل 1.
  2. إعداد معايرة الأسهم كوكتيل، التي سوف تكون ارتفعت في كل عملية ربط الفردية.
    1. ريسوسبيند اليغنوكليوتيد الناقل (الشكل 1) إلى 0.5 ميكرومتر مع المياه خالية من رناسي. ريسوسبيند النوكليوتيد معايرة 10 (الشكل 1) إلى 100 ميكرومتر استخدام 0.5 ميكرومتر الناقل اليغنوكليوتيد الحل.
    2. الجمع بين 10 ميليلتر لكل من آلة لفرز 10 في ميكروسينتريفوجي سيليكونيزيد للحصول على أسهم كوكتيل معايرة 100 ميكرومتر، وتعد حلاً نانومتر 0.026 لتخزين في-20 درجة مئوية.
  3. تمييع أدينيلاتيد فريدة من نوعها، والمجففة بالتبريد، 3 ' المحولات 20 مع المياه خالية من رناسي لتركيز نهائي من 50 ميكرومتر (الشكل 1).
    ملاحظة: من المستحسن إعداد 2.5 ميليلتر مختبرين من كل محول في أنابيب سيليكونيزيد الفردية وتخزينها في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنتين.
  4. ريسوسبيند 19 ديسالتيد nt-3 'محول و nt 24-3' النوكليوتيد ماركر حجم المحول إلى 250 نانوغرام/مليلتر (الشكل 1).
  5. ريسوسبيند المحول المنقي 5 ' [هبلك] إلى 100 ميكرومتر مع المياه خالية من رناسي. ريسوسبيند الإشعال PCR 5 'و 3' إلى 100 ميكرومتر استخدام مياه خالية من رناسي (الشكل 1).
    ملاحظة: قاسمة النوكليوتيد جميع المبالغ اللازمة لتجارب 1 – 2 ومخزن في-80 درجة مئوية.
  6. إعداد polyacrylamide يشوه هلام (PAA) تحميل صبغ بالجمع بين ميثلامين 98.8%، 1% (v/v) M 0.5 غ2ح2 يدتا، pH 8.0، والأزرق بروموفينول 0.2%، وحددت مختبرين مل 1-80 درجة مئوية.
    1. إعداد 0.5 م غ2ح2 يدتا الحل بإضافة ز 18.6 غ2ح2 مسحوق أدتا إلى 50 مل مياه خالية من نوكلاس. إضافة حبيبات هيدروكسيد الصوديوم للوصول إلى درجة الحموضة 8.0. ضبط حجم الصوت إلى 100 مل للحصول على 0.5 م غ2ح2 يدتا، حل الأسهم pH 8.0.
    2. تزن 15 ملغ بروموفينول الأزرق في أنبوب منفصل 15 مل. إضافة 600 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس. إضافة مل 14.25 من ميثلامين دي المتأين. إضافة 150 ميليلتر من 0.5 م غ2ح2 يدتا، حل pH 8.0.
    3. قاسمة PAA الحل النهائي من 15 مل في مختبرين 1 مل في-80 درجة مئوية.
  7. إعداد 5 × [اغروس] هلام تحميل صبغ بالجمع بين الأزرق بروموفينول 0.2%، 0.2% زيلين نفط زايلين FF، يدتا 50 مم نا2ح2 ، pH 8.0، و 20% نوع فيكل-400.
    1. ريسوسبيند ز 1.86 غ2ح2-يدتا في 50 مل مياه خالية من نوكلاس في كوب 400 مل على محرض مغناطيسية في درجة حرارة الغرفة (RT). إضافة حبيبات هيدروكسيد الصوديوم للوصول إلى الرقم الهيدروجيني 8.0. إضافة المياه خالية من نوكلاس للوصول إلى 100 مل للحصول على 50 ملم غ2ح2 يدتا الحل.
    2. تزن 20 ملغ مسحوق بروموفينول الأزرق و 20 ملغ من مسحوق FF زايلين زيلين نفط 2 غ من مسحوق نوع فيكل-400، وريسوسبيند في 5 مل من 50 مم يدتا غ2ح2 .
    3. دوامة الأنبوب الذي يحتوي على ثلاثة الأصباغ وإضافة 5 مل من 50 مم نا2ح2 يدتا. مزج الصبغة 5 تحميل جل x agarose وتحضير مختبرين 1 مل وتخزينها في-80 درجة مئوية.

2-إعداد 3 ' المراقب محول ليجيشنز مع عينات الحمض النووي الريبي الفردية 18

  1. تحديد عينات الحمض النووي الريبي فردي 18 (قبل الكوتيد في 100 نانوغرام في ميليلتر 9.5 خالية نوكلاس المياه في أنابيب 1.5 مل سيليكونيزيد ميكروسينتريفوجي)، وتعيين الأنابيب على الجليد إذابة الثلج لمدة 10 دقائق.
  2. إعداد 10 × "الجيش الملكي النيبالي ليجاسى المخزن المؤقت" (دون ATP) الطازجة.
    1. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل سيليكونيزيد، الجمع بين 343 ميليلتر من المياه خالية من رناسي، 500 ميليلتر من تريس 1 م الأس الهيدروجيني 7.5، 100 ميليلتر مجكل م 12و 50 ميليلتر من ألبومين المصل البقري 20 ملغ/مل ميليلتر 7 من 14 م 2-ميركابتوثانول. مزيج من قبل التحريك الأنبوب الطرد المركزي 2 s في 2000 x ز و RT، وتعيين على الجليد.
      ملاحظة: جميع الخطوات في هذا البروتوكول التي تشير إلى "أجهزة الطرد المركزي ل 2 s" تجري في ميكروسينتريفوجي benchtop RT وسرعتها القصوى 2,000 س ز لجمع الحلول إلى الجزء السفلي من الأنابيب.
  3. إعداد المخزون [دمس] مائي 50% بإضافة 1 مل خالية رناسي المياه إلى 1 مل من [دمس] في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل سيليكونيزيد والتفاف الأنبوب في رقائق الألومنيوم، وتخزينها في الرايت
  4. تذويب 0.026 كوكتيل معايرة نانومتر على الجليد لأدنى 10 إعداد مزيج الرئيسي ربط من خلال الجمع بين الترتيب التالي في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل سيليكونيزيد: 40 ميليلتر من 10 × "الجيش الملكي النيبالي ليجاسى المخزن المؤقت" وميليلتر 120 من 50% مائي [دمس] استخدام ماصة 200 مل ، وإضافة 10 ميليلتر لمعايرة نانومتر 0.026 كوكتيل استخدام ماصة 10 ميليلتر. نفض الغبار على أنبوب 1.5 مل للمزيج، الطرد المركزي 2 s، ومجموعة على الجليد.
  5. إضافة ميليلتر 8.5 من مزيج الرئيسي ربط كل من عينات الحمض النووي الريبي FFPE فردياً الكوتيد 18، بلطف نفض الغبار الأنابيب، أجهزة الطرد المركزي 2 s، ومخزن على الجليد.
  6. تذويب 2.5 مختبرين ميليلتر من كل من المراقب المحولات 3 ' 18، ووضعها على الجليد إذابة الثلج لمدة 20 دقيقة.
    1. استخدام ماصة 3-ميليلتر نقل 1 ميليلتر لكل محول إلى عينات "الحمض النووي الريبي فب" المقابلة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي ومزيج الرئيسي ربط (أي، ميليلتر 9.5 + 8.5 ميليلتر).
    2. لا "الماصة؛" صعودا وهبوطاً، ببساطة الاستغناء عن إلى السائل وسحب الحافة. تأكد من تغيير نصائح بين عينات "الحمض النووي الريبي فب". قم بإغلاق كل أنبوبة، ونفض الغبار إلى المزيج، الطرد المركزي 2 s، وتعيين على الجليد.
  7. تؤذي ردود الفعل بوضع أنابيب 18 على كتلة حرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ومن ثم ضع فورا على الجليد.
  8. إعداد الحل إنزيم ربط بتمييع ميليلتر 10 T4 K227Q مبتوراً رنا ليجاسى 2 مع 10 ميليلتر الحرة رناسي المياه في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 طازجة سيليكونيزيد.
  9. استخدم ماصة ميليلتر 3 لتحويل 1 ميليلتر من إنزيم ربط المخفف إلى كل من عينات الحمض النووي الريبي 18 (لا "الماصة؛" صعودا وهبوطاً، وتغيير نصائح بين كل أنبوبة). تعيين ليجيشنز 18 على الجليد، ووضع في غرفة باردة 4 درجة مئوية لتفريخ بين عشية وضحاها ح 18.

3-تنقية الكشف الصغيرة الواصلة

  1. إلغاء تنشيط ردود الفعل ربط بوضع أنابيب 18 لمدة 1 دقيقة على كتلة حرارة عند 90 درجة مئوية، وثم العودة للجليد لمدة 2 دقيقة على الأقل ليبرد.
  2. إعداد مزيج ماجستير هطول الأمطار بإضافة 1 ميليلتر من الصبغة الزرقاء مرتبطة تساهمي الجليكوجين إلى 26 ميليلتر من كلوريد الصوديوم 5 م رناسي خالية في أنبوب ميكروسينتريفوجي سيليكونيزيد جديدة.
    1. نقل ميليلتر 1.2 من مزيج ماجستير هطول الأمطار في كل من هذه الأنابيب 18. إضافة ميليلتر 63 من الإيثانول 100% لكل من الأنابيب 18. قم بإغلاق كل أنبوبة، ونفض الغبار للمزيج، الطرد المركزي 2 s، ومكان هذه الأنابيب على الجليد. دمج محتويات جميع الأنابيب 18 في أنبوب واحد مل 1.5 سيليكونيزيد.
    2. إغلاق الأنبوب، عكس ثلاث مرات إلى المزيج، وأجهزة الطرد المركزي 2 s، ومكان على الجليد لمدة 60 دقيقة التعجيل.
  3. إعداد كبيرة (16 x 20 سم2) 15% polyacrylamide هلام للصفحة.
    1. اثنين الصب سيليكونيزيد ألواح الزجاج (تعامل مع بديلاً أمنا للطلاء سيلاني) مع الفواصل 0.1 سم.
    2. الجمع بين 9 مل من نظام مخفف، مل 18 من 12 ميليلتر من تيميد في أنبوب 50 مل و 240 ميليلتر لوكالة الأنباء الجزائرية (9%)، تركيز نظام ومل 3 من المخزن المؤقت للنظام.
    3. نقل حل جل صفحة ما بين ألواح الزجاج باستخدام ماصة 30 مل، وإدراج مشط 14-جيدا (0.1 سم) والسماح للهلام يصلب على RT لمدة 30 دقيقة.
  4. الطرد المركزي أنبوب 1.5 مل مع ليجاتيونس المجمعة في 16,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  5. إزالة المشط. تنظيف الآبار تماما مع المياه خالية من رناسي باستخدام زجاجة بخ مع تلميح 200 ميليلتر في نهايته لتصل إلى داخل الآبار وقوة الأمم المتحدة مبلمرة الاكريلاميد بها (بئر واحدة في كل مرة) أعلاه المصارف. تعيين 15% الصفحة على جهاز هلام، ملء الخزانات مع 0.5 × الحل بورات تريس يدتا (TBE)، وقبل تشغيل هلام لمدة 30 دقيقة في 450 الخامس.
  6. استرداد الأنبوب مع ليجيشنز المجمعة من أجهزة الطرد المركزي والجافة بعناية بيليه الحمض النووي الريبي.
    1. إزالة المادة طافية مع تلميح ماصة 1 مل ولكن ترك بعض السائل في الجزء السفلي. إمالة الأنبوب واستخدام ماصة 20 مل لإزالة المادة طافية المتبقية دون لمس بيليه. فراغ شفط الأنبوبة باستخدام ماصة باستور مع تلميح 10 ميليلتر في نهايته، دون لمس بيليه.
    2. ريسوسبيند بيليه الجيش الملكي النيبالي في 20 ميليلتر من المياه خالية من رناسي خلال يسددها الأنبوب. إضافة 20 ميليلتر من جل PAA تحميل حل ريسوسبيند الجيش الملكي النيبالي، ونفض الغبار لخلط، وأجهزة الطرد المركزي ل 2 سبت RT، وتعيين الأنبوب في 90 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ومن ثم ضع فورا على الجليد.
  7. X TBE استبدال 0.5 جهاز جل مع علامات حجم x TBE، وتحميل السلم، 0.5 طازجة وميرناس الواصلة في وسط الهلام، ترك الآبار 2-فارغة على كلا الجانبين (الشكل 2).
  8. تشغيل الهلام في 450 الخامس (35 mA) لمدة 60 دقيقة، إيقاف تشغيل لمدة 10 دقيقة تبرد، ثم تشغيل مرة أخرى على 520 الخامس (25 mA) لآخر 60 دقيقة أونكاست 15% الصفحة عن طريق إزالة واحدة من ألواح الزجاج.
  9. طفيفة رذاذ هلام يجلس على لوحة الزجاج مع الحل صبغة الفلورسنت (10 ميليلتر) في 25 مل 0.5 x TBE، واسمحوا الجلوس شقة لمدة 5 دقائق في الظلام.
  10. الزجاج على عاتق الهلام في ترانسيلوميناتور ضوء أزرق، ومحاذاة كلا 19 nt و nt حجم علامات 24 بمسطرة المباشرة ختان الكشف الصغيرة الواصلة (الشكل 2). المكوس الهلام.
  11. ضع جل قصت في أنبوب 0.5 مل، تهدف إلى تفتيت شرائح هلام، المتمركزة بشكل أمن في أنبوب 1.5 مل سيليكونيزيد ميكروسينتريفوجي. الطرد المركزي في س 16,000 ز لمدة 3 دقائق في "الرايت ريسوسبيند" هلام مجزأة مع 300 ميليلتر من 400 ملم محلول كلوريد الصوديوم وإغلاق الأنبوب، وختم ذلك مع الفيلم البارافين.
  12. تعيين الأنبوب في التحريض على ثيرموميكسير 1,100 لفة في الدقيقة في غرفة باردة 4 درجة مئوية لحضانة بين عشية وضحاها (ح 16-17).

4-ربط محول 5 '

  1. نقل الحل وجل مجزأة إلى عامل تصفية 5 ميكرومتر أنبوب يجلس في أنبوب 1.5 مل سيليكونيزيد وختم مع الفيلم البارافين والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2,300 س ز والرايت
  2. إضافة 950 ميليلتر من الإيثانول 100% إلى الحل الذي تم تصفيته، وإغلاق الأنبوب، عكس للمزيج، الطرد المركزي 2 s، ختم الأنبوب مع الفيلم البارافين، وتعيين على الجليد ح 1.
  3. إعداد 12 ٪ هلام الصفحة كما هو موضح في الخطوة 3، 3، ولكن الجمع بين 12.6 مل مخفف، 14.4 مل تركيز، 3 مل من المخزن المؤقت و 240 ميليلتر APS 12 ميليلتر من تيميد في أنبوب 50 مل. قبل تشغيل 12% هلام الصفحة لمدة 30 دقيقة في 450 الخامس (~ 35 mA) في 0.5 x TBE.
  4. الطرد المركزي حل الجيش الملكي النيبالي الصغيرة المنقاة في 16,000 س ز لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. بدقة "الماصة؛" من المادة طافية باستخدام ماصة 1 مل إزالة الجزء الأكبر الحل واستخدام ماصة 200 مل لإزالة الحل المتبقي، دون لمس بيليه.
  6. بعناية باستخدام ماصة باستور مع تلميح 10 مل في نهايته متصلاً قارورة فراغ، جاف بيليه دون لمسها.
  7. ريسوسبيند بيليه في 9 ميليلتر من المياه خالية من رناسي دون بيبيتينج صعودا وهبوطاً، ولكن بخفة يسددها الأنبوب، الطرد المركزي 2 s، ومجموعة الأنبوب على الجليد.
  8. إعداد 10 × الطازجة "رنا ليجاسى العازلة" (مع ATP) عن طريق الجمع بين 500 ميليلتر من 1 م تريس درجة الحموضة 7.5، 100 ميليلتر من 1 م MgCl2، 50 ميليلتر من 20 ملغ/مل أسيتيلاتيد جيش صرب البوسنة، ميليلتر 200 ملم 10 ATP، ميليلتر 7 من 2-mercaptoethanol م 14 ، و 143 ميليلتر من المياه خالية من رناسي.
  9. مزيج 10 × الجيش الملكي النيبالي ليجاسى العازلة (مع ATP) بالتحريك الأنبوب، والطرد المركزي ل 2 s لجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  10. إعداد عملية ربط محول 5 'بإضافة ميليلتر 2 من 10 × الجيش الملكي النيبالي ليجاسى العازلة (مع ATP)، 1 ميليلتر من 100 ميكرومتر 5' محول، و 6 ميليلتر 50% مائي [دمس] إلى ميليلتر 9، 3 ' المراقب حل الجيش الملكي النيبالي الصغيرة.
  11. نفض الغبار أنبوب طفيفة للمزيج، الطرد المركزي 2 s لجمع الحل، ضع الأنبوبة في كتلة حرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ومرة أخرى على الجليد لمدة 2 دقيقة على الأقل.
  12. إضافة 2 ميليلتر من T4 رنا ليجاسى 1 إلى الحل (لا "الماصة؛" صعودا وهبوطاً)، نفض الغبار الأنبوب الطرد المركزي 2 s، والجلوس الأنبوب في العائمة رفوف في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  13. في نفس الوقت، إعداد ليجاتيونس اثنين بين 19 nt-3 'المحول والمحول 5'، وهما ليجاتيونس بين 24 nt-3 'المحول والمحول 5'.
    1. الجمع بين 2 ميليلتر من 19nt-3 'محول (250 نانوغرام/ميليلتر) أو nt 24-3' محول (250 نانوغرام/ميليلتر) مع: 2 ميليلتر من 5 ' المحول (100 ميكرومتر)، 2 ميليلتر من 10 × الجيش الملكي النيبالي ليجاسى العازلة (مع ATP)، ميليلتر 6 من 50% مائي [دمس]، 6 ميليلتر من المياه خالية من رناسي ، و 2 ميليلتر من T4 رنا ليجاسى 1 في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل سيليكونيزيد.
    2. نفض الغبار أنابيب للمزيج، الطرد المركزي 2 s، ومجموعة الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  14. إضافة 20 ميليلتر من "المخزن المؤقت يشوه جزء من الكمية المسندة" إلى جميع ليجيشنز (تنقية صغيرة الكشف، ليجيشنز 2 19nt-3 'المحول، وليجيشنز 2 24nt-3' محول).
    1. ميكس بالتحريك الأنابيب، وأجهزة الطرد المركزي ل 2 s، واحتضان هذه الأنابيب على كتلة حرارة عند 90 درجة مئوية للحد الأدنى 1 نقل جميع الأنابيب الجليد، وإعداد سلم (3 مل سلم مع 20 ميليلتر من PAA).
  15. إفراغ الخزان العلوي لجهاز جل مع قبل تشغيل الصفحة جل 12%، وإضافة جديدة حل x TBE 0.5 أدنى من مستوى الآبار (آبار إفراغ مع ماصة نصيحة طويلة ورقيقة).
    1. تحميل العينات مع تلميح ماصة رقيقة، كما هو موضح في الشكل 3.
    2. X TBE استخدام 0.5 الطازجة لملء الآبار الفردية إلى الجزء العلوي من الجل.
    3. إضافة 0.5 الطازجة x TBE إلى خزان فوق الآبار وابدأ التفريد 12% الصفحة لمدة 60 دقيقة في 450 الخامس (~ 35 mA).
    4. إيقاف التشغيل بإطفاء مولد لمدة 10 دقيقة لتبرد الهلام. إعادة تشغيل المولدات الكهربائية وتشغيل هلام لمدة 60 دقيقة في 520 الخامس (~ 25 mA).
  16. إيقاف المولد وإفراغ الخزانات بعكس الجهاز فوق بالوعة أونكاست 12% الصفحة عن طريق إزالة واحدة من ألواح الزجاج.
  17. الجلوس على الزجاج مع هلام شقة، ورذاذ الهلام مع 10 ميليلتر من صبغة الفلورسنت في 25 مل 0.5 x TBE، واحتضان في الظلام للحد الأدنى 5 على عاتق الزجاج الهلام في ترانسيلوميناتور ضوء أزرق، ومحاذاة كلا 19 nt وكلاهما 24 nt حجم العلامات مع مسطرة المباشرة ختان الكشف الصغيرة الواصلة (الشكل 3).
    1. المكوس الجل ونقل قطعة جل قصت في أنبوب الكسارة جل 0.5 مل. أغلق غطاء أنبوب الكسارة هلام، تعيين في أنبوب 1.5 مل سيليكونيزيد ميكروسينتريفوجي، وآمنة مع الفيلم البارافين. إزالة أنبوب الكسارة هلام، إضافة 300 ميليلتر من 300 ملم كلوريد الصوديوم، و 1 ميليلتر من 100 ميكرومتر 3 ' PCR التمهيدي للقطع جل سحقت في أنبوب 1.5 مل.
    2. إغلاق الأنبوب مع الفيلم البارافين في التحريض على ثيرموميكسير 1,100 لفة في الدقيقة في 4 درجات مئوية، بين عشية وضحاها (ح 17 – 18) في غرفة باردة.

5-عكس النسخ من 5 'متصلة و 3' المراقب تنقية صغيرة الكشف

  1. استرداد الأنبوب من ثيرموميكسير وتصفية تنقية الحل مع أنبوب تصفية 5 ميكرومتر.
    1. استخدام ماصة 1 مل لنقل الحل إلى أنبوب تصفية 5 ميكرومتر إدراجها 1.5 مل siliconized أنبوب جمع رناسي مجاناً. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 3 دقائق في 2,300 س ز والرايت
    2. تجاهل الأنبوبة التصفية وإضافة 950 ميليلتر من الإيثانول 100% إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جمع الأنبوب الذي يحتوي على الحل التي تمت تصفيتها. عكس أنبوب لمزيج، وأجهزة الطرد المركزي 2 s، ومكان على الجليد ل 60 دقيقة متسرعا بيليه الجيش الملكي النيبالي سينتريفوجينج الأنبوبة في 16,000 س ز و 4 درجات مئوية عن ح 1.
  2. جاف بيليه الجيش الملكي النيبالي.
    1. فتح الغطاء وإزالة المادة طافية مع ماصة 1 مل، تاركة بعض السائل في الجزء السفلي بعناية.
    2. استخدام ماصة 20 ميليلتر لإزالة جميع المادة طافية المتبقية دون لمس بيليه. إمالة على أنبوب للسماح لأي حل للجلوس على الجانب المعاكس لبيليه.
    3. استخدام ماصة باستور مع تلميح فلتر ماصة 10 مل لنضح المادة طافية وجاف بيليه استخدام فراغ.
  3. ريسوسبيند بيليه الجيش الملكي النيبالي في ميليلتر 5.6 المياه خالية من رناسي.
    1. تذويب الكواشف النسخ العكسي على الجليد للحد الأدنى 15 مجموعة تصل إلى رد فعل عكسي نسخ بإضافة 3 ميليلتر من 5 x المخزن المؤقت، 4.2 ميليلتر من 10 x deoxynucleotide ثلاثي الفوسفات (دنتبس) (كل 2 مم)، و 1.5 ميليلتر من ديثيوثريتول (DTT) إلى ميليلتر 5.6 رناسي الحرة بيليه حراكه.
    2. بلطف نفض الغبار على أنبوب لخلط رد فعل، والطرد المركزي ل 2 s لجمع الحل. قم بإعداد رد فعل على كتلة حرارة عند 90 درجة مئوية للضبط 30 ثانية وثم نقل مباشرة على ثيرموميكسير في 50 درجة مئوية.
    3. ترك الأنبوب في ثيرموميكسير لمدة 2 دقيقة بحيث يساوي درجة الحرارة. إضافة ميليلتر 0.75 إنزيم النسخ العكسي مباشرة إلى الحل، ونفض الغبار برفق لخلط ومجموعة الأنبوب مرة أخرى على ثيرموميكسير عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة فورا.
  4. وبعد 30 دقيقة، نقل الأنبوب إلى كتلة حرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لإيقاف النسخ العكسي. إضافة ميليلتر 95 من المياه خالية من رناسي مباشرة للنسخ العكسي ونفض الغبار على أنبوب لخلط ووضعه مباشرة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  5. قم بتسمية الأنبوب مع كدنا معرف "مكتبة المخزون" ومكتبة.

6-رائد بكر وعلى نطاق واسع [بكر] تضخيم

  1. إعداد المخزن المؤقت x PCR 10 جديدة بإضافة ميليلتر 304 من المياه خالية من رناسي، ميليلتر 125 2 م بوكل، 50 ميليلتر من 1 م تريس pH 8.0، 10 ميليلتر مجكل م 12, 5 ميليلتر من 1% تريتون ميليلتر X-100، و 6 من 1 م 2-mercaptoethanol في أنبوب ميكروسينتريفوجي سيليكونيزيد ، والحفاظ على الرايت
  2. تجميع رد "بكر الطيار" من خلال الجمع بين 67 ميليلتر من المياه خالية من رناسي و 10 ميليلتر من 10 x PCR المخزن المؤقت, 10 ميليلتر 10 x dNTPs، 0.5 ميليلتر من 100 ميكرومتر 5 'PCR التمهيدي، 0.5 ميليلتر من 100 ميكرومتر 3' PCR التمهيدي، 10 ميليلتر من كدنا "مكتبة المخزون" 2 ميليلتر من 50 x Taq بوليميراز.
    1. إعداد اثنان دورات بكر على ثيرموسيكلير على النحو التالي: ملف 1:94 ° ج ل 45 ثانية، 50 درجة مئوية ل 85 s، و 72 درجة مئوية ل 60 s لعشر دورات، عقد في 4 درجات مئوية؛ ملف 2:94 ° ج ل 45 ثانية، 50 درجة مئوية ل 85 s، و 72 درجة مئوية ل 60 s لدورتين، عقد في 4 درجات مئوية. إعداد رد "بكر الطيار" في ثيرموسيكلير والبدء في 1 ملف.
    2. في نهاية الملف 1، فتح الأنبوب PCR، واستخدام ماصة 20 ميليلتر، نقل 12 ميليلتر من رد فعل "بكر الطيار" في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل يحتوي على 3 ميليلتر من 5 س جل تحميل صبغ، مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، إغلاق الأنبوب ، قم بتسميته "10 دورات".
    3. أغلق أنبوب "بكر الطيار" وبدء ملف 2 في ثيرموسيكلير. في نهاية الملف 2، فتح أنبوب بكر واستخدام ماصة 20 مل لنقل 12 ميليلتر من الحل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع 3 ميليلتر من 5 س جل تحميل صبغ، وتسميته "12 دورة".
    4. كرر الخطوات الموضحة في الخطوات 6.2.2 و 6.2.3 لجمع 12 منتجات PCR ميليلتر من رد فعل "بكر الطيار" في دورات بكر 14، 16 و 18 و 20. إضافة 3 ميليلتر من 5 × صبغ تحميل جل لكل من مختبرين بكر ميليلتر 12، وسلم nt 20 التي تحتوي على 3 ميليلتر من سلم وميليلتر 9 المياه خالية من رناسي.
  3. تعد نسبة 2.5% [اغروس] هلام مع 0.5 x TBE.
    1. تزن 2.5 g من [اغروس] في كوب نظيف وإضافة 100 مل 0.5 x TBE. الحل في ميكروويف يسخن حتى يغلي. إزالة الحل من الموجات الدقيقة، ودوامه زجاجة مزيج في [اغروس] وإضافة 4 ميكروليتر اثيديوم بروميد (10 مغ/مل)، ونقل الحل إلى علبة التفريد2 7 × 10 سم، مغلقة على طرفي مع الشريط.
    2. تعيين مشط 8-جيدا وترك [اغروس] هلام يصلب في نقل الرايت طدت [اغروس] هلام في جهاز التفريد مليئة 0.5 x TBE.
  4. تحميل سلم والعينات [بكر] على [اغروس] هلام، وتشغيله لمدة 30 دقيقة في 120 الخامس.
  5. تقييم الجل على مربع الأشعة فوق البنفسجية لتحديد دورة بكر الأمثل (الشكل 4 أ).
    ملاحظة: يظهر حجم العصابات PCR المتوقعة في الشكل 4B.
    1. مراقبة عصابات بكر اثنين في كل من الآبار المختلفة (الشريط العلوي: مكتبة الحمض النووي، والشريط السفلي: مبلمر).
    2. تعريف دورة PCR كافية للتضخيم كدنا بتحديد دورة حيث المكتبة كدنا مرئياً، ولكن يتم مبلمر الكاد يمكن ملاحظتها.
      ملاحظة: عموما، يتم تحديد دورة PCR كاف بين دورات 12 – 16. في الشكل 4A، دورة PCR كافية لهذه المكتبة هو 14.
  6. إعداد ردود فعل واسعة النطاق بكر (6 x 100 ميليلتر) ل [اغروس] هلام مكتبة تنقية.
    1. إعداد أنبوب طازجة من 10 × PCR المخزن المؤقت بعد الخطوة 6، 1.
    2. إعداد مزيج PCR الرئيسية على نطاق واسع في أنبوب 1.5 مل من خلال الجمع بين ميليلتر 435.5 خالية رناسي المياه، 65 ميليلتر من المخزن المؤقت x PCR 10، 65 ميليلتر من x dNTPs 10، ميليلتر 3.25 من 5 'PCR التمهيدي، ميليلتر 3.25 3' PCR التمهيدي، وبيبيتينج صعودا وهبوطاً لمزيج.
    3. نقل ميليلتر 88 من مزيج PCR الرئيسية إلى ست أنابيب PCR 0.5 مل. نقل 10 ميليلتر من كدنا "مكتبة المخزون" (المخزنة على الجليد) وإضافة 2 ميليلتر من 50 x Taq بوليميراز في كل من أنابيب PCR 6 "الماصة؛" إلى المزيج.
    4. إعداد أنبوب تفاعل PCR سلبي عن طريق الجمع بين ميليلتر 77 خالية رناسي المياه 10 ميليلتر من المخزن المؤقت x PCR 10، 10 ميليلتر من 10 x dNTPs، 0.5 ميليلتر من PCR التمهيدي 5 '، 0.5 ميليلتر من PCR التمهيدي 3' و 2 ميليلتر من 50 x Taq بوليميريز، وماصة لمزيج.
    5. وضع أنابيب PCR في ثيرموسيكلير استخدام دورة PCR الموضحة في الخطوة 6.2.1 وتعيين العدد الأمثل لدورات التضخيم. إعداد 2.5% [اغروس] هلام استخدام 0.5 x TBE، كما هو موضح في الخطوة 6.3.
  7. بعد التضخيم بكر، نقل ميليلتر 9 من كل أنبوبة PCR إلى ست أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل يحتوي على 3 ميليلتر من 5 س جل تحميل صبغ.
    1. إعداد 20 nt سلم بالجمع بين 3 مل سلم في ميليلتر 9 المياه خالية من رناسي وإضافة 3 ميليلتر هلام تحميل صبغ في أنبوب 1.5 مل.
    2. تحميل السلم ومراقبة PCR سلبي ومنتجات PCR 6 على [اغروس] هلام، وتشغيل هلام لمدة 30 دقيقة في 120 الخامس.
    3. التحقق من اتساق إيضاحات مسهبة بكر بين الممرات على مربع الأشعة فوق البنفسجية (خذ صورة).
    4. الجمع بين 3 ردود الفعل PCR في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل siliconized اثنين (3 × 91 ميليلتر)، إضافة 27 ميليلتر من 5 م كلوريد الصوديوم و 950 ميليلتر من الإيثانول 100%. عكس هذه الأنابيب لخلط ومجموعة منهم في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها يعجل بمنتجات PCR.

7-كدنا تنقية المكتبة والتقييم

  1. الطرد المركزي سواء أنابيب مع ردود الفعل بكر في 16,000 س ز لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. إزالة المادة طافية مع ماصة 1 مل، ثم إمالة الأنبوب مع بيليه على الجانب العلوي والسائل على الجانب السفلي، واستخدم ماصة باستور متصلاً قارورة فراغ مع حوض ونضح السائل مع تلميح 10 مل في نهاية ماصة باستور.
  3. قم بإعداد ملخص بميي.
    1. ريسوسبيند واحد من الكريات PCR مع 17.5 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس، ونقل ريسوسبينديد بيليه بيليه PCR الثانية. إضافة 2 ميليلتر من 10 × المخزن المؤقت و 0.5 ميليلتر من الإنزيم بميي، والخلاصة في حمام مائي ح 2 في 37 درجة مئوية.
    2. إعداد 2.5% [اغروس] هلام استخدام 0.5 x TBE (الخطوة 6.3). إضافة ميليلتر 6 من 5 × صبغ تحميل جل للخلاصة. نقل 13 ميليلتر من كل خلاصة في الآبار المجاورة اثنين من [اغروس] هلام وتحميل سلم حجم nt 20 في نهاية الآبار وتشغيل هلام لمدة 90 دقيقة في 150 الخامس (الشكل 4).
    3. المكوس العصابات بكر العلوي من الجل على مربع الأشعة فوق البنفسجية ونقل القطع جل في أنبوب ميكروسينتريفوجي طازجة وزنه 1.5 مل وتزن قطعة هلام على نطاق.
  4. تنقية قصت PCR كدنا تضخيم المكتبة باستخدام مجموعة أدوات استخراج جل اتباع إرشادات الشركة المصنعة. تحديد حجم كدنا المكتبة باستخدام الحمض النووي التحليل الكمي والصك، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  5. تقييم حجم ونقاء المكتبة كدنا مع رقاقة الحمض النووي حساسية عالية على بيواناليزير (الشكل 5). تسلسل كدنا المكتبة باستخدام نظام الفائق. نقل ملف البيانات فستق بخط أنابيب رناوورلد لمحول التشذيب والمحاذاة للجينوم البشري لتحديد تسلسل ميرنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو موضح في أسلوب هنا، ما مجموعة 18 عينات "الحمض النووي الريبي فب" الفردية (100 نانوغرام كل) تم إعدادها في أنابيب منفصلة للخضوع 3 ' أدينيلاتيد المراقب اليغنوكليوتيد T4 ربط بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، التفاعلات الانزيمية هي الحرارة المعطلة، جنبا إلى جنب، وعجلت في أنبوب واحد. هو حراكه بيليه الجيش الملكي النيبالي، ويتم فصل جزيئات الحمض النووي الريبي الواصلة على 15 ٪ يشوه polyacrylamide هلام (صفحة)، حيث تستخدم علامات حجم اليغنوكليوتيد الحمض النووي الريبي التي تم ترحيلها في الآبار المجاورة لجل صفحة، لتحديد حجم مناسب 3 ' المراقب الكشف الصغيرة (الشكل 2). هو المحتضنة قطعة جل قصت في محلول كلوريد الصوديوم بين عشية وضحاها الوتي جزيئات الحمض النووي الريبي الواصلة. في اليوم التالي، هو عجل التيد الجيش الملكي النيبالي، وتتم محول ربط 5 '. ثم، 5 'محول متصلة الصغيرة الحمض النووي الريبي الجزيئات يتم ترحيل وفصل في هلام اكريلاميد 12%، مرة أخرى تم ترحيلها النوكليوتيد علامة في حجم الجيش الملكي النيبالي تسمح فيها الختان الكشف صغيرة الحجم تحتوي على المراقب النوكليوتيد 3' و 5 ' المحول ( 3 الشكل). هو جل قصت المحتضنة بين عشية وضحاها في محلول كلوريد الصوديوم للسماح شطف من الجيش الملكي النيبالي. في اليوم التالي، هي عجلت جزيئات الرنا الصغيرة الواصلة، وبيليه هو حراكه في المياه خالية من رناسي، تليها عكس-النسخ؛ قاسمة من جزيئات كدنا يخضع لفعل بكر تجريبية (الشكل 4 أ). إعداد ردود بكر على نطاق واسع استخدام الإدخال نفسه لمكتبات كدنا وتقييمها على 2.5% [اغروس] هلام للتحقق من أن جميع ردود الفعل على نحو كاف [بكر] تضخيم (الشكل 4 باء)، وقبل تجميع وبين عشية وضحاها الإيثانول هطول الأمطار. اليوم التالي، كدنا تضخيم المكتبة التي تحتوي على كافة المكتبات الفردية 18 لعينات "الحمض النووي الريبي فب" فريدة من نوعها 18، يتم ترحيل نسبة 2.5% [اغروس] هلام، وأعلى PCR الفرقة، ويعمل في 100 nt اقتطعت وتنقيته (الشكل 4). ثم يتم تقييم تنقية مكتبة كدنا على رقاقة الحمض النووي حساسية عالية (الشكل 5) لتحديد أن المنتج بكر المنقي لا تحتوي على فائض مبلمر أو مشتقات أخرى من تفاعل PCR. ثم يتم تحليل PCR المنتج على نظام تسلسل الفائق. محول التشذيب وتوليد ملفات فردية 18 لكل من العينات 18 يتم تنفيذها باستخدام خط أنابيب رناوورلد (الوصول قدم لنا الدكتور توماس توشل). ثم تجري تحاليل بيوستاتيستيكال لتقييم محتويات ميرنا العينات من "الحمض النووي الريبي فب".

الأمثل للتحقق من صحة هذا الإجراء، يقابل الطازجة المجمدة وعينات الورم الثدي فب استخدمت للتحليلات (الشكل 6). اثنين مماثلة واختيرت أورام الثدي الأقنية الغازية سرطان (IDC) لتقييم حساسية الإجراءات وتحديد إذا كان يمكن أيضا الكشف عن ميرنا التعبير الاختلافات المحددة بين الأنسجة المجمدة الطازجة اثنين في يقابل أرشفة فب عينات من الحمض النووي الريبي. لهذه التجربة، وتقييم نوعية الإجمالي كان الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من 2 الطازجة المجمدة وعينات الحمض النووي الريبي FFPE اثنين متطابقة (الشكل 6A). كما كان متوقعا، حجم الجيش الملكي النيبالي، ونوعية العينات FFPE شدة انخفض بالمقارنة مع الكشف مجمدة طازجة المتطابقة (قارن حارات 1 و 3، والممرات 2 و 4). واحد من "الجيش الملكي النيبالي فب" قد تم أرشفتها في RT لمدة 4 سنوات (الثدي الغازية السرطان 1، (IBC1)) وأخرى قد تم أرشفتها في RT لمدة 8 سنوات (IBC2)، بينما نظيراتها المجمدة الطازجة قد تم تخزينها في-80 درجة مئوية. تم تحليل عينات الحمض النووي الريبي الفردية الأربعة في مكتبة واحدة، استخدام الرموز الشريطية الفردية 4، وميرنا قراءة توزيع قطع الأراضي المعروضة في الشكل 6B. عرض رأس فريقي ميرنا التعبير العلاقة بين الورم مجمدة طازجة اثنين الكشف ونظرائهم عينات "الحمض النووي الريبي فب" محددة. القطع مطابقة بين الطازجة المجمدة وميرناس فب تشير إلى أن إعداد مكتبة كدنا ينص إمكانية تكرار نتائج جيدة كما يمكن أن يلاحظ وجود ارتباط عال بين ميرناس اكتشف في العينات التي تتم معالجتها بشكل مختلف (المجمدة مقابل FFPE). فريقي أقل عرض العلاقة بين البيانات التعبير ميرنا من الأورام المجمدة مختلفة اثنين وبين الأورام FFPE مختلفة اثنين. كما هو مبين في الشكل 6، كانت ترتبط الاختلافات التعبير ميرنا حددت بين الأورام مجمدة طازجة اثنين مع الاختلافات اكتشاف بين العينات الورم FFPE المتطابقة اثنين. كانت أهمية ميرنا التعبير الاختلافات يمكن كشفها سواء طازجة مجمدة والأورام فب.

لمواصلة تقييم الحساسية لهذا النهج، استخدمت البيانات التعبير ميرنا من 12 عينات FFPE المؤرشفة وعينات الحمض النووي الريبي مجمدة طازجة 4 (الشكل 6). وكانت عينات الحمض النووي الريبي مختلفة 16 فردياً 3 ' المراقب وكلها تستخدم لإعداد مكتبة كدنا واحد. عينات الحمض النووي الريبي المستخدمة في خطوط الخلايا الثدي هما مكتبة شملت هذه MCF10A (خط الخلية مثل عادي) و MCF7 (خط خلية سرطان الثدي) مع الحمض النووي الريبي من خلايا جديدة ومن بهم المؤرشفة FFPE النظراء23، يقابل مجمدة طازجة وعينات "الحمض النووي الريبي فب" من سرطان الثدي هما عينات تم تحليلها بشكل مستقل (IBC1 و IBC2 في الشكل 6 ألف و 6 باء)، ويقابل مجمدة طازجة وعينات "الحمض النووي الريبي فب" من عينات عنق الرحم العادية (Cx). بالإضافة إلى ذلك، تم تحليل عينات FFPE المؤرشفة من العادي (Br1 الطبيعي والعادي Br2 Br3 العادية)، وسرطان أنسجة الثدي (IBC 5 و 6 الحاوية، و IBC 7)، دون نظرائهم المجمدة الطازجة. وكما لوحظ في heatmap، بغض النظر عن الطازجة المجمدة أو "الحمض النووي الريبي فب" الأصل، ميرنا التعبير لمحات من نفس الخلايا (MCF10 أو MCF7)، أو الأنسجة نفسها (IBC1، IBC2، أو معادل) تتجمع معا. بالإضافة إلى ذلك، وكما لوحظ في الكتلة غير خاضعة للرقابة، من اليسار إلى اليمين، الثدي الطبيعي الخلايا والأنسجة التي تتجمع معا بينما أورام الثدي والخلايا السرطانية متفاوت على الحق. تجمع أنسجة عنق الرحم، الذي عرض ملف تعريف تعبير ميرنا مختلفة، على حق heatmap.

إذ ترى أن معظم العينات FFPE سريرياً المؤرشفة ليس لها نظراء مجمدة طازجة ولكن أن هم يمكن استرجاعها بعد مدة تخزين مختلفة، كان سعى لتحديد ما إذا كان بروتوكول إعداد مكتبة كدنا الأمثل الواجب التطبيق و قابل لإعادة الإنتاج مع العينات فب متزايدة من كبار السن. كما يظهر في الشكل 7، ميرنا التعبير لمحات من الأنسجة FFPE المؤرشفة ل 18، 20، 22، 27، تم الحصول على 30 و 35 عاماً. انتزع الجيش الملكي النيبالي باستخدام الحمض النووي الريبي/الحمض النووي متزامنة الأمثل الداخلي21، ومختبرين رنا كوادروبليت من كل عينة FFPE الفردية أعدت في نفس اليوم والمخزنة في-80 درجة مئوية قبل مكتبة الأعمال التحضيرية. تم تحليل ما مجموعة 9 عينات FFPE مختلفة في التكرار، حيث كان كل قاسمة الحمض النووي الريبي فردية متصلة مع النوكليوتيد المراقب مختلفة (المجموع 18 الباركود)، داخل نفس المكتبة. وتكررت هذه التجربة خلال أسبوعين متتاليين (الأسبوع 1 و 2 في الأسبوع). وهذا يسمح بتقييم إمكانية تكرار إعداد مكتبة كدنا نتائج مع عينات الحمض النووي الريبي نفس استخدام اثنين من الرموز الشريطية مختلفة داخل مكتبة واحدة، وبين اثنين من مكتبات مختلفة مع فاصل زمني لمدة أسبوع واحد. وكما لاحظت في الشكل 7، معامل الارتباط ظل فوق 0.96 بغض النظر عن سن العينة أو الأسبوع إعداد مكتبة؛ ولذلك، يوفر البروتوكول إعداد مكتبة كدنا الأمثل أداة قوية لاستنساخه بتحليل العينات فب بغض النظر عن وقتهم المحفوظات، على سبيل المثال، رنا FFPE المؤرشفة عمرها 35 سنة (انظر الثدي #9) عرض التدابير استنساخه عالية مكافئة لتلك التي لوحظت مع عينات "الحمض النووي الريبي فب" 20 عاماً (انظر الثدي #3).

Figure 1
رقم 1: النوكليوتيد. ويرد وصف جميع اليغنوكليوتيد متواليات والتعديلات الكيميائية المقابلة، والتركيزات المستخدمة في هذا البروتوكول. يرد وصف أنواع التعديلات الكيميائية في مربع التعديل ويختصر التعديلات المعروضة في تسلسل اليغنوكليوتيد. معايرة كوكتيل يعرض قائمة 10 الفردية رنا اليغنوكليوتيد آلة لفرز، التي كانت حراكه في محلول يحتوي على اليغنوكليوتيد الناقل (0.5 ميكرومتر). ثمانية عشر 3 ' المراقب اليغنوكليوتيد المحولات مفصلة مع تظليل رمادي على تسلسل للرمز الشريطي. تسلسل الحمض النووي الريبي للمحول 5 '، وتسلسل الحمض النووي 3' 5 '، بكر وبكر كبسولة تفجير بالتفصيل. تسلسل الحمض النووي الريبي النوكليوتيد ماركر حجم اثنين، هما المشار إليها في البروتوكول ك nt 19-3 'محول و nt 24-3' علامات حجم المحول، وتقدم. وتم شراء جميع النوكليوتيد الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي تجارياً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تنقية صفحة من عينات الحمض النووي الريبي المراقب 3 '- بعد تجميع ويعجل بالعينات المراقب رنا 18، بيليه الجيش الملكي النيبالي ريسوسبينديد هو ترحيل ومفصولة بالتفريد على اكريلاميد 15% جل (انظر 8 أيضا). الساحة الحمراء يسلط الضوء على المنطقة التي تحتوي 3 ' ميكرورناس المراقب، التي اقتطعت بشفرة المبضع وتحويلها إلى أنبوب خالية من نوكلياسي ميكروسينتريفوجي سيليكونيزيد. مجموعة من أربعة آبار، مع اثنين تحتوي على 19 nt-3 'محول واثنين تحتوي على 24 nt-3' تم تعيين المحول جيدا بعيداً، في كل جانب من المكتبة (انظر الآبار 5 و 6، و 10 و 11، على التوالي). كاختبار للحمض النووي الريبي T4 ليجاسى 1 وتنقية من حجم الواصلة إكمال علامات لتكون في اليوم التالي، ربط ردود الفعل التي تحتوي على 19 nt-3 'علامة حجم المحول مع المحول 5' و nt 24-3 'تم تشغيل محول حجم علامة مع محول 5' في الآبار 2 د 3، على التوالي. عرض المربعات الصفراء العصابات قصت تمثل النوكليوتيد الحمض النووي الريبي علامة الواصلة الحجم مع محول 5 '. تنقية هذه العصابات وعجل وتشغيل 12% خلال تنقية صفحة (انظر الشكل 3 أدناه). 1 الآبار و 13 تحتوي على سلم حجم nt 20، مما ساعد على تأكيد الأحجام المتوقعة من المنتجات الواصلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تنقية صفحة المكتبة المنقي بعد عملية ربط محول 5 '- مكتبة الجيش الملكي النيبالي المنقي كانت متصلة مع محول 5 ' وقد اقتطعت حجم الناتج المتوقع من 12% الصفحة باستخدام علامات حجم الواصلة (انظر مربع أحمر). منتجات ليجيشنز رنا T4 بين 19 nt-3 'المحول والمحول 5' (الآبار 4 و 9) وبين 24 nt-3 'المحول والمحول 5' (الآبار 5 و 10) تم تشغيلها في نفس الوقت، على كل من جانبي كذلك يحتوي على الحمض النووي الريبي مكتبة. النطاقات العليا (انظر النجمة البيضاء) هي منتجات عملية ربط محول 5 'وتستخدم كالدليل للختان الفرقة جل يحتوي على 5' محول متصلة مكتبة الجيش الملكي النيبالي. يتم تشغيل عملية ربط حجم علامة ربط منتجات تنقية في الصفحة السابقة في 3 جيدا. كما لوحظ في الآبار 1 و 12، كان أيضا تشغيل nt 20 حجم سلم للتحقق من الحجم المتوقع من المكتبة الحمض النووي الريبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الطيار بكر والتضخيم على نطاق واسع من المكتبة كدنا. تم تقييم حجم ونسبة من منتجات PCR على 2.5% [اغروس] هلام حضور اثيديوم بروميد. (أ) بعد النسخ العكسي لمكتبة المراقب الجيش الملكي النيبالي، وقاسمه المكتبة كدنا اتسع نطاق استخدام الإشعال PCR 5 'و 3' في رد فعل PCR تجريبية واحدة. تم الحصول على دورات 10، 12، 14، 16، 18، و 20 مختبرين ردود الفعل بكر التجريبية وهاجر على 2.5% [اغروس] هلام. كما لاحظ بين 1 و 7 آبار، وجود dimers مكتبة ومحول كدنا كان يمكن ملاحظتها أضعافاً مضاعفة (انظر المستطيلات الخضراء). وكان دورة PCR المحدد لتضخيم المكتبة كدنا لهذه المكتبة، 15. (ب) هذا التخطيطي يعرض الموقف وطول النوكليوتيد مختلفة ومنتجات الجيش الملكي النيبالي والحمض النووي الناجم عن ذلك، التي يمكن تمييزها عن المواد الهلامية صفحة و [اغروس]. (ج) مختبرين 6 على نطاق واسع PCR ردود الفعل (المحددة في A) حللت كل على حدة على 2.5% [اغروس] هلام (انظر الآبار 3 إلى 8). هذين النوعين من المنتجات بكر، إلا وهي المكتبة (الشريط العلوي) و dimers الإشعال (الشريط السفلي) مرئية على هذا جل (انظر الأخضر مستطيلات). تفاعل PCR فارغة دون كدنا يعرض أي تضخيم بكر (انظر كذلك 2). سلم حجم nt 20 يسمح لتحقق أحجام المنتج (انظر 1 جيدا). هلام (د) الصورة في ترانسيلوميناتور ضوء أزرق 2.5% [اغروس] هلام يحتوي على ردود فعل PCR المجمعة ركض في اثنين من الآبار المجاورة. كما لاحظ، الفرقة أعلى في كلا الآبار ضمن حجم مكتبة المتوقعة والفرقة ديمر المحول الموجود أدناه. اقتطعت العصابات بكر العلوي وتنقيته مع مجموعة أدوات استخراج هلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تقييم بكر المنقي تضخيم الحمض النووي مكتبة. ويتم تحليل قاسمة صغيرة (1 ميليلتر) مكتبة كدنا تضخيم PCR باستخدام رقاقة الحمض النووي حساسية عالية على منصة المستندة إلى ميكروفلويديكس. (أ) هذا الفريق تعرض هجرة علامات الحجم للمعايرة للصك. (ب) هذا الفريق تعرض هجرة المكتبة كدنا تضخيم بكر المنقي. أعلى ذروة يقاس بحجم 100 شركة بريتيش بتروليوم (انظر العلامة النجمية) وتمثل المكتبة كدنا. ذروة صغيرة تقييمها في 72 شركة بريتيش بتروليوم بالصك يمثل محول مبلمر. ذروة bp 100 بالكشف عن ميكروفلويديكس على أساس منهاج يكشف الحجم المقدر للمكتبة كدنا تضخيم، والذي يحتوي على 18 عينات الحمض النووي الريبي المراقب الفردية خ ع اللاحقة على نظام تسلسل الفائق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: إعداد مكتبة كدنا واستخدام تسلسل الجيل القادم مطابقة العينات البارافين الطازجة المجمدة والفورمالين--ثابت مضمن. (أ) "مجموع من الحمض النووي الريبي" المستخرج من مطابقة الطازجة المجمدة، وقد تم تحليل أورام سرطان الأقنية الغازية (IDC) فب على رقاقة الحمض النووي الريبي مجموع على منصة ميكروفلويديكس على أساس. (ب) "مجموع الجيش الملكي النيبالي" من الطازجة المتطابقة المجمدة وعينات FFPE (1 الحَوسة و IBC2) قد خضع كدنا المكتبة إعداد البروتوكول وتم رسم البيانات تسلسل ميرنا. (ج) التعبير ديفيرينتيالميرنا بين العينات IBC1/IBC2 والارتباط بين المجمدة وإقران FFPE العينات. يتم عرض التعبير ميرنا في العد سجل كل مليون (CPM)، من عالية إلى منخفضة على ما يلي (الأحمر إلى اللون الأزرق). يتم عرض أهمية التعبير الفرق بين أزواج اثنين من الأنسجة، الواحدة ميرنا، دوائر رمادية، مع التعبير عالية ومنخفضة ميرناس المحددة في عينات فب والطازجة. (د) "مجموع من الحمض النووي الريبي" المستخرج من الطازجة المتطابقة وعينات "الحمض النووي الريبي فب" الثدي خلية خطوط (MCF10A و MCF7)، البشرية الغازية السرطان (IBC 1 و IBC2)، سرطان عنق الرحم أنسجة الثدي (Cx)، أرشفة أنسجة الثدي الطبيعي (Br1 الطبيعي والعادي Br2 والعادية فرع 3)، و وخضع سرطان الثدي الغازية المؤرشفة (IBC 5 و 6 الحَوسة و IBC7) إعداد مكتبة كدنا داخل المدى نفسه. يتم عرض بيانات خ ع ميرناس الكشف عنها في المكتبات في تكوين خريطة حرارة. وقد تم تعديل هذا الرقم من لودج et al. 20 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: كدنا المكتبة إعداد وميرنا التعبير العلاقة بين replicates استخدام كبار السن أرشفة العينات فب. وخضع مجموع الجيش الملكي النيبالي من 18، 20، 22، 27 و 30 و 35 عاماً المؤرشفة FFPE عينات الأنسجة الثدي لدينا بروتوكول إعداد مكتبة كدنا الأمثل. كانت متصلة مع المراقب النوكليوتيد مختلفة 3 ' تكرار عينات الحمض النووي الريبي من 9 عينات FFPE مختلفة وتحليلها داخل نفس المكتبة في الأسبوع 1 (w1). وتكرر نفس التجربة ضمن فاصل زمني مدته أسبوع واحد (الأسبوع 2 أو w2). يتم عرض المقاييس إمكانية تكرار نتائج ميرنا تكرار التعبير البيانات بين عينات الحمض النووي الريبي المؤرشفة نفسه في heatmaps ومع معاملات الارتباط التي قيمت 0.93 بين 0.99. وقد تم تعديل هذا الرقم من لودج et al. 20 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويرد بروتوكول إعداد مكتبة خ ع الكشف الصغيرة المؤرشفة في عينات من الحمض النووي الريبي FFPE كدنا استنساخه للغاية وقوية في هذا البروتوكول، الذي نسخة معدلة ومحسنة من الإجراء الموضح هافنر et al. 22

لقد تم تحسين جميع الخطوات من هذا البروتوكول للاستخدام مع كبار السن المؤرشفة والشبهة مجموع الجيش الملكي النيبالي المستردة من العينات فب. أن الخطوة الرئيسية لهذا البروتوكول، لتجهيز كميات صغيرة من "الحمض النووي الريبي فب"، يقيم في تجميع جميع عينات الحمض النووي الريبي (أي، 100 الفردية 18 نغ رنا FFPE عينات) بعد ليجيشنز الفردية مع المراقب محولات فريدة من نوعها 3 ' 18. تسمح هذه الخطوة الحاسمة لعينات "الحمض النووي الريبي فب" 18 الخضوع موحد لجميع اللاحقة الكيميائية الحيوية والانزيميه اتخاذ الخطوات اللازمة لإعداد مكتبة كدنا رنا الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، هذه الخطوة يزيد كمية الحمض النووي الريبي تمر الرواسب وتنقية جل تعزيز تأثير الناقل من جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة وتيسير بيليه المراقبة وهلام التحديدات. هناك سمة رئيسية أخرى لهذا البروتوكول، الذي يبرز براعة عند العمل مع كميات صغيرة من "الحمض النووي الريبي فب" كذلك، هو أن يستخدم فعل بكر تجريبية لتحديد دورة التضخيم الأمثل للمكتبة كدنا. هذه الخطوة أيضا يوفر نظرة ثاقبة ديناميات التضخيم مكتبة مقابل التضخيم ديمر التمهيدي، الذي حاسم عند إعداد رد فعل بكر واسعة النطاق وتنقية المكتبة رنا الصغيرة على [اغروس] هلام. وتظهر البيانات يضاف إلى هذا البروتوكول إمكانية تكرار نتائج هذا النهج بين مطابقة المجمدة والعينات فب، وأيضا تسليط الضوء على تطبيقه لكبار السن "فب الحمض النووي الريبي" عينات من العينات المحفوظة ليصل إلى 35 عاماً.

تم تعديل هذا البروتوكول من النسخة الأصلية، حيث أنه هو الأمثل لإعداد مكتبات الحمض النووي الريبي الصغيرة المصنوعة من انخفاض نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي FFPE معدلة كيميائيا والشبهة. أحد جوانب هذا الإجراء التي تم تعديلها بنجاح سد وتضخيم الكشف صغيرة من عينات FFPE يتصل بالمبلغ لمعايرة كوكتيل ارتفعت خلال الأولية 3 ' ربط محول المراقب، الذي تم تخفيض المدخلات إلى 0.026 شمال البحر الأبيض المتوسط لمنع المنافسة مع الربط أبوندانسي المنخفض الحالي الكشف الصغيرة في عينات "الحمض النووي الريبي فب". وكان تعديلاً هاما آخر للإجراء الأصلي لإزالة جميع بالاشعاع المسمى الحجم-علامات تستخدم أثناء اختيار الكشف الصغيرة الواصلة على المواد الهلامية الصفحة. استخدام هذه العلامات-الحجم راديولابيليد انطباق هذا النهج لا تقتصر إلى مختبرات معتمدة لاستخدام النظائر المشعة ولكن منعت أيضا مراقبة المنتجات الجيش الملكي النيبالي على المواد الهلامية. بدلاً من ذلك، في هذا البروتوكول الأمثل، هي علامات حجم تشغيل في الآبار المجاورة للمكتبة، وفي جل صفحة، وتصور مباشرة مع صبغة فلورسنت مباشرة ختان الكشف الصغيرة الواصلة. الأهم من ذلك، صبغة الفلورسنت رش طفيفة في جل لمنع نشر المنتجات الجيش الملكي النيبالي وتصور ثم في مربع ضوء أزرق. في وقت لاحق، كتدبير وقائي وتحسين نشر الكشف الصغيرة الواصلة الواردة في الصفحة قصت جل الشظايا، تستخدم أنابيب هلام الكسارة لسحق موحد الجل قبل الحضانة في محلول كلوريد الصوديوم بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تحت التحريض. تم تقييم جميع هذه الخطوات بعناية للعمل مع كميات صغيرة من المواد.

تم تطبيق هذا البروتوكول على عينات "الحمض النووي الريبي فب" من مصادر مختلفة (الهيئات والمؤسسات) التي تم تخزينها لكميات مختلفة من الوقت. وكشفت التحليلات إمكانية تكرار نتائج عالية من تسلسل الكشف صغير من العينات الطازجة والمجمدة، عند استخدام هذا الإجراء في أفضل صورة. كذلك أظهرت تحاليل إضافية باستخدام أقدم العينات FFPE المؤرشفة، تخزين تصل إلى 35 عاماً، انطباق البروتوكول الواسعة للعينات السريرية. أبدى الحد الأدنى من المتطلبات الإدخال FFPE الحمض النووي الريبي للعينات فب أن تكون 100 نانوغرام. هذا الشرط منخفضة يتيح إمكانية تطبيق هذا البروتوكول على مجموعة متنوعة من الآفات ذات أحجام مختلفة وتوافر، ولكن أنها لن تسمح لتحليل خلية مفردة FFPE الجيش الملكي النيبالي. من المهم أن نلاحظ، بيد أن هذا البروتوكول الأمثل قد استخدمت أيضا مع مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من تعميم اكسوسوميس مع مدخلات من أقل من 1 نانوغرام وسيظهر لتقديم ملامح التعبير رنا الصغيرة استنساخه بدرجة عالية (البيانات لا تظهر). هذا الإدخال المنخفضة تشير إلى أن الكشف الصغيرة في عينات فب، على الرغم من أن الممثل أنسجة جديدة الأصلي وموجودة في كثيرا نسب أقل مما في مجموع الجيش الملكي النيبالي من تعميم اكسوسوميس.

ووجد في العمل مؤخرا، حيث تم تطبيق هذا البروتوكول الأمثل لتصنيف سريرياً FFPE دسيس العينات، أن الاختلافات التعبير ميرنا حددها خ ع مكتبة كدنا يمكن أن يقرها PCR الكمي. هذا العمل أثبتت جدوى استخدام الآفات دسيس من الأنسجة المحفوظة في الأرشيف من مختلف المؤسسات للدراسات الاستعادية على نطاق واسع [20]. وأبرزت هذه الدراسة أيضا متانة هذا إعداد مكتبة كدنا عندما يؤديها في أوقات مختلفة (على فترات من عدة أسابيع)، دون المساس بإمكانية تكرار نتائج وحساسية المقايسة.

ونظرا للكمية الهائلة من العينات FFPE المؤرشفة السرية سريرياً، يوفر هذا البروتوكول الأمثل أداة قوية لإعداد مكتبات كدنا في تحليل استعادي على نطاق واسع وتحديد المؤشرات الحيوية ميرنا المحتملة المرتبطة بالسرطان التنمية21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تود أن تكشف عن أن منشورا يحتوي على بعض البيانات المعروضة في هذه المخطوطة نشرت في "المجلة الدولية للعلوم الجزيئية" لودج et al. 21.

Acknowledgments

ونحن نشكر الدكتور توماس توشل، رئيس مختبر البيولوجيا الجزيئية الجيش الملكي النيبالي، وكذلك أعضاء مختبرة لدعمهم وتقاسم التكنولوجيا المتقدمة في المختبر وتوفير إمكانية الوصول إلى خط الأنابيب رناوورلد. كما نشكر الدكتور ماركوس هافنر لتقاسم له البروتوكول وتقديم وصف مفصل على جميع الخطوات البيوكيميائية والانزيميه المستخدمة في الإجراءات الأولية له.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).

Tags

علم الوراثة، 135 قضية، الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ البارافين، المتدهورة FFPE رنا، رنا المتدهورة، ميكرورنا، الجيل التالي التسلسل، كدنا مكتبة، والتقدير الكمي، [بكر] تضخيم، ربط الحمض النووي الريبي T4، الصفحة، الجيش الملكي النيبالي
تسلسل ميكرورنا أثر رجعي: الحمض النووي التكميلية المكتبة إعداد بروتوكول باستخدام عينات الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الحمض النووي الريبي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loudig, O., Liu, C., Rohan, T.,… More

Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter