Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57471
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 3, 4
1Department of Research, Hackensack University Medical Center, 2Department of Medical Sciences, Seton Hall University, 3Department of Epidemiology and Population Health, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Nephrology and Hypertension, Hadassah - Hebrew University Medical Center

Summary

Формалин Исправлена парафин врезанных образцы представляют собой ценный источник молекулярных биомаркеров заболеваний человека. Здесь мы представляем на базе лаборатории cDNA библиотека подготовки протокола, первоначально разработанный с свежий замороженные РНК и оптимизирован для анализа архивных микроРНК из тканей хранится до 35 лет.

Abstract

-Архив, клинически классифицированы формалин Исправлена парафин врезанных тканей (FFPE) может обеспечить нуклеиновые кислоты для ретроспективных молекулярных исследований развития рака. С помощью неинвазивных или предварительно злокачественных поражений от пациентов, которые позже развивать инвазивное заболевание, анализ выражения гена может помочь определить ранние молекулярных изменений, которые предрасполагают к риск рака. Хорошо описал, что нуклеиновые кислоты, оправился от FFPE тканей претерпели серьезный физический ущерб и химические изменения, которые затрудняют их анализ и обычно требует адаптации анализов. МикроРНК (интерферирующим), однако, которые представляют собой небольшой класс молекул РНК, охватывающих только до ~ 18 – 24 нуклеотидов, было показано, чтобы выдерживать длительного хранения и успешно проанализирован в FFPE образцах. Здесь мы представляем 3' перепутываются взаимодополняющих ДНК — (cDNA кДНК) библиотеки подготовка протокола специально оптимизирована для анализа малых РНК, извлеченные из архивных тканей, который был недавно продемонстрирован быть надежной и высокую воспроизводимость при использовании Архив Клинические образцы хранятся до 35 лет. Эта библиотека подготовка хорошо приспособлены к мультиплекс анализ под угрозой деградации материала где лигируют с отдельными 3' перепутываются адаптеры и затем объединить вместе для последующего ферментативные и биохимических препаратов образцов РНК (до 18) Перед анализом. Электрофорез геля полиакриламида (страница), которая позволяет размер конкретным критериям и обогащения перепутываются малых РНК видов выполняются все очищения. Эта подготовка кДНК библиотеки хорошо приспособлены к минута РНК входы, как экспериментальный полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет определять конкретные усилители цикла производить оптимальное количество материала для следующего поколения последовательности (НГС). Этот подход был оптимизирован для использования деградированных FFPE РНК от образцов архивирован до 35 лет и обеспечивает высокую воспроизводимость данных NGS.

Introduction

интерферирующим удивительно хорошо сохраняются в формалин Исправлена парафин врезанных (FFPE) образцов1,2,3. Предыдущая работа продемонстрировала, что выражение этих коротких регулирования-кодирования одного мель молекул РНК может быть успешно оцениваются с помощью всего РНК из образцов FFPE и предоставить соответствующий ген выражение данных по сравнению с оригинальной свежие ткани4,5,6,,78. По сравнению с большого размера messenger РНК, которые показали критически пострадать от FFPE обработки тканей (формальдегид, тепла, сушки и т.д.), эндогенных полиадениновый и возраст образцов, небольшой размер интерферирующим (~ 18 – 24 нуклеотидов) появляется, чтобы сделать их устойчивыми к деградации и устойчивыми для длительного хранения, также продемонстрировал через Мирна выражение исследований, которые превосходят высок объём мРНК исследования в архивных образцов9. Мирна выражение исследования с использованием архивных клинических образцов, которые выполнялись главным образом в небольших анализов, показал что сингл или мультиплексированных количественные анализы ПЦР, различные виды технологии microarray дна и совсем недавно NGS можно использоваться для оценки выражение сохранились интерферирующим после оптимизации этих анализов10,11,12,,1314.

Учитывая, что регуляции экспрессии Мирна был связан с разработкой целого ряда злокачественных опухолей человека и что потенциально существует огромное количество клинически аннотированной архивных образцов, очевидно, что эти малые РНК молекулы представляют собой перспективный источник потенциального рака Биомаркеры15,16,17,18. Использование технологий выражение гена высокой пропускной способности, таких как NGS имеет преимущество обеспечения глобальной оценки всех Мирна стенограмм, по сравнению с целевые технологии, такие как ПЦР или microarrays19. По этой причине оптимизированная, доступным и легко применимым протокол кДНК библиотеки подготовке малых РНК от старых архивных образцов для NGS был оптимизирован для включения крупных ретроспективных исследований20.

Ранее мы создали одновременно протокол извлечения РНК/ДНК для отдельных восстановления ДНК и РНК из старых архивных образцов, которые мы нашли, чтобы превзойти современные коммерческие наборы21. Используя этот протокол извлечения для получения всего РНК из FFPE тканей в Архив для длительного периода времени, мы оптимизировали подготовку кДНК библиотек для NGS адаптивной, сохранились в клинических образцах до 35 лет. Кроме того в недавно опубликованном исследовании, где мы подготовили кДНК библиотек от клинически секретной протоковой карциномы в situ (DCIS) образцов, мы определили дифференциально выраженной адаптивной, которые были подтверждены количественного PCR, который указал что конкретные Мирна выражения изменения могут быть обнаруживаемыми в DCIS поражения от пациентов, которые развитие рака молочной железы по сравнению с DCIS поражения от пациентов, которые не развиваться рак молочной железы.

Учитывая стоимость коммерческих комплекты для подготовки малых РНК кДНК библиотек, потенциал для их прекращения, а также использование защищенных авторским правом/патент реагентов, которые не могут быть оптимизированы мы решили адаптировать ранее опубликованные на базе лаборатории и бесплатный комплект 3' перепутываются cDNA библиотека подготовки протокола для NGS малых РНК, архивируются в FFPE образцах, позволяя одновременный анализ 18 образцов22. Этот протокол обеспечивает идеальное и надежные пошаговую процедуру с визуальной и технической оценки контрольно-пропускные пункты, имеющие важное значение для адаптации к FFPE РНК образцов, и имеет большой потенциал для применения к другим источникам нарушенной или трудно чтобы использовать материал РНК. Оригинального протокола применимость была улучшена, заменив радиоактивно помечены размер маркеров флуоресцентные (например, SYBR золото) обнаружить РНК размер маркеров во время отбора перевязаны библиотек на больших полиакриламидных гелей. Этот оптимизированный протокол основывается на перевязку 3' перепутываются адаптеры для 18 отдельных образцов FFPE РНК, которые затем объединить вместе, чтобы пройти 5' адаптер перевязки, реверс транскрипции и экспериментальный анализ ПЦР для специально амплификация cDNA окончательный Библиотека до крупномасштабных амплификации PCR, очистки и NGS на секвенсор высокой пропускной способности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. подготовка всех реагентов и праймеры

  1. Заказывайте все грунты и адаптеры, как описано в рисунке 1.
  2. Подготовьте калибратора коктейль складе, который будет шипами в каждой индивидуальной перевязки.
    1. Ресуспензируйте перевозчик олигонуклеотида (рис. 1) до 0,5 мкм с РНКазы свободной воды. Ресуспензируйте 10 калибратор олигонуклеотиды (рис. 1) до 100 мкм с помощью решения олигонуклеотида перевозчик 0,5 мкм.
    2. Комбинат 10 мкл каждого из 10 калибраторов в силицированного microcentrifuge получить 100 мкм коктейль калибратор запас и подготовить 0,026 Нм решение для хранения при температуре-20 ° C.
  3. Разбавьте 20 уникальных, лиофилизированные, adenylated 3' адаптеры РНКазы свободной водой до конечной концентрации 50 мкм (рис. 1).
    Примечание: Рекомендуется подготовить 2,5 мкл аликвоты от каждого адаптера в отдельных силицированного трубы и хранить их при температуре-80 ° C на срок до 2 лет.
  4. Ресуспензируйте обессоленной 19 nt-3' адаптер и 24 nt-3' адаптер размер маркера олигонуклеотиды 250 нг/мл (рис. 1).
  5. Ресуспензируйте ВЭЖХ очищенная 5' адаптер до 100 мкм с РНКазы свободной воды. Ресуспензируйте 5' и 3' праймеры PCR до 100 мкм с помощью РНКазы свободной воды (рис. 1).
    Примечание: Алиготе все олигонуклеотиды в количествах, необходимых для 1 – 2 экспериментов и хранить при температуре-80 ° C.
  6. Подготовка полиакриламида Денатурирующий гель (ПАА) Загрузка краситель, объединяя формамид 98,8%, 1% (v/v) 0,5 М Na2H2 ЭДТА, pH 8.0 и 0,2% бромфеноловый синий и отложите 1 мл аликвоты-80 ° c.
    1. Подготовьте решение ЭДТА 0,5 М Na2H2 , добавив 18.6 g порошка Na2H2 ЭДТА в 50 мл воды, свободной от нуклеиназы. Добавление NaOH гранулы для достижения рН 8,0. Отрегулируйте громкость до 100 мл для получения 0,5 М Na2H2 ЭДТА, рН 8,0 Стоковый раствор.
    2. Вес 15 мг бромфеноловый синий в отдельном 15 мл. 600 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Добавьте деионизированной формамид 14.25 мл. 150 мкл 0,5 М Na2H2 ЭДТА, рН 8.0 решение.
    3. Алиготе ПАА окончательное решение по 15 мл в 1 мл аликвоты-80 ° c.
  7. Подготовить 5 x геля агарозы загрузки краситель, объединяя 0,2% бромфеноловый синий, 0,2% ксилола cyanol FF, 50 мм Na2H2 ЭДТА, рН 8,0 и 20% Ficoll тип-400.
    1. Ресуспензируйте 1,86 г Na2H2-ЭДТА в 50 мл воды, свободной от нуклеиназы в 400 мл стакан на магнитной мешалкой при комнатной температуре (RT). Добавление NaOH гранулы для достижения рН 8.0. Добавьте нуклеиназы свободной воды до 100 мл для получения 50 мм Na2H2 ЭДТА решения.
    2. Вес 20 мг порошка бромфеноловый синий, 20 мг ксилол cyanol FF порошка и 2 г порошка типа Ficoll-400 и Ресуспензируйте в 5 мл 50 мм Na2H2 ЭДТА.
    3. Вихревой трубка, содержащая три краски и добавьте 5 мл 50 мм Na2H2 ЭДТА. Mix красителя 5 Загрузка гель x agarose, готовить 1 мл аликвоты и хранить при температуре-80 ° C.

2. Установите перешнуровок перепутываются адаптер 3' с 18 отдельных РНК образцов

  1. Определить 18 отдельных образцов РНК (pre-aliquoted 100 нг в 9,5 мкл нуклеиназы свободной воды в 1,5 мл силиконизированный microcentrifuge трубы) и установить трубы на льду для размораживания за 10 мин.
  2. Подготовка 10 x буфер лигаза РНК (без АТФ) свежие.
    1. В 1,5 мл силиконизированный microcentrifuge трубку объединить 343 мкл РНКазы свободной воды, 500 мкл трис 1 М рН 7,5, 100 мкл MgCl 1 М2, 50 мкл альбумина bovine сыворотки 20 мг/мл и 7 мкл 14 M 2-меркаптоэтанол. Микс, стряхивая трубки, центрифуги для 2 s 2000 x g и RT и установить на льду.
      Примечание: Все шаги в настоящем Протоколе, которые указывают «центрифуга для 2 s» выполняются в benchtop microcentrifuge RT и максимальная скорость 2000 x g собирать решения в нижней части трубы.
  3. Подготовить 50% Водный ДМСО фондовой, добавив 1 мл РНКазы свободной воды по 1 мл ДМСО в пробки microcentrifuge 2 мл силиконизированный, обернуть трубу в алюминиевой фольги и хранить на RT.
  4. Размораживание 0,026 Нм калибратор коктейль на льду на 10 мин подготовить лигирование Мастер микс путем объединения в следующем порядке в пробки microcentrifuge 1,5 мл силиконизированный: 40 мкл 10 x буфер лигаза РНК и 120 мкл 50% водного раствора с помощью пипетки 200 мл ДМСО , и 10 мкл 0,026 Нм калибратора коктейль с помощью пипетки 10 мкл. Флик 1,5 мл трубки mix, центрифуги для 2 s и набор его на льду.
  5. 8.5 мкл лигирование Мастер микс для каждого из 18 индивидуально aliquoted образцов FFPE РНК, мягко проведите трубок, центрифуги для 2 s и магазин на льду.
  6. Размораживание 2,5 мкл аликвоты каждого из 18, 3' перепутываются адаптеров и разместить их на льду для размораживания 20 мин.
    1. Использование 3-мкл пипетки для передачи 1 мкл каждого адаптера соответствующие образцы FFPE РНК, содержащие РНК и перевязка Мастер микс (то есть, 9,5 мкл + 8,5 мкл).
    2. Не Пипетка вверх и вниз, просто обойтись в жидкость и вытащить кончик. Убедитесь в том изменить советы между образцами FFPE РНК. Закрыть каждую пробирку, Флик смешивать, центрифуги для 2 s и установить на льду.
  7. Денатурируйте реакции, поместив 18 трубок на тепла блок на 90 ° C за 1 мин и затем немедленно разместить на льду.
  8. Приготовляют раствор фермента лигирование путем разбавления 10 мкл усеченного T4 K227Q РНК лигаза 2 с 10 мкл РНКазы свободной воды в пробки microcentrifuge свежие 1,5 мл силиконизированный.
  9. Используйте 3 мкл пипетки для передачи 1 мкл разбавленного лигирование фермента в каждый из 18 проб РНК (не Пипетка вверх и вниз и изменить советы между каждой трубы). Установите 18 перешнуровок на льду и место в холодной комнате 4 ° C для ночи инкубации 18 h.

3. Очистка перевязаны малых РНК

  1. Деактивировать реакции перешнуровки, поместив 18 трубок для 1 мин на тепла блок на 90 ° C, а затем вернуться на лед для по крайней мере 2 минут остыть.
  2. Подготовьте осадков Мастер микс, добавив 1 мкл синего красителя, ковалентно связан с гликогена в 26 мкл 5 M РНКазы свободный NaCl в свежий силицированного microcentrifuge трубку.
    1. Перевод 1.2 мкл осадков Мастер микс на каждый из 18 трубок. Мкл 63 100% этанола в каждую из 18 трубок. Закрыть каждую пробирку, жестом пролистывания mix, центрифуги для 2 s и место трубы на льду. Объединяйте содержимое всех 18 трубок в одном 1,5 мл силиконизированный трубку.
    2. Закрыть трубку, инвертировать три раза, чтобы смесь, центрифуги для 2 s и место на льду на 60 минут, чтобы осадок.
  3. Подготовьте крупных геля полиакриламида 15% (16 x 20 см2) для страницы.
    1. Литой две силиконизированный стеклянные пластины (лечение с безопасной альтернативой силана покрытия) с прокладками 0,1 см.
    2. Объединить 9 мл разбавителя системы, 18 мл концентрата системы, 3 мл буферной системы, 240 мкл APS (9%), и 12 мкл TEMED в 50 мл трубки.
    3. Передача решения гелем страницы между стеклянные пластины с помощью пипетки 30 мл, вставить гребень 14-а (толщиной 0,1 см) и пусть гель затвердеть на RT 30 мин.
  4. Центрифуга для 1.5 мл трубки с пуле перешнуровок на 16000 x g и 4 ° C на 60 мин.
  5. Снимите насадку. Очистите колодцы совершенно бесплатно РНКазы водой, используя шприц бутылку с 200 мкл Совет на своем конце достичь внутри скважины и силы ООН полимеризованной акриламида выше раковина (один хорошо в то время). Набор 15% страницы на аппарат гель, заполните водохранилища с 0.5 x трис-Борат ЭДТА (КЭ) решение и предварительно запустить гель для 30 мин в 450 V.
  6. Восстановить трубу с пуле перешнуровок из центрифуги и тщательно высушить гранулы РНК.
    1. Удалить супернатант с кончиком пипетки 1 мл, но оставить некоторые жидкости в нижней. Наклона трубки и использовать пипетку 20 мл для удаления оставшихся супернатант без касатьться гранулы. Вакуумного всасывания трубку с помощью пипетки Пастера с наконечником 10-мкл на ее конце, не касаясь гранулы.
    2. Ресуспензируйте Пелле РНК в 20 мкл РНКазы свободной воды, стряхивая трубки. 20 мкл ПАА гель загрузки решения Ресуспензируйте РНК, Флик смешивать, центрифуги для 2 СБ RT и установите трубку на 90 ºC за 1 мин и затем немедленно разместить на льду.
  7. X TBE заменить 0,5 лари аппарата с свежими 0.5 x TBE и нагрузки по лестнице, размер маркеров и перевязаны интерферирующим в центре геля, оставляя 2-пустой скважин с обеих сторон (рис. 2).
  8. Побегите гель на 450 V (35 мА) для 60 мин, приостановить запуск 10 минут остыть, и снова запустить в 520 V (25 мА) для другой 60 мин Uncast 15% страницы путем удаления одной из стеклянных пластин.
  9. Слегка спрей гель, сидя на стеклянной пластине с раствором (10 мкл) Люминесцентная краска в 25 мл 0,5 х кэ и пусть это сидеть квартира для 5 мин в темноте.
  10. Положите стекло с гелем на синий свет transilluminator и выровнять оба 19 nt и 24 nt размер маркеров с правителем направлять иссечение перевязаны малых РНК (рис. 2). Акцизный геля.
  11. Место подакцизным гель в 0,5 мл трубку, призванных фрагмент гель ломтиками, надежно закреплена в 1,5 мл силицированного microcentrifuge трубку. Центрифуга на 16000 x g 3 мин на RT. Ресуспензируйте фрагментированных гель с 300 мкл 400 мм раствор NaCl, закройте трубку и запечатать его с фильм парафина.
  12. Установите трубку на агитацию на thermomixer на 1100 об/мин в холодной комнате 4 ° C для ночи инкубации (16-17 h).

4. Перевязка адаптера 5'

  1. Передача решения и фрагментированных гель 5 мкм фильтром трубки, сидя в 1,5 мл силиконизированный трубки, печать с парафином фильм и центрифуги для 5 мин при 2300 x g и RT.
  2. 950 мкл 100% этанола в отфильтрованных решение, закрыть трубку, инвертировать смешанных, центрифуги для 2 s, печать трубку с парафином фильм и установить на льду за 1 час.
  3. Подготовка 12% геля страницы, как описано в шаге 3.3, но объединить 12.6 мл разбавителя, 14,4 мл концентрата, 3 мл буфера, 240 мкл APS и TEMED 12 мкл в 50 мл трубки. Предварительно запустить 12% гель страницы для 30 мин при 450 V (~ 35 мА) в 0,5 x TBE.
  4. Центрифуга очищенный малых РНК решение на 16000 x g 60 мин при 4 ° C.
  5. Тщательно Пипетка, супернатанта, с помощью пипетки 1 мл удалить основную часть решения и использовать пипетку 200 мл для удаления оставшихся решения, не касаясь гранулы.
  6. С помощью пипетки Пастера с 10 мл кончиком в его конце, подключенных к Склянка вакуума, тщательно высушите гранулы не касаясь его.
  7. Ресуспензируйте гранулы в 9 мкл РНКазы свободной воды без закупорить вверх и вниз, но в слегка стряхивая трубки, центрифуги для 2 s и набор трубку на льду.
  8. Подготовка 10 x свежие РНК лигаза буфера (АТФ), объединив 500 мкл 1 М трис рН 7,5, 100 мкл 1 M MgCl2, 50 мкл 20 мг/мл ацетилированные BSA, 200 мкл 10 мм АТФ, 7 мкл 2-меркаптоэтанол 14 M и 143 мкл РНКазы свободной воды.
  9. Смешать 10 x РНК лигаза буфера (АТФ), стряхивая трубки и центрифуги для 2 s для сбора раствора в нижней части трубки.
  10. Настройка лигирование адаптер 5', добавив 2 мкл 10 x РНК лигаза буфера (АТФ), 1 мкл 100 µM 5' адаптер, и 6 мкл 50% Водный ДМСО на 9 мкл, 3' перепутываются малых РНК решения.
  11. Флик трубки слегка перемешайте, центрифуги для 2 s для сбора раствора, поместите трубку на тепла блок на 90 ° C в течение 1 мин и обратно на льду для по крайней мере 2 мин.
  12. 2 мкл T4 РНК лигаза 1 в раствор (не Пипетка вверх и вниз), проведите трубки, центрифуги для 2 s и сидеть, трубку в плавающей стойку в ванну воды 37 ° C 60 мин.
  13. Одновременно, созданы два перешнуровок между 19 nt-3' адаптера и адаптера 5' и два перешнуровок между 24 nt-3' адаптера и адаптера 5'.
    1. Объединить 2 мкл 19nt-3 ' адаптер (250 нг/мкл) или 24 nt-3' адаптер (250 нг/мкл): 2 мкл 5' адаптера (100 мкм), 2 мкл 10 x РНК лигаза буфера (АТФ), 6 мкл 50% Водный ДМСО, 6 мкл РНКазы свободной воды и 2 мкл в пробки microcentrifuge 1,5 мл силиконизированный T4 РНК лигаза 1.
    2. Флик трубы для mix, центрифуги для 2 s и набор трубок при 37 ° C 60 мин.
  14. 20 мкл буфера денатурации ПАА для всех перешнуровок (очищенная малых РНК, 2 перешнуровок с 19nt-3' адаптер и 2 перешнуровок с 24nt-3' адаптер).
    1. Микс, стряхивая трубы, центрифуги для 2 s и инкубировать трубы на тепла блок на 90 ° C в течение 1 мин передачи все трубы в лед и подготовить лестницы (3 мл лестницы с 20 мкл ПАА).
  15. Пустой верхнего водохранилища гель аппарата с предварительного запуска 12% страница гель и добавить свежий раствор 0,5 x TBE ниже уровня скважин (с длинные, тонкие наконечник пипетки опорожняются скважин).
    1. Загрузите образцы с тонкой пипеткой кончиком, как описано в рисунке 3.
    2. Использовать свежие 0,5 x TBE для заполнения отдельных скважин в верхнюю часть геля.
    3. Добавить свежие 0,5 x TBE в резервуар выше скважин и начать электрофорез 12% страницы для 60 мин в 450 V (~ 35 мА).
    4. Приостановите запуск путем отключения генератора 10 минут для охлаждения геля. Перезагрузите генератор и Побегите гель для 60 мин на 520 V (~ 25 мА).
  16. Остановить генератор, пустые резервуары, инвертирование аппарат выше раковина и uncast 12% страницы путем удаления одной из стеклянных пластин.
  17. Сидят стекло с плоской гель, спрей гель с 10 мкл Люминесцентную краску в 25 мл 0,5 x TBE и инкубировать в темноте за 5 мин заложить стекло с гелем на синий свет transilluminator и привести в соответствие оба 19 nt и оба 24 nt размер маркеров с правитель направлять иссечение перевязаны малых РНК (рис. 3).
    1. Акцизный гель и передачи подакцизным гель кусок в трубку выключатель гель 0,5 мл. Закройте крышку геля выключатель трубки, установить в 1,5 мл силиконизированный microcentrifuge трубку и безопасной пленкой парафина. Снять трубку выключатель гель, добавьте 300 мкл 300 мм NaCl и 1 мкл 100 мкм 3' PCR праймер части измельченных гель в 1,5 мл.
    2. Уплотнение трубки с парафином фильм на агитацию на thermomixer на 1100 об/мин при 4 ° C, на ночь (17 – 18 ч) в холодной комнате.

5. Обратная транскрипция 5' лигируют и 3' перепутываются очищенного малых РНК

  1. Извлеките трубку из thermomixer и фильтр очистки раствора с трубки фильтр 5 мкм.
    1. Использование пипетки для передачи раствор на 5 мкм фильтр трубки вставляется в 1,5 мл 1 мл силиконизированный РНКазы бесплатная коллекция трубки. Центрифуга для трубки для 3 мин при 2300 x g и RT.
    2. Отменить фильтр трубки и добавить 950 µL 100% этанола в 1,5 мл microcentrifuge коллекции пробирку, содержащую отфильтрованный раствор. Инвертируйте трубки микс, центрифуги для 2 s и место на льду на 60 мин преципитат РНК Пелле центрифугированием трубки на 16000 x g и 4 ° C на 1 час.
  2. Сухие гранулы РНК.
    1. Откройте крышку и осторожно удалить супернатант с 1 мл пипетки, оставляя некоторые жидкости в нижней.
    2. Для удаления всех оставшихся супернатант без касатьться гранулы используйте 20 мкл пипетки. Наклона трубки разрешить любое решение сесть на противоположной стороне таблетки.
    3. Использование пипетки Пастера с наконечником нефильтрованное пипетки 10 мл аспирационная супернатант и высушить гранулы с помощью вакуума.
  3. Ресуспензируйте Пелле РНК в 5,6 мкл РНКазы свободной воды.
    1. Размораживание обратной транскрипции реагентов на льду на 15 мин набор вверх реакция обратной транскрипции, добавив 3 мкл 5 x буфер, 4.2 мкл 10 x deoxynucleotide аденозинтрифосфат (дНТФ) (каждый 2 мм) и 1,5 мкл Дитиотреитол (DTT) до 5,6 мкл РНКазы-Free ресуспензированы гранул.
    2. Осторожно проведите трубки для микширования реакции и центрифуги для 2 s собрать решение. Настройка реакции на тепла блок на 90 ° C для ровно 30 s и затем передачи прямо на thermomixer на 50 ° C.
    3. Оставьте трубки на thermomixer за 2 мин, чтобы выравнивает температуру. Мкл 0,75 фермента обратной транскрипции непосредственно в раствор, Флик осторожно, чтобы смешивать и набор трубку обратно на thermomixer при 50 ° C за 30 мин немедленно.
  4. После 30 мин передать трубку блока тепла на 95 ° C в течение 1 мин остановить обратной транскрипции. 95 мкл РНКазы свободной воды непосредственно к обратной транскрипции, Флик трубки смешивать и установить его прямо на льду на 2 мин.
  5. Этикетке трубки с идентификатором cDNA фондовой библиотека и библиотека.

6. пилот ПЦР и крупномасштабных ПЦР-амплификации

  1. Подготовьте свежие 10 x PCR буфера путем добавления 304 мкл РНКазы свободной воды, 125 мкл 2 м KCl, 50 мкл 1 М трис рН 8,0, 10 мкл MgCl 1 M2, 5 мкл 1% тритон X-100 и 6 мкл 1 M 2-меркаптоэтанол в силицированного microcentrifuge трубки и держать на RT.
  2. Соберите реакции PCR пилота, объединяя 67 мкл РНКазы свободной воды, 10 мкл 10 x буфер ПЦР, 10 мкл 10 x dNTPs, 0.5 мкл 100 µM 5' PCR праймер, 0.5 мкл 100 мкм 3' PCR праймер, 10 мкл cDNA фондовой библиотека и 2 мкл 50 x Taq полимеразы.
    1. Созданы два ПЦР циклов на Термоциклер следующим: файла 1: 94 ° C для 45 s, 50 ° C для 85 s и 72 ° C для 60 s для 10 циклов, удерживайте при температуре 4 ° C; Файл 2: 94 ° C для 45 s, 50 ° C для 85 s и 72 ° C для 60 s 2 циклов, удерживайте при 4 ° C. Настройка реакции PCR пилота в Термоциклер и запуск файлов 1.
    2. В конце файла 1 Откройте ПЦР-пробирку, и с помощью пипетки 20 мкл, передачи 12 мкл от реакции PCR пилота в пробки microcentrifuge 1,5 мл, содержащие 3 мкл 5 x гель загрузки краситель, смешивать, закупорить вверх и вниз, закрыть трубку и назвать его «10 циклов».
    3. Закройте экспериментального ПЦР-пробирку и запустите файл 2 на Термоциклер. В конце файла 2 открыть ПЦР-пробирку и использовать пипетку 20 мл для передачи 12 мкл раствора в microcentrifuge 1,5 мл пробирку с 3 мкл 5 x краситель гель загрузки и назвать его «12 циклов».
    4. Повторите шаги, описанные в шагах 6.2.2 и 6.2.3 собирать 12 продукты PCR мкл от реакции PCR пилот циклов PCR, 14, 16, 18 и 20. 3 мкл 5 x краситель гель загрузки для каждого из 12 аликвоты ПЦР мкл и 20 лестнице nt содержащие 3 мкл лестницы и 9 мкл РНКазы свободной воды.
  3. Подготовить 2,5% агарозном геле с 0,5 x TBE.
    1. Весят 2,5 g агарозы в чистый стакан и добавить 100 мл 0,5 x TBE. Нагревают раствор в микроволновую печь до тех пор, пока она кипит. Удаление решения из микроволновой печи, вихрем бутылки смесь агарозы, добавить 4 мкл бромид ethidium (10 мг/мл), и решение передать электрофореза лоток2 7 x 10 см, закрыт на обоих концах с лентой.
    2. Установите гребень 8-Ну и пусть геля агарозы затвердеть на RT. передачи затвердевших агарозы гель в аппарат электрофореза, заполнены с 0,5 x TBE.
  4. Загрузить по лестнице и ПЦР пробы на геле агарозы и запустить его на 30 мин в 120 V.
  5. Оцените гель УФ поле для определения оптимального цикла PCR (рис. 4A).
    Примечание: Размер Ожидаемые диапазоны PCR показано в рисунке 4В.
    1. Соблюдать два диапазоны PCR в каждом из разных скважин (Верхняя полоса: библиотеки ДНК, Нижняя полоса: Димеры праймера).
    2. Определить адекватные цикл PCR амплификация cDNA, выбрав цикла где cDNA библиотека является видимым, но димеры праймера едва наблюдаемый объект.
      Примечание: Как правило, адекватные цикл PCR выбирается между 12-16 циклов. На рисунке 4Aадекватные цикл PCR для этой библиотеки-14.
  6. Настройка крупномасштабных ПЦР-реакции (6 x 100 мкл) для очистки библиотека геля агарозы.
    1. Подготовьте свежие тюбик 10 x буфер ПЦР, следующий шаг 6.1.
    2. Подготовьте крупномасштабные ПЦР Мастер микс в 1,5 мл, объединяя 435.5 мкл РНКазы свободной воды, 65 мкл 10 x PCR буфера, 65 мкл 10 x dNTPs, 3.25 мкл 5' PCR праймер, 3.25 мкл 3' PCR праймер и закупорить вверх и вниз, чтобы смешать.
    3. Перевод 88 мкл ПЦР Мастер микс на шесть 0.5 мл ПЦР пробирок. Передача 10 мкл cDNA фондовой библиотека (хранится на льду), 2 мкл 50 x Taq полимеразы в каждой из 6 трубок ПЦР и Пипетка смешивать.
    4. Подготовьте негативные реакции ПЦР-пробирку, объединяя 77 мкл РНКазы свободной воды, 10 мкл 10 x PCR буфера, 10 мкл 10 x dNTPs, 0.5 мкл 5' PCR праймер, 0.5 мкл 3' PCR праймер и 2 мкл 50 x Taq полимеразы и пипетки смешивать.
    5. Место описано в шаге 6.2.1 и установить оптимальное количество амплификации PCR труб в Термоциклер, используя цикл PCR циклов. Подготовить 2,5% агарозном геле с помощью 0.5 x TBE, как описано в пункте 6.3.
  7. После амплификации PCR передача 9 мкл от каждую ПЦР-пробирку в шесть 1,5 мл microcentrifuge пробирки, содержащие 3 мкл 5 x краситель гель загрузки.
    1. Подготовка 20 nt лестница, объединив 3 мл лестницы в 9 мкл РНКазы свободной воды и добавление 3 мкл гель загрузки красителя в 1,5 мл трубку.
    2. Загрузить по лестнице, отрицательный контроль ПЦР и 6 продуктов ПЦР на геле агарозы и Побегите гель для 30 мин на 120 V.
    3. Проверка однородности амплификаций PCR между полос на коробке УФ (принять изображение).
    4. Комбинат 3 ПЦР-реакции в две 1,5 мл силиконизированный microcentrifuge трубу (3 x 91 мкл), добавить 27 мкл 5 М NaCl и 950 µL 100% этанола. Инвертируйте трубы смешать и установить их при-20 ° C на ночь для продуктов PCR.

7. кДНК библиотеки очистки и оценки

  1. Центрифуга для обеих трубок с ПЦР-реакции на 16000 x g 60 мин при 4 ° C.
  2. Удалить супернатант с 1 мл пипетки, затем наклоните трубу с Пелле на верхней стороне и жидкости на нижней стороне и использовать пипетки Пастера подключен к термос с ванной и аспирационная жидкие с кончиком 10 мл в конце пипетка Пастера.
  3. Настройка дайджест PmeI.
    1. Ресуспензируйте один ПЦР окатышей с 17,5 мкл нуклеиназы свободной воды и передачи ресуспензированы Пелле второй ПЦР Пелле. Добавьте 2 мкл 10 x буфер и 0,5 мкл PmeI фермента и задайте дайджест на водяной бане в течение 2 ч при 37 ° C.
    2. Подготовить 2,5% агарозном геле с помощью 0.5 x TBE (шаг 6.3). Мкл 6 5 x загрузки геля краситель к дайджест. Перевести 13 мкл каждого дайджеста на два соседних скважин геля агарозы, загрузить 20 nt размер лестницы на конце скважины и Побегите гель для 90 минут при 150 V (рис. 4 d).
    3. Акцизный верхние диапазоны PCR от геля на поле УФ, передача части гель в пробки microcentrifuge свежезаваренным весят 1,5 мл, и весят гель штук в масштабе.
  4. Очищайте подакцизным ПЦР усиливается кДНК библиотеки с помощью набор извлечения геля следуя инструкциям производителя. Количественно кДНК библиотеки с помощью ДНК квантификация assay и инструмент, следуя инструкциям производителя.
  5. Оцените размер и чистоты кДНК библиотеки с высок чувствительности ДНК чипа на Bioanalyzer (рис. 5). Последовательность кДНК библиотеки с использованием высокой пропускной способности системы. Передача файла данных FASTQ на RNAworld трубопровод для адаптера обрезки и выравнивание для генома человека для определения последовательности Мирна.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как описано в методе здесь, в общей сложности 18 отдельных образцов FFPE РНК (100 нг каждый) настраиваются в отдельных труб пройти 3' adenylated перепутываются олигонуклеотида T4 маточных ночёвка. На следующий день, ферментативных реакций являются тепло деактивирован, комбинированные и ускорили в одной трубке. Пелле РНК высокомобильна и перевязаны молекулы РНК разделяются на 15%, Денатурирующий гель полиакриламида (страница), где РНК олигонуклеотида размер маркеров, которые мигрировали в соседних скважин геля страницы, используются для выбора подходящего размера 3' перепутываются малые РНК (рис. 2). Кусок подакцизным гель инкубировали в растворе NaCl на ночь для элюировать перевязаны молекул РНК. На следующий день, осаждается eluted РНК, и производится перевязка адаптер 5'. Затем мигрировали и разделены на 12% акриламида гель, где снова перенесенных РНК размер маркера олигонуклеотиды позволяют размер иссечение малых РНК содержащие 3' перепутываются олигонуклеотиды и 5' адаптер ( 5' адаптер лигируют малых молекул РНК Рисунок 3). Подакцизным гель инкубированы всю ночь в растворе NaCl, чтобы позволить элюции РНК. На следующий день, осаждаются перевязаны малых молекул РНК, и гранулы высокомобильна в РНКазы свободной воде, следуют реверс транскрипция; Алиготе cDNA молекул проходит экспериментальный реакции PCR (рис. 4A). Крупномасштабные ПЦР-реакции, с помощью того же входа кДНК библиотек создана и оценены на 2,5% агарозном геле для проверки, что все реакции были адекватно ПЦР усиленный (Рисунок 4B), до объединения и ночь этанола осадков. На следующий день, усиленные кДНК библиотеки, содержащей все 18 отдельных библиотек для 18 уникальных образцов FFPE РНК, перенос на геля агарозы 2,5% и верхней band ПЦР, работает на 100 nt является подакцизным и очищенный (рис. 4 c). КДНК библиотеки очистки затем оценивается на чип ДНК высокой чувствительности (рис. 5), чтобы определить что очищенный продукт PCR не содержат избыток Димеры праймера или других побочных продуктов реакции PCR. Затем продукт PCR анализируется на систему высокопроизводительного секвенирования. Адаптер обрезки и поколения 18 отдельных файлов для каждого из 18 образцов выполняются с помощью конвейера RNAworld (доступ была предоставлена нам д-р Томас Tuschl). Biostatistical анализы проводятся затем оценить содержимое Мирна образцов FFPE РНК.

Проверить этот оптимизированы процедуры, соответствует свежий замороженные и FFPE груди опухоль образцы были использованы для анализа (рис. 6). Две аналогичные груди инвазивной протоковой карциномы (IDC) опухоли были отобраны для оценки чувствительности процедуры и определить, если Мирна выражение различия между двумя свежий замороженные тканей также может быть обнаружен в соответствующий архив FFPE Образцов РНК. Для этого эксперимента качество всего, РНК, полученные из 2 свежий замороженные и два FFPE РНК образцов было оценить (рис. 6A). Как и ожидалось, РНК размер и качество образцов FFPE сильно уменьшилось по сравнению с соответствием свежий замороженные РНК (Сравните полос 1 и 3 и полосы 2 и 4). Один из FFPE РНК в архиве на RT 4 лет (инвазивные груди Рак 1 (IBC1)) и другой перемещен в архив на RT на 8 лет (IBC2), в то время как свежий замороженные коллегами хранился при температуре-80 ° C. Четыре отдельных образцов РНК были проанализированы в одной библиотеке, используя 4 отдельных штрих-кодов и Мирна, читать распределения участков отображаются в рисунке 6B. Две верхней панели отображения Мирна выражение корреляции между двух свежий замороженные опухоли РНК и их конкретных образцов коллегами FFPE РНК. Участки между соответствием свежий замороженные и адаптивной FFPE указывают, что кДНК библиотеки подготовка обеспечивает хорошую воспроизводимость как может наблюдаться высокая корреляция между адаптивной, обнаружен в образцах обрабатываются по-разному (замороженные против FFPE). Две нижние панели отображения корреляции между Мирна выражение данные из двух разных замороженных опухоли и между двумя различными FFPE опухоли. Как указано в рисунке 6 c, Мирна выражение различия между двумя свежий замороженные опухоли коррелировали с различий, обнаруженных между двумя соответствует FFPE опухоли образцов. Значение Мирна выражение различия были обнаруживаемыми оба в свежий замороженные и FFPE опухоли.

Для дальнейшей оценки чувствительности этого подхода, были использованы данные выражения Мирна 12 архивных образцов FFPE и 4 свежих замороженных образцов РНК (рис. 6 d). 16 различных образцов РНК были индивидуально 3' перепутываются и все используемые для подготовки единого кДНК библиотеки. РНК образцы, используемые в этой библиотеке включены две груди клеточных линий, MCF10A (нормальный подобных клеток линия) и MCF7 (линия клетки рака груди) с образцами FFPE РНК и РНК из свежих клеток и их архивных FFPE коллегами23, соответствует свежемороженая от рака груди двух образцов проанализированы независимо (IBC1 и IBC2 в рисунке 6A и 6B) и соответствием свежемороженая и FFPE РНК образцы от нормальной шейки образцов (Cx). Кроме того были проанализированы архивных образцов FFPE от нормального (нормальный Br1, нормальный Br2 и нормальной Br3) и ткани рака груди (5 КСГМГ, КСГМГ 6 и IBC 7), без их свежий замороженные коллегами. Как отмечалось на heatmap, независимо от того, свежий замороженные или РНК FFPE происхождения, Мирна выражение профили же клеток (MCF10 или MCF7), или же тканей (IBC1, IBC2 или Cx) группируются. Кроме того как отмечено в кластере без присмотра, слева направо, нормальной груди клеток и тканей, группируются при опухоли груди и опухолевые клетки группируются справа. Ткани шейки матки, который отображается профиль выражения различных Мирна, сгруппированы в правой части heatmap.

Учитывая, что большинство клинически архивных образцов FFPE не имеют свежий замороженные аналогов, но что они могут быть получены после срока хранения, он был стремилась определить, если протокол подготовки библиотека оптимизированных cDNA применима и воспроизводимый с более старых образцов FFPE. Как показано на рисунке 7, Мирна выражение профили из FFPE тканей в Архив для 18, 20, 22, 27, 30 и 35 лет были получены. РНК был извлечен с использованием оптимизированный одновременных РНК/ДНК процедура21, четверню РНК аликвоты от каждой индивидуальной FFPE особи были подготовлены и в тот же день температуре-80 ° C до библиотеки препаратов. В общей сложности 9 различных образцов FFPE были проанализированы в двух экземплярах, где каждый индивидуальный Алиготе РНК была лигируют с различными перепутываются олигонуклеотиды (всего 18 штрихкоды), в той же библиотеке. Этот эксперимент был повторен в течение двух недель подряд (1 неделя и 2 недели). Это позволило оценки воспроизводимости подготовки кДНК библиотеки с же образцов РНК, с использованием двух различных штрих-кодов в одной библиотеке, а также между двух различных библиотек с интервалом в одну неделю. Как было отмечено на рисунке 7, коэффициент корреляции оставался выше 0,96 независимо от возраста образца или неделя подготовки библиотеки; Таким образом, протокол подготовки оптимизированных cDNA Библиотека обеспечивает надежный инструмент для воспроизводимость анализа образцов FFPE независимо от их архивных время, например, 35-летний архив FFPE РНК (см. груди #9) отображается высокая воспроизводимость меры эквивалент для тех, кто отметил 20-летний FFPE РНК образцов (см. #3 груди).

Figure 1
Рисунок 1: олигонуклеотиды. Описаны все последовательности олигонуклеотида, их соответствующие химические модификации и концентрации, используемые в настоящем Протоколе. Типы химических модификаций описаны в поле изменения и сокращенное изменения отображаются в последовательности олигонуклеотида. Калибратор коктейль отображает список 10 отдельных калибраторы олигонуклеотида РНК, которые были высокомобильна в раствор, содержащий перевозчик олигонуклеотида (0,5 мкм). Восемнадцать 3' перепутываются блоки олигонуклеотида подробно с серым затенением штрих последовательности. РНК последовательности адаптера 5' и последовательностей ДНК 3' ПЦР и 5' ПЦР праймеры подробно. РНК последовательности двух размер маркера олигонуклеотиды, а именно ссылки в протоколе как 19 nt-3' адаптер и 24 nt-3' адаптер размер маркеров, предоставляются. Все ДНК и РНК олигонуклеотиды коммерчески были приобретены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: страница очистки образцов перепутываются РНК 3'. После объединения и осаждения 18 проб перепутываются РНК, ресуспензированы РНК Пелле мигрировали и отделены электрофорезом на 15% акриламида геля (см. также 8). Красная площадь освещаются области, содержащей 3' перепутываются микроРНК, который был вырезан с лезвием скальпеля и переведен в свободной от нуклеиназы силицированного microcentrifuge трубку. В общей сложности четыре скважины, с двумя содержащие 19 nt-3' адаптер и два содержащие 24 nt-3' адаптер был установлен хорошо прочь, на каждой стороне библиотеки (см. Уэллс 5, 6 и 10, 11, соответственно). Как тест для T4 РНК лигаза 1 и для очистки перевязаны размера маркеров, чтобы быть завершена на следующий день, реакции перешнуровки, содержащие 19 nt-3' размер маркера адаптер адаптер 5' и 24 nt-3' адаптер размер маркера с адаптером 5' были запущены в скважинах 2 d 3, соответственно. Желтые квадраты отображения подакцизным группы, представляющие перевязаны размер маркера РНК олигонуклеотиды с адаптером 5'. Эти полосы очищенный, ускорили и запуска в ходе на 12% очистки страницы (см. рис. 3 ниже). Уэллс 1 и 13 содержат 20 трапе размера nt, которая помогла подтвердить ожидаемых размеров перевязаны изделий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: страница очистки очищенный библиотеки после перевязки адаптера 5'. Очищенный РНК библиотека была лигируют с адаптером 5' и размер ожидаемого продукта был вырезан из 12% страница с использованием перевязаны размер маркеров (см. Красная площадь). Продукция T4 РНК перешнуровок между 19 nt-3' адаптерам и 5' (скважины 4 и 9) и между 24 nt-3' адаптерам и 5' (скважины 5 и 10) были параллельно, на каждой стороне хорошо содержащие РНК библиотеки. Высоких полос (см. белыми звездочками) являются продуктами лигирование адаптер 5' и использовать в качестве руководства для обрезания группы гель, содержащий 5' адаптер лигируют библиотеки РНК. Лигирование размер маркера лигирование продукты очищенная на предыдущей странице, выполняются в хорошо 3. Как отмечалось в скважины 1 и 12, 20 трапе размера nt также был запущен для проверки ожидаемого размера библиотеки РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: пилот ПЦР и крупномасштабных амплификации кДНК библиотеки. Размер и соотношение продуктов PCR были оценены на 2,5% агарозном геле присутствии бромид ethidium. (A) после того, как обратная транскрипция перепутываются РНК библиотеки, Алиготе кДНК библиотеки был усилен используя праймеры PCR 5' и 3' в одном экспериментальном реакции PCR. Аликвоты экспериментального реакций PCR были получены на 10, 12, 14, 16, 18 и 20 циклов и перенос на геля агарозы 2,5%. Как заметил между 1 и 7 колодцев, наличие кДНК библиотеки и адаптер димеры был экспоненциально наблюдаемых (см. Зеленые прямоугольники). Для этой библиотеки цикл PCR, отобранных для амплификации кДНК библиотеки было 15. (B) Эта схема отображает позицию и длину различных олигонуклеотиды и конечных продуктов ДНК и РНК, которые идентифицируются на гелях агарозы и страницы. (C) аликвоты 6 крупномасштабных реакций PCR (определены в A) были проанализированы отдельно на 2,5% агарозном гель (см. Уэллс 3-8). Два типа продуктов ПЦР, а именно библиотека (верхняя группа) и димеры праймеров (Нижняя полоса) видны на этот гель (см. Зеленые прямоугольники). Пустой реакции PCR без cDNA отображает не амплификации PCR (см. также 2). 20 трапе размера nt позволяет проверить размер продукта (см. также 1). (D) гель изображение на синий свет transilluminator 2,5% агарозном гель, содержащий объединения реакций PCR побежал в двух соседних скважин. Как отмечалось, высшей группы в обеих скважин в пределах ожидаемого библиотека размер и группа димер адаптер расположен ниже. Верхние диапазоны PCR были подакцизным и очищенный с комплектом извлечения геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Оценка очищенный ПЦР усиленный библиотеки ДНК. Маленький Алиготе (1 мкл) ПЦР усиливается кДНК библиотеки анализируется с помощью ДНК чип высокой чувствительности на микрофлюидика-платформе. (A) Эта панель отображает миграции размер маркеров для калибровки инструмента. (B) Эта группа отображает миграции очищенный ПЦР усиливается кДНК библиотеки. Самый высокий пик измеряется в размере 100 bp (см. звездочка) и представляет кДНК библиотеки. Небольшой пик, оценены в 72 bp документа представляет собой адаптер Димеры праймера. 100 bp пик обнаружено микрофлюидика на основе платформы показывает предполагаемый размер для усиленные кДНК библиотеки, которая содержит 18 отдельных перепутываются РНК образцов для последующего NGS на систему виртуализации высокой пропускной способности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: кДНК библиотеки подготовка и секвенирование нового поколения с использованием соответствует свежий замороженные и формалин Исправлена парафин встроенные образцы. (A) Общая РНК извлечено от соответствует свежемороженая и FFPE инвазивной протоковой карциномы (IDC) опухоли был проанализирован на всего РНК чип на платформе микрофлюидика основе. (B) всего РНК из сопоставляемых свежих замороженные и FFPE образцы (IBC 1 и IBC2) прошли кДНК библиотеки подготовка протокола и были нанесены Мирна последовательности данных. (C) выражения DifferentialmiRNA между IBC1/IBC2 образцов и корреляции между замороженные и FFPE парных образцов. Мирна выражение отображается в журнале количество в миллион (CPM), от высокой к низкой читает (красный на синий цвет). Значение выражения разницу между двумя ткани пар, Мирна, отображается серый круги, с высокой и низкой выражение адаптивной, определенных в свежих и FFPE образцы. (D) Общая РНК, извлеченные из сопоставляемых свежие и FFPE РНК образцы груди клеток линии (MCF10A и MCF7), человека инвазивные ткани молочной железы рак (IBC 1 и IBC2), шейки матки (Cx), Архив нормальной груди тканей (нормальный Br1, нормальный Br2 и нормальной Br 3), и Архивированные инвазивного рака молочной железы (5 КСГМГ, КСГМГ 6 и IBC7) прошли кДНК библиотеки подготовка в рамках выполнения же. NGS данных адаптивной, обнаруженных в библиотеке отображаются в тепло карта конфигурации. Этот показатель был изменен с Loudig и др. 20 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: кДНК библиотеки подготовка и Мирна выражение корреляции между реплицирует, используя старые Архив образцов FFPE. Всего РНК от 18, 20, 22, 27, 30 и 35-летний архив FFPE груди ткани образцы прошли наши оптимизированные cDNA библиотека подготовки протокола. Репликация РНК образцы из 9 различных образцов FFPE были лигируют с различными 3' перепутываются олигонуклеотиды и проанализированы в рамках той же библиотеки на неделе 1 (w1). Же эксперимент был повторен в течение одной недели (2 недели или w2). Воспроизводимость мерах дублируется Мирна выражение данных между же архивных образцов РНК отображаются в карты и коэффициенты корреляции, оценены между 0,93 и 0.99. Этот показатель был изменен с Loudig и др. 20 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Высокую воспроизводимость и надежные cDNA библиотека подготовки протокола для NGS малых РНК, архивируются в FFPE РНК образцы представлены в этот протокол, который является изменение и оптимизированные версии процедуры, описанной Хафнер и др. 22

Все этапы этого протокола были оптимизированы для использования с старых архивных и нарушенной всего РНК, оправился от FFPE образцов. Ключевым моментом этого протокола, для обработки малых объемов FFPE РНК, проживает в объединение всех образцов РНК (то есть, 18 отдельных 100 нг FFPE РНК образцов) после индивидуальных перешнуровок с 18 адаптеры перепутываются уникальный 3'. Этот критический шаг позволяет 18 проб FFPE РНК равномерно пройти все последующие биохимических и ферментативные шаги, необходимые для подготовки малых РНК кДНК библиотеки. Кроме того этот шаг увеличивает количество РНК, претерпевает осадков и гель для очищения путем повышения перевозчик эффект малых молекул РНК и содействия Пелле наблюдения и гель выбор. Еще одной ключевой особенностью настоящего Протокола, который далее подчеркивается его универсальность при работе с небольшим количеством FFPE РНК, что экспериментальный реакции PCR используется для идентификации цикла оптимальный амплификации кДНК библиотеки. Этот шаг также обеспечивает понимание динамики библиотека амплификации против усиления димер грунт, который имеет решающее значение при подготовке крупномасштабного реакции PCR и очистки малых РНК библиотека на агарозе гель. Данные, добавленные к настоящему Протоколу показывают воспроизводимость этого подхода между соответствием замороженных и FFPE образцы, а также выделить его применимость в старых FFPE РНК образцов из образцов Архив до 35 лет.

Этот протокол был изменен от его оригинальной версии, поэтому он оптимизирован для приготовления небольших библиотек РНК из нижней качества и количества химически модифицированных и нарушенной FFPE РНК. Одним из аспектов этой процедуры, которая была изменена, чтобы успешно перевязать и усиливать малые РНК из образцов FFPE относится к количество калибратора коктейль шипами в ходе первоначальных 3' перепутываются адаптер перевязки, для которого вход был сокращен до 0,026 Нм для предотвращения конкуренция с перевязкой низкой избыточностью малых РНК представляют в образцах FFPE РНК. Другое важное изменение в исходную процедуру было удаление всех радиоактивно помечены размер маркеров во время выбора перевязаны малых РНК на гелях страницы. Использование этих radiolabeled размер маркеров не ограничивается только применимость этого подхода сертифицирован для использования радио изотопов, но также предотвратить наблюдения РНК продуктов на гелях лабораториях. Вместо этого в этом оптимизированный протокол, размер маркеры в скважинах, прилегающих к библиотеке, на странице гель и визуализировать напрямую с Люминесцентную краску направлять иссечение перевязаны малых РНК. Главное флуоресцентные краски слегка опрыскивают на гель для предотвращения диффузии РНК продуктов и затем визуализирована на синий световой короб. Впоследствии, как мера предосторожности и улучшить распространение перевязаны малых РНК, содержащихся в подакцизным фрагментов геля страницы гель Бурун трубы используются для равномерно раздавить гель до инкубации в растворе NaCl на ночь при 4 ° C под агитации. Все эти шаги были тщательно оценены работать с меньшим количеством материала.

Этот протокол был применен к FFPE РНК образцов из разных источников (органы и учреждения), хранящиеся на различное количество времени. Анализы показали высокую воспроизводимость секвенирования малых РНК из свежих и замороженных образцов, при использовании этого оптимизированная процедура. Дополнительный анализ с использованием старых архивных образцов FFPE, хранятся до 35 лет, далее продемонстрировала обширные применимости Протокола для клинических образцов. Минимальное требование ввода FFPE РНК для образцов FFPE было показано 100 нг. Это низкий требование позволяет применимости настоящего Протокола на целый ряд поражений, различных размеров и доступности, но она не позволит анализ одной ячейки FFPE РНК. Важно отметить, однако, что это оптимизированный протокол также был использован с общей РНК, извлеченные из циркулирующих exosomes с входами менее 1 нг и показано обеспечивают высокую воспроизводимость малых РНК выражение профили (данные не показаны). Этот низкий входной свидетельствует о том, что малые РНК в FFPE образцах, хотя представитель оригинальные свежие ткани, присутствуют в гораздо более низких пропорциях чем в целом РНК от циркулирующих exosomes.

В недавней работе, где это оптимизированный протокол был применен к клинически секретной DCIS FFPE образцы, было установлено, что различия выражение Мирна, выявленные NGS кДНК библиотеки может быть проверен путем количественного PCR. Эта работа продемонстрировала целесообразность использования DCIS поражения от архивных тканей из различных учреждений для крупномасштабных ретроспективных исследований [20]. Это исследование также подчеркивается надежность этой подготовки кДНК библиотеки при выполнении в разное время (с интервалом в несколько недель), без ущерба для воспроизводимости и чувствительность анализа.

Учитывая огромное количество клинически секретных архивных образцов FFPE это оптимизированный протокол обеспечивает надежный инструмент для подготовки кДНК библиотек в крупномасштабных ретроспективного анализа и потенциал идентификации Мирна биомаркеров связанных с раком развития21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы хотели бы раскрывать, что публикация, содержащая некоторые из данных, представленных в этой рукописи был опубликован в Международный журнал молекулярных наук Loudig и др. 21.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Томас Tuschl, заведующий лабораторией молекулярной биологии РНК, а также членов его лаборатории для их поддержки и обмена технология, разработанная в его лаборатории и обеспечение доступа к RNAworld трубопроводу. Мы также благодарим д-р Маркус Hafner его протокол обмена и предоставления подробных описаний на всех биохимических и ферментативные шаги, используемые в его первоначальной процедуры.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).

Tags

Генетика выпуск 135 формалин Исправлена парафин врезанных FFPE РНК РНК деградированных микроРНК следующего поколения секвенирование кДНК библиотеки количественной оценки амплификации PCR T4 РНК перевязки страницы деградированных РНК
Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loudig, O., Liu, C., Rohan, T.,… More

Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter