Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Co transplantation af menneskelige æggestokkene væv med manipuleret endotelceller: en celle-baseret strategi kombinere accelereret Perfusion med direkte Paracrine levering

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57472
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4, 1,3, 1,3
1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Angiocrine Biosciences, Inc., 3Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College, 4Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

For nogle patienter er den eneste mulighed for fertilitet bevarelse kryopræservering af æggestokkene væv. Desværre underminerer forsinket revaskularisering follikulært levedygtighed. Vi præsenterer her, en protokol for at co transplant menneskelige æggestokkene væv med endotelceller for udnyttelse som celle-baseret strategi kombinerer accelereret perfusion med en direkte paracrine levering af bioaktive molekyler.

Abstract

Barnløshed er en hyppig bivirkning af kemoterapi og/eller strålebehandling og for nogle patienter, kryopræservering af æg eller embryoner er ikke en mulighed. Som et alternativ, et stigende antal af disse patienter vælger at cryopreserve æggestokkene væv til autograft efter genopretning og aftagen. Trods forbedringer i resultater blandt patienter, der gennemgår auto-transplantation af kryopræserverede æggestokkene væv, forbliver effektiv revaskularisering af podede væv en stor hindring. For at afbøde iskæmi og dermed forbedre resultater i patienter, der gennemgår auto-transplantation, udviklede vi en vaskulær celle-baseret strategi for fremskyndelse perfusion af æggestokkene væv. Vi beskriver en metode til co transplantation af eksogene endotelceller (ExECs) med befrugtede æggestokkene væv i en musemodel xenograft. Vi udvider denne tilgang for at ansætte ExECs, der er blevet manipuleret til at constitutively udtrykke Anti-Mullerian hormon (AMH), således at vedvarende paracrine signalering input til æggestokkene podninger. Co transplantation med ExECs øget follikulært volumen og forbedret antral follikel udvikling, og at udtrykke AMH ExECs forfremmet fastholdelse af inaktiv primordiale follikler. Denne kombinerede strategi kan være et nyttigt redskab for formildende iskæmi og modulerende follikulært aktivering i forbindelse med fertilitet bevarelse og/eller barnløshed som helhed.

Introduction

Kræft er fortsat blandt de førende dødsårsager i den industrialiserede verden, men årtiers forskning har givet betydelige fremskridt for de fleste typer af kræft, og i nogle tilfælde næsten fordoblet overlevelse satser1. Kemoterapeutiske stoffer er desværre ofte gonadotoxic, nedbryder reserve af primordial follikler i æggestokkene og reducere fertiliteten2. Denne voksende befolkning kan drage fordel af forskellige metoder til fertilitet bevarelse herunder oocyt og/eller embryo kryopræservering, dog, patienter, der kræver hurtig indledningen af kræftbehandling og præpubertale patienter er berettiget til disse indstillinger. Som alternativ kan har nogle patienter valgt at cryopreserve æggestokkene væv, før virksomheden deres terapeutiske regime, og recovery og remission, auto-omplantning væv for at genoprette frugtbarhed3. Endnu, til dato, graft overlevelse og follikulært output efter auto-transplantation er fortsat relativt lavt4, hovedsagelig som følge af væv iskæmi og hypoxi5,6,7. Trods talrige bestræbelser på at forbedre æggestokkene kortikale grafts levedygtighed ved hjælp af anti-oxidanter8,9, pro-angiogene cytokiner10,11,12,1 3, eller mekaniske manipulationer14, graft iskæmi i 5 til 7 dages vindue efter transplantation underminerer levedygtighed og overlevelse af transplantat7. For at løse dette, udviklede vi en celle-baseret strategi for at lette anastomose vært og graft fartøjer og således fremskynde reperfusion æggestokkene væv.

Ud over den iskæmisk fornærmelse af podede æggestokkene væv i vinduet efter transplantation, kan afbrydelse af indbyrdes follikulært signalering bidrage til nedbrydningen af pool15,16. Fordi eksogene endotelceller (ExECs) bidrage til stabil og velfungerende fartøjer i periferien af graften, udgør de en enestående mulighed for at formidle en defineret Molekylær input til transplanterede væv. Som et bevis på princippet blev ExECs manipuleret til at udtrykke min super-fysiologiske niveauer af Anti-Mullerian hormon (AMH), et medlem af den omdanne vækst faktor beta (TGFβ) superfamilien, der har vist sig at begrænse follikelvækst17. Sammenligning af follikulært distribution i podninger Co transplanteret med kontrol og udtryk for AMH celler kontrollerer den biologiske aktivitet og styrken af manipuleret exECs.

Resumé, kan ved at forbedre graft levedygtighed og undertrykke tidlig mobilisering af follikulært pool, denne tilgang øge produktiviteten i auto-transplanteret æggestokkene væv i patienter, der gennemgår fertilitet bevarelse. Desuden, den ExEC-baseret platform giver eksperimentel forhør af molekylære reguleringsmyndigheder, som har været impliceret i follikulære udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer dyr emner er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Weill Cornell Medical College. Alle xenotransplantation eksperimenter ved hjælp af æggestokkene væv blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og forordninger. Menneskelige æggestokkene væv blev indsamlet fra patienter planlagt til kemoterapi eller strålebehandling til behandling af cancer eller forudgående knoglemarvstransplantation. Institutionelle review board (IRB) Udvalget af Weill Cornell Medical College godkendt indsamling af væv til potentielle autolog anvendelse, og på patientens informerede samtykke en donation på op til 10% af deres æggestokkene væv til forskning brug blev udført.

1. samling af menneskelige æggestokkene væv

Bemærk: Når en æggestokkene væv transporteres fra en ekstern facilitet transit, tid bør ikke overstige 5 h18,19.

  1. Indsamle de æggestokkene væv og skyl med en steril saltvandsopløsning.
  2. Sted i æggestokkene i en steril beholder.
  3. Hæld Leibovitz's L-15 medium, indtil æggestokken er helt nedsænket i mediet.
  4. Lukke og forsegle beholderen.
  5. Transport af container på is.

2. behandling af de udtagne æggestokkene væv, tilpasset fra Schmidt et al. 18

  1. Forberedelserne til æggestokkene behandling og frysning
    1. Forberede behandling 100 mL medium: Leibovitz's L-15 medium 99 mL + 1 mL antibiotikum-antimykotikum løsning. Filter medier bruger 0,2 µm filter. Holde medium nedkølet.
    2. Forberede 100 mL af indefrysning løsning ved hjælp af DMSO som en cryo-protectant. Tilføj 69.64 mL Leibovitz L-15 medium, 17.66 mL føtalt bovint serum (FBS), 3,42 g saccharose (til at oprette en endelig koncentration 0,1 mol/l), 10.65 mL DMSO (til at oprette en endelig koncentration på 1,5 mol/L), og 1 mL antibiotikum-antimykotikum løsning. Filtrer medium ved hjælp af en 150 mL filterenhed, 0,2 µm. Store medium ved 4 ° C.
    3. Sterilisere de kirurgiske værktøjer ved hjælp af autoklave programmeret til en indpakket legemer sterilisation cyklus.
  2. Ved ankomsten af væv
    1. Sæt de steril kirurgiske redskaber i biosikkerhed kabinet: skalpel med blade nummer 21, skarpe fint buet saks og pincet i varierede størrelser: lang (ca. 150 mm længde) og 2 mellemstore (ca. 110 mm længde).
    2. Bære sterile handsker, åbnes beholderen inden for Biosikkerhed kabinet. Tage æggestokken og anbringes i et 150 mm petriskål og hæld koldt medium rede taktfast 2.1.1 oven på æggestokken til at forhindre dehydrering af æggestokkene væv.
    3. Isolere æggestokken fra enhver resterende væv og skyl det med koldt medium, indtil det er blottet for væv og blod.
    4. Placer æggestokkene i en ren 150 mm petriskål, tilføje koldt medium, forberedt i trin 2.1.1 indtil æggestokken er halvdelen neddykket i det.
  3. Dissektion af æggestokkene væv
    1. Gennemskære æggestokken og fjerne medulla først ved skarpe dissektion, bruger buet fin saks. Derefter skrabe medulla væk, ved hjælp af en steril skalpel med en klinge nummer 21. Foran indtil den kortikale væv er 1-1,5 mm i tykkelsen.
    2. Skær den kortikale væv i tops i 2-3 mm i bredden, bliver længden af strimlen hele længden af den æggestokkene stykke, der blev behandlet.

3. æggestokkene væv langsom frysning, Adapted fra Newton mfl. og Oktay et al. 6 , 20

  1. Forberedelse til nedfrysning
    1. Label cryovials (1,8 mL).
    2. Tilføj 1,5 mL af indefrysning forberedt i trin 2.1.2 til hvert hætteglas.
    3. Overføre en kortikale strip pr. kryogene hætteglas indeholdende den indefrysning løsning.
    4. Reagensglasset den kortikale strip i 20 min. på en roterende plade, anvende blid agitation ved 4 ° C.
  2. Langsom indfrysning af æggestokkene væv
    1. Indlæse cryovials i en programmerbar Afretter fryser starter ved 0 ° C.
    2. Cool på 2 ° C/min. til-7 ° C.
    3. Holde væv på denne konstant temperatur i 10 min.
    4. Udføre manuel seeding for is krystal Nukleering induktion, ved at røre ved hvert cryovial med en bomuld tip nedsænket i flydende kvælstof (LN2).
    5. Fortsætte med at køle på 0,3 ° C/min., indtil prøven temperaturen når-40 ° C.
    6. Cool i et hurtigere tempo på 10 ° C/min. til-140 ° C.
    7. Overføre cryovials til dewar til opbevaring i LN2 (-196 ° C).

4. forberedelser til operationer (bilaterale ooforektomi og co transplantation)

  1. Forberedelse af plader
    1. En dag før optøning af æggestokkene væv til transplantation
      1. Læg et stykke af en plast paraffin film i bunden af en 50 mm petriskål, spray det med 70% Ethanol indtil det vil være helt dækket.
      2. Lad Petriskålene natten i biosikkerhed kabinet. Forberede 2 petriskåle pr. mus.
    2. På dagen for operationer
      1. Opsug ethanol fra petriskålen indeholdende plast paraffin film inden for Biosikkerhed kabinet.
      2. Forlade petriskål bly halvt åben indtil ethanol fordamper helt.
      3. Luk låget af petriskålen, når plast paraffin filmen er helt tør. Holde det inden for Biosikkerhed kabinet.
      4. Label wells af en 6 plade godt i overensstemmelse hermed, 0,1 mol/L saccharose + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L saccharose + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L saccharose, grundlæggende optøning løsning (BTS), Medium.
  2. Forberedelse af løsninger
    1. Forberede 100 mL af BTS: Leibovitz's L-15 medium 79 mL + FBS 20 mL + antibiotikum-antimykotikum løsning 1 mL. Filter med en 0,22 µm filtersystem.
    2. Forberede 10 mL af BTS med 0,1 mol/L saccharose. Skalere 0.342 g saccharose og der tilsættes 10 mL af BTS forberedt i trin 4.2.1, agitere forsigtigt indtil saccharose er helt opløst. Filter løsning ved hjælp af en sprøjte filtrere 0,22 µm.
    3. Forberede løsningerne i henhold til tabel 1. Dække rør indeholdende DMSO med aluminiumsfolie. Holde nedkølet indtil brug.

5. æggestokkene væv hurtig optøning

  1. Tage ud af LN2 dewar et hætteglas indeholdende frosne æggestokkene væv og opbevare det ved stuetemperatur i 30 s.
  2. Tørre hætteglasset ren ved hjælp af en silkepapir.
  3. Fordyb hætteglas i vandbad 30 ° C i 1-2 min. indtil dens ' indhold er optøet.
  4. Åbn hætteglasset og Placer den kortikale strip i den første brønd, der indeholder 3ml af den første løsning (0,1 mol/L saccharose + 1 mol/L DMSO, forberedt i trin 4.2.3).
    Bemærk: Alle trin åbning af låget på pladen skal foregå under laminar flow.
  5. Inkuber 6 godt pladen på en roterende plade ved 4 ° C i 5 min. hold pladen dækket med aluminiumsfolie for dette trin.
  6. Overføre den kortikale strip til den anden godt indeholdende 3 mL af den anden løsning (0,1 mol/L saccharose + 0,5 mol/L DMSO, forberedt i trin 4.2.3).
  7. Inkuber 6 godt pladen på en roterende plade for blid agitation ved 4 ° C i 5 min. holde pladen dækket med aluminiumsfolie for dette trin.
  8. Overføre den kortikale strip i tredje brønden, som indeholder 4 mL af opløsning (BTS med 0,1 mol/L saccharose, forberedt i trin 4.2.2).
  9. Ruger på en roterende plade for blid agitation ved 4 ° C i 5 min.
  10. Overføre den kortikale strip til den fjerde godt indeholdende 4 mL af opløsning (BTS, forberedt i trin 4.2.1).
  11. Ruger på en roterende plade for blid agitation ved 4 ° C i 5 min.
  12. Overføre den kortikale strip i de sidste godt indeholdende 4 mL koldt medium (udarbejdet i trin 2.1.1). Holde optøede æggestokkene væv på is indtil udfører transplantation.

6. indkapsling af æggestokkene væv

  1. Forberede følgende løsninger
    1. Forberede 25 mL 20 mmol/L HEPES buffer i 0,9% saltvand. Filter og opbevares ved 4 ° C.
    2. Forberede 1 mL af CaCl2 ved koncentration på 1 mol/L. Filter og opbevares ved 4 ° C.
  2. Forberede en Fibrinogen 50 mg/mL stamopløsning
    1. Tilføje 1 g af Fibrinogen til 20 mL 20 mmol/L HEPES buffer i 0,9% saltvand ved at langsomt blande fibrinogen i HEPES bufferet saltvand over flere timer ved 37 ° C.
    2. Label 1,7 mL micro-centrifugeglas.
    3. Opløsningen filtreres gennem et 0,45 µm filter, sprøjte og derefter gennem en 0,2 µm sprøjte filter.
    4. Alikvot løsning i 200 µL til micro-centrifugerør og opbevares ved-20 ° C.
  3. Forberede en Thrombin 100 U/mL stamopløsning
    Bemærk: Thrombin løsninger adsorberes til glas, alikvot løsning i plast rør/hætteglas.
    1. Tilsættes 2,5 mL 0,9% sterilt saltvand til 250 U af Thrombin.
    2. Blid ryste indtil løsning opløses fuldstændigt.
    3. Label 1,7 mL micro-centrifugeglas.
    4. Filtreres gennem et 0,2 µm sprøjte filter, alikvot 50 µL til mikro-centrifugeglas, og opbevares ved-80 ° C.
  4. Gøre en Fibrin blodprop af 70 µL, at opnå en endelig koncentration på 10 mg/mL fibrinogen og 5 U/mL Thrombin
    Bemærk: Sørg for at arbejde hurtigt, løsning blodpropper i et par sekunder. Også, undgå tilføjelsen af bobler til blandingen.
    1. Forberede en Fibrinogen løsning i et 1,7 mL micro-centrifugerør.
      1. Tilføje 360 µL af 20 mmol/L HEPES Buffer i 0,9% saltvand løsning til den aliquoted 200 µL af Fibrinogen lager, forberedt i trin 6.2.4.
      2. Mix af blid pipettering.
      3. Hold det på køl.
    2. Forberede en Thrombin løsning i et andet micro-centrifugerør.
      1. Tilføje 148.7 µL af DMEM til den aliquoted 50 µL af Thrombin lager, forberedt i trin 6.3.4.
      2. Mix af blid pipettering.
      3. Tilføje 1,3 µL 1 mol/l CaCl2.
      4. Mix af blid pipettering.
      5. Hold det på køl.
    3. Forberede en enkelt cellesuspension, i et tredje micro-centrifugerør.
      1. Frigøre manipuleret endotelceller fra pladen ved hjælp af et enzym celle detachement medium.
      2. Spin ned den og tælle de celler ved hjælp af en hemocytometer med et cover glas.
      3. Bruge 20.000 celler pr. hver 1 mm2 af æggestokkene væv. Beregne 20.000 x område af æggestokkene væv i mm2.
      4. Spin ned manipuleret endotelceller og genopslæmmes i grundlæggende medium (DMEM) at nå et samlet volumen på 16,8 µL.
      5. Hold det på køl.
    4. Læg et stykke af æggestokkene væv på en steril gaze svamp til at tørre det i et par sekunder.
    5. Placér æggestokkene væv oven på plastik paraffin film inden for 50 mm petriskål.
    6. Tilføje 39,2 µL af opløsningen Fibrinogen, forberedt i trin 6.4.1.2, i cellesuspension forberedt i trin 6.4.3.4, mix af blid pipettering. Hold det på køl.
    7. Tilføje 14 µL af Thrombin løsning parat i trin 6.4.2.4. Bland forsigtigt af pipettering én gang. Arbejde hurtigt.
    8. Placer blandingen på toppen af æggestokkene væv, afpipetteres det i form af en aflang dråbe.
    9. Placer petriskål med blodprop i varmeskab ved 37 ° C.

7. bilaterale ooforektomi og co transplantation af menneskelige æggestokkene væv med manipuleret endotelceller at NSG mus

Bemærk: Ti fjorten-uge-forhenværende kvindelig NSG mus21 blev brugt (Jackson Labs).

  1. Forberede alle kirurgiske værktøjer, som uddybet i trin 2.1.3, Sørg for at du har alle suturer, puder og kirurgisk bånd handy.
  2. Bedøver musen ved hjælp af en anæstesi system med isofluran.
    1. Placere musen i salen, induktion, luk låget og åbne den relevante stophane.
    2. Åben flowmåler til 1.000 mL/min. tænde vaporizer og placere sig hen til levere 2-3,5%.
    3. Observere virkningerne af anæstesi; tab af bevidsthed, langsomme og regelmæssige indåndinger.
    4. Overførsel til næsen kegle til at opretholde anesthesia. Drej vaporizer til at levere 1-3%, afhængigt af vitale tegn.
    5. Kontrollér fravær af pedal eller hale refleks. Hvis refleks er til stede, øge isofluran, indtil det er fraværende.
  3. Trim med musen tilbage hår, fra halen op til kravebenene linje, ved hjælp af en elektrisk hår trimmer.
  4. Placere musen i en udsat position på den kirurgiske platform.
  5. Løse næsen kegle til kirurgisk platform ved hjælp af en kirurgisk tape.
  6. Tape med musen lemmer forsigtigt til kirurgisk platform ved hjælp af en 1,25 cm-wide kirurgisk papir tape.
  7. Brug en steril smøremiddel gelé og Indsæt et termometer PR. rettelse termometeret ved at tape det til kirurgisk platform ved hjælp af en plastik kirurgisk tape 1,25 cm bred perforeret.
  8. Tape halen til den kirurgiske platform ved hjælp af en 2,5 cm bredt kirurgisk papir tape.
  9. Varme, ved hjælp af en infrarød forbindelse eller en varmt vand varme pad, og overvåge musens kropstemperatur under hele proceduren. Holde kropstemperaturen inden for rækkevidde af 35-37 ° C.
  10. Rengør det beskårne område med en steril povidon-jodopløsning vatpind stick og tørre ved hjælp af steril alkohol prep.
  11. Gentag trin 6.9 to gange mere.
  12. Anbring en dråbe af sterile okulær smøremiddel vet salve over hver af de mus øjne til at beskytte mod dehydrering og skader på hornhinden.
  13. Dække mus ved hjælp af en steril kirurgiske drapere.
  14. Injicere buprenorphin (1 mg/Kg) sub-kutant (S/C).
  15. Udføre en langsgående mediale dorsale indsnit ved hjælp af en skalpel (klinge #21).
  16. Udføre en bilateral ooforektomi, bruge en dorsal tilgang.
    1. Gratis subkutane bindevæv af stump dissektion ved hjælp af saks.
    2. Knivspids fascia lateralt til midterlinjen gøre et snit og nå til bughulen ved hjælp af skarp saks.
    3. Grab den æggestokkene fedt pad og æggestokkene forsigtigt med en pincet og trække det ud af bughulen.
    4. Forstå æggestokken og fedt pad med en vaskulær klemme.
    5. Ligate æggestokken og fedt pad ved hjælp af en 4/0 monofilamenter resorberbare sutur i bunden af æggestokken, distalt for æggelederen.
    6. Klip æggestokken distalt for uafgjort. Sørg for der er ingen blødning fra bunden af stumpen.
    7. Placer vævet tilbage ind i bughulen og sutur fascia ved hjælp af en 6/0 flettet resorberbare sutur.
    8. Gentag trin 7.15.1-7.15.7 på de kontralaterale side.
  17. Co transplantation af æggestokkene væv.
    1. Udføre et vandret snit i fascia ovenfor Gluteus Maximus, på den længde, der passer til dimensionerne blodpropper. Oprette en lomme i denne virtuelle rum ved at åbne saks nedenunder fascia.
    2. Afhente et stykke indkapslede kortikale væv, som er udarbejdet i trin 6.4.8 og placere det i denne lomme.
    3. Sutur fascia ved hjælp af en 6/0 flettet resorberbare sutur.
  18. Gentag trin 7.16.1-7.16.3 på de kontralaterale side samt.
  19. Luk den dorsale væg ved hjælp af simple afbrudt sting med en 4/0 monofilamenter resorberbare sutur.
  20. Injicere lidocain 0,5% (1,2 mL/Kg) S/C på webstedet indsnit.
  21. Brug en steril alkohol prep til at rense huden.
  22. Sluk for isofluran mens overvågning af musen temperatur.
  23. Give 1-2 min af O2, uden isofluran. Holde på opvarmning musen, indtil det begynder at bevæge sig og vende tilbage til bevidsthed.
  24. Placere musen i en ren opsving bur og senere hus musen i et separat bur indtil komplet heling af den kirurgiske sår.
  25. Injicere buprenorphin (1 mg/Kg) S/C, som nødvendigt hver 8-12 h, i 24 timer efter operationen.
  26. Holde musene i separate bure, når alle fødevarer, vand, sengetøj og bure er autoklaveres, indtil slutningen af forsøget. Holde bure i en trykisoleret ventileret rum. Bruge personlige værnemidler når håndtering musene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at afgøre, hvorvidt Co transplantation af ExECs giver en fordel til patienternes væv, var optøede æggestokkene kortikale strimler opdelt i lige store stykker og aflægger bilateralt i immunforsvar, NOD scid gamma (NSG), mus. Med den ene side indkapslet i en fibrin blodprop alene (ingen ECs) og de andre indeholdende ExECs (figur 1a), serveres hver mus som sin egen kontrol. ExECs blev indhentet via isolation af primære endotel fra menneskelige umbilical snore og efterfølgende behandling med Adenoviral gen fragment E4-ORF1, som tidligere beskrevet22,23. Inden for passager 2-5, menneskelige umbilical vene ECs (hUVEC) blev behandlet med lentiviral partikler, der indkode konstitutiv udtryk cDNA kodning adenoviral gen fragment E4-ORF1. Denne behandling øger overlevelsen og endotelet angiogene potentiale som tidligere beskrevet22,23. Efter to uger, blev funktionelt perfunderet fartøjer dannet fra normal god landbrugspraksis-mærket exECs på grænsefladen af værten væv og transplantat (figur 1b). For at mærke funktionelle blodkar, blev mus sprøjtet med 100 mL lektin (0,5 mg/mL) under isofluran anæstesi 10 minutter før høst væv. Kvantificering af follikler på 2 uger følgende transplantation viste en betydelig fordel at relative follikel tælle i ExECs-assisteret podninger, det var tydeligt på to uger (figur 1 c). Eksogene ECs dannet funktionelle fartøjer når Co transplanterede med æggestokkene væv (figur 1b) og cortical stykker Co transplanteret med musen eller menneskelige ExECs steg antallet af overlevende follikler i forhold til kontrol grafts (figur 1 c ). Denne fordel var knyttet til nedsat fibrotisk område i ExECs-assisteret grafts (fig. 1 d) — fra hver transplanterede graft, 3 sektioner var plettet med Trichrome, en etableret middel til skildrer fibrotisk væv24, til at vurdere fibrotisk område: en midterste del og en 600 µm dybde afsnit fra de øvre og nedre sider af graften. Farvede dele blev scannet og analyseret ved hjælp af ImageJ for at kvantificere areal og området fibrotisk var manuelt skitseret og kvantificeres som en procentdel af hele transplantat område (ImageJ software). Endelige værdier blev beregnet for hver enkelt graft som gennemsnittet af de 3 afsnit analyseres. Vigtigere, grafts, der var Co transplanterede med menneskelige forhuden fibroblaster viste fattige væv levedygtighed og relativt få follikler. (Figur 1e).

Vi vurderede næste langsigtede funktion af æggestokkene væv grafts med og uden ExECs (figur 2ad, f, h). Efter 14 uger blev mus stimuleret dagligt med menotropins for varierende længder af tid, før dyrene blev ofret, med progression af follikel vækst overvåges i to mus via Mr (figur 2b-c). Udvikle follikler blev konstateret i kontrol (figur 2e) og ExECs-assisteret grafts (figur 2 g, jeg). Flere og større størrelse follikler blev bemærket i de ExECs-assisteret grafts (figur 2 g, jeg). I forhold til antral follikler hidrører fra den samme patient væv, stimuleret med menotropins og co transplanteret med ExECs, granulosa cellelag i den mere avancerede follikel vises øget udtryk for ovulatoriske markører CD4425 og HABP126, samt øget celledød (Caspase), og reduceret spredning (Ki67) (figur 2j).

Flere undersøgelser har vist, at puljen af follikler tidligt er aktiveret efter graft æggestokkene væv27,28,29,30. Vi observerede en lignende tendens i flere podninger fra en enkelt patient på 2, 3 og 14 uger (figur 3a). For at kapitalisere på den formodede funktion af AMH i undertrykke aktivering og/eller vækst af follikler17,31, vi udviklet ExECs med lentivirus constitutively udtrykke og dermed give en direkte paracrine kilde af udskiller AMH til transplanterede æggestokkene væv (figur 3b). Lentiviral transduktion øget 100-fold ovenstående GC i ExEC, som ellers udtrykt målbart mængder af AMH. Granulosa celler tumorceller, udskilles på den anden side en basal grad af AMH i cellekultur supernatanten. (Figur 3 c). To uger efter Co transplantation, fartøjer stammer fra ExECs blev observeret på grænsefladen vært-graft og immunfarvning afslørede rigelige AMH protein i lumen af fartøjer stammer fra AMH-ExECs (figur 3d) i forhold til fartøjer dannet fra kontrol ExECs. For at teste funktionen af AMH uafhængigt af pro-angiogene indflydelse af ExECs, brugte vi mesenchymale stamceller (MSC), der blev isoleret fra fragmenter af æggestokkene medulla. Disse celler blev transduced med lentiviral partikler kodning AMH og udvidet i kultur til brug i co transplantation. Ved co transplantation med AMH-ExECs konstateredes en 2-fold stigning i andelen af primordial follikler. Dette, men fører til et fald i andelen af primære follikler. AMH-MSCs føre til øget fastholdelse af primordial follikler 10-fold slægtning til kontrol MSCs (figur 3f, h). Den mest markante fordel til fastholdelse af inaktiv follikulært poolen var som af AMH-ECs når der blev foretaget en sammenligning mellem MSC'er, ExECs, ikke-cellulære grafts (Ctl), AMH-MSCs ExEC og AMH-ExECs (figur 3i).

Figure 1
Figur 1: Co transplantation af æggestokkene kortikale strimler med ExECs forbedrer levedygtighed og bevarer den follikulære pool. (a) ordningen af den eksperimentelle design. Optøede menneskelige æggestokkene væv var indkapslet i en fibrin blodprop, med eller uden ExECs. Blodpropper blev transplanteret ind i oophorectomized NSG mus og høstet på slutpunktet for eksperimentet. (b) menneskelige kortikale grafts Co transplanteret med hUVEC-afledte ExECs (grøn); røde blodlegemer er mærket af TER-119 og grænserne for podekvisten er skitseret i hvid. (c) den mediane procentdel af samlede follikler fra transplantation med og uden mus eller menneskelige exECs + MAD. * P < 0,05. (d) den mediane procentdel af området fibrotisk fra transplantation med og uden mus eller menneskelige ExECs + MAD. ** P < 0,001. (e) repræsentative dele af æggestokkene grafts Co transplanteret med ExECs, uden celler, og med menneskelige forhuden fibroblaster. Dette tal er blevet ændret fra mand et al. Sci Rep. 2017 Aug 15; 7 (1): 8203. Doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: langsigtet levedygtighed og funktion af æggestokkene væv grafts er forbedret med exECs. I tallene b, c, d, f og h er grafts til venstre kontrol-ingen ECs, mens på højre side af grafts Co transplanteres med ExECs. (a) eksperimentelle ordning for langsigtet xenograft æggestokkene kortikale væv. (b) i tal b og c, asterisk (højre side) repræsenterer den æggestokkene væv Co transplanteret med ECs, mens pilespidsen (venstre side) repræsenterer den æggestokkene væv transplanteret med ingen celler. Musen #1 var xenografted med væv fra en 6 årig donor og overvåget af Mr ved starten af stimulation (14 uger, venstre) og igen efter ti dages stimulation (15,5 uger, højre). (c) mus #3 var xenografted med væv fra en 19 årig donor og overvåges af Mr på 6 (20 uger efter transplantation), 7 (21 w), og 8 (22 w) uger efter debut af stimulation. (d) makroskopiske billede af aflægger menneskelige æggestokkene væv høstet på 15,5 uger mus #1, graft på højre side er den ExEC-assisteret graft og histologiske udsigt over kontrol podekvisten er vist i (e). (f) makroskopiske billede af grafts, mus #2 blev ofret efter 20 uger og kontrol og exEC-assisteret grafts blev høstet for histologiske analyse; den ExEC-assisteret graft er vist i (g). (h) makroskopiske billede af graftene i mus #3, som blev ofret efter 22 uger, histologiske analyse af ExEC-assisteret podekvisten er vist i (i). (j) dele af de ExEC-assisteret podninger fra mus #2 og mus #3 var farvet for molekylære markører og forstørres i boksen forbundet. Skalere barer = 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra mand et al. Sci Rep. 2017 Aug 15; 7 (1): 8203. Doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ExECs manipuleret til at udtrykke AMH bevare en inaktiv follikulært pool. (a) andelen af follikler var kvantificeres for flere æggestokkene væv fragmenter fra den samme patient, der var Co transplanterede med ECs for lange og korte mellemrum; n = 3 i 2 uger, n = 4 på 3 uger og n = 2 på 14 uger. (b) ordningen af den eksperimentelle design. Optøede menneskelige æggestokkene væv var indkapslet i en fibrin blodprop, med enten ExECs/MSCs transduced med en RFP lentiviral partikel tjener som et kontrolelement, eller ExECs/MSCs transduced med en AMH-mCherry lentiviral partikel generere AMH-ECs/MSCs. Blodpropper blev transplanteret ind i oophorectomized NSG mus og høstet på 2 uger. (c) ExECs var transduced med lentivirus kodning udskilles menneskelige AMH; celle cellekultur supernatant af AMH-transduced exECs sammenlignet med COV-434 kultur granulosa celle tumor linje og kontrol ExECs. (d) to uger efter transplantation, æggestokkene væv fragmenter der blev co transplanteret med enten ECs (venstre) eller AMH-ExECs (til højre) var farves med en antistoffer specifikke for AMH protein. (e) den relative andel af follikler i xenografts Co transplanteret med kontrol og AMH-ExECs var kvantificeret efter 2 uger (n = 6). (f) den relative andel af follikler i xenografts Co transplanteret med kontrol og AMH-MSCs var kvantificeret efter 2 uger (n = 6). (g) median + MAD til den relative andel af follikler blev sammenlignet i xenografts transplanteret med kontrol og AMH-transduced ExECs (n = 6) efter 2 uger. (h) den mediane + gal relative andel af follikler blev sammenlignet i xenografts transplanteret med kontrol og AMH-transduced MSCs (n = 6) efter 2 uger. (i) median procentdelen af de observerede primordiale follikler pr. graft i xenografts transplanteret med MSCs (n = 6), ExECs (n = 6), AMH-MSCs (n = 6), og AMH-ExECs (n = 6) blev sammenlignet i samlet kontrol betingelser (ingen celler, n = 15). Mellemværker i (d) er udvidet i boksene til højre for AMH-ExECs og til den lest for Ctl ExECs; rød og blå streg linjer i (d) skitsere æggestokkene væv og værten væv, henholdsvis. Fejllinjer i (c) repræsenterer standardafvigelse mellem 3 replikater. Fejllinjer i (a, g-i) repræsenterer MAD mellem antallet flergangsbestemmelser opført eller vist i grafen. Skalalinjen = 100 µm (d). * P < 0,05, ** P < 0,005. Dette tal er blevet ændret fra mand et al. Sci Rep. 2017 Aug 15; 7 (1): 8203. Doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Løsning Saccharose-BTS (udarbejdet i trin 4.2.2) i μL DMSO i μL
Saccharose-BTS med 1 mol/L DMSO 2787 213
Saccharose-BTS med 0,5 mol/L DMSO 2894 106

Tabel 1: Saccharose løsning forberedelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her vi vise at co transplantation af exECs giver en betydelig fordel æggestokkene væv levedygtighed og funktion efter xenograft i mus. Standarder for klinisk anvendelse af æggestokkene væv auto-transplantation for fertilitet bevarelse har ikke set og de optimale parametre (størrelse, transplantation site, graft varighed osv.) 32 , 33 , 34 til øget nyttiggørelse af follikulært pool forblive udefineret. Når auto-transplantation udføres, udføres avascular podning af optøede kortikale æggestokkene væv primært i bækken websteder som resterende æggestokkene, æggestokke fossa eller brede ligament35,36. Da ingen ende til anastomose finder sted, resulterer denne transplantation metode i en bølge af iskæmisk væv tab og for tidlig aktivering af follikler bosat graften. Derfor, mens Co transplantation med exECs indebærer levering af proliferativ endotelceller, der kræver meget yderligere kontrol før at være i betragtning til klinisk anvendelse, denne tilgang kan fremskynde væv revaskularisering og kan redde en robust andel af follikler i æggestokkene podninger.

Disse resultater lagt frem en roman vaskulære celle-baseret strategi til at optimere æggestokkene væv levedygtighed og funktion efter transplantation. I betragtning af den voksende pulje af patienter vælger for at cryopreserve æggestokkene væv og seneste opkald til æggestokkene vævstransplantation til at flytte fra eksperimentelle status til åbne kliniske anvendelse37,38, kan denne metode tilbyde en terapeutisk strategi, der giver mulighed for større rentabilitet af grafts, hvorved antallet af æggestokkene kortikale strimler, der skal være transplanteret og øge deres levetid og/eller funktion.

Tidlig rekruttering, eller "udbrændthed", har også været forbundet med udtømning af follikulært pool under kemoterapi39, samt følgende auto transplantation af æggestokkene væv34. Talrige undersøgelser har identificeret signaling veje der fungerer til at aktivere undertrykke follikulært mobilisering, og afbrydelse af denne regulerende funktion kan resultere i en masse aktivering af follikulært pool under et kritisk iskæmisk vinduet når det metaboliske behov af spirende follikler er afskåret fra blive opfyldt. Anvendelse af exECs i denne sammenhæng ville ikke kun fremskynde reperfusion, men på grund af deres potentielle engraftment exECs kan også blive manipuleret til at give en direkte paracrine levering af faktorer der direkte follikulært mobilisering. Begrebet udnytte AMH som en modulator follikulært vækst er blevet anvendt af andre grupper. Kano et al. leverede AMH via enten osmotisk pumper med rekombinant protein eller IP injektion af virale partikler40. Disse tilgange resulterede i en lignende tendens i opbevaring af primordial follikler, men levering var systemisk. Som et alternativ, exECs secernerende AMH giver en lokal og bæredygtig kilde til AMH, dog indarbejdelse af manipuleret vaskulære celler i æggestokkene væv grafts er begrænset af utallige risici forbundet med celle-baserede behandlinger. Immunrespons mod udenlandske antigener på exECs er muligt og brug af proliferativ celler rejser muligheden for celler cirkulerer, implanterer og fremme neoplastiske vækst andetsteds i kroppen. Mens disse begrænsninger hinder oversættelse af denne tilgang til nuværende patienter i auto-transplantation, underbygge disse eksperimenter potentiale for pro-angiogene indflydelser og undertrykkelsen af for tidlig follikulært mobilisering til at forøge produktionen af æggestokkene væv podninger og etablere en robust xenograft model for mekanistisk undersøgelse af menneskelige æggestokkene fysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Michael Ginsberg er ansat af Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, USA, der isoleret, transfekteret med E4-ORF-1 og mærket endotelceller vi brugte.

Acknowledgments

Omar Alexander mand for illustrationerne.
L.M. blev støttet af en Pilot Award fra Cornell kliniske og Translational Science Center og en ASRM forskning tilskud.
Forfatterne vil gerne takke James lab medlemmer for kritisk læsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23 (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104 (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384 (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14 (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11 (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92 (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114 (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82 (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95 (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27 (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6 (4), e19475 (2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52 (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23 (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, discussion 17 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140 (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18 (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril. 69 (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93 (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22 (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79 (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75 (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28 (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153 (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99 (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45 (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30 (4), 1003 (2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34 (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32 (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106 (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5 (185), 185ra162 (2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), E1688-E1697 (2017).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 135 fertilitet bevarelse æggestokkene væv kryopræservering æggestokkene auto-transplantation co transplantation eksogene endotelceller (exECs) revaskularisering tidlig follikulært mobilisering anti-Mullerian hormon (AMH)
Co transplantation af menneskelige æggestokkene væv med manipuleret endotelceller: en celle-baseret strategi kombinere accelereret Perfusion med direkte Paracrine levering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Man, L., Park, L., Bodine, R.,… More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter