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Bioengineering

Co Transplantation von menschlichen Eierstockgewebe mit veränderter Endothelzellen: eine Zell-basierte Strategie-Kombination beschleunigt Perfusion mit direkten Parakrine Lieferung

doi: 10.3791/57472 Published: May 16, 2018

Summary

Bei einigen Patienten ist die einzige Option für die Erhaltung der Fruchtbarkeit Kryokonservierung von Ovargewebe. Leider untergräbt verzögerte Revaskularisation follikulären Lebensfähigkeit. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur menschlichen eierstockgewebe mit Endothelzellen für Nutzung als Kombination von Zell-basierte Strategie beschleunigt Perfusion mit einer direkten Parakrine Lieferung von bioaktiven Moleküle Co zu verpflanzen.

Abstract

Unfruchtbarkeit ist eine häufige Nebenwirkung der Chemotherapie und/oder Strahlentherapie und bei einigen Patienten, Kryokonservierung von Eizellen oder Embryonen ist keine Option. Als Alternative, eine wachsende Zahl von diesen Patienten entscheiden sich für Autotransplantation eierstockgewebe Tiefgefrieren nach Erholung und Remission. Trotz Verbesserungen in Ergebnisse bei Patienten, die Auto-Transplantation von kryokonservierten ovariellen Gewebe bleibt effiziente Revaskularisation des transplantierten Gewebes ein großes Hindernis. Ischämie zu mildern und somit bessere Ergebnisse bei Patienten mit Auto-Transplantation, entwickelten wir eine vaskuläre Zell-basierte Strategie zur Beschleunigung der Perfusion von eierstockgewebe. Wir beschreiben eine Methode zur Co Transplantation von exogenen Endothelzellen (Führungskräfte) mit kryokonservierten ovariellen Gewebe in einem Mausmodell Xenograft. Wir erweitern diesen Ansatz um ExECs, die entwickelt haben, um Anti-Müller-Hormon (AMH), konstitutiv zum Ausdruck zu bringen, damit nachhaltige Parakrine Signalisierung Eingabe für Eierstockkrebs Transplantate zu beschäftigen. Co Transplantation mit ExECs erhöhte follikuläre Volumen und verbesserte antrale Follikel Entwicklung und AMH exprimierenden ExECs Eigentumsvorbehalt ruhende primordialfollikel gefördert. Diese kombinierte Strategie kann ein nützliches Werkzeug für mildernde Ischämie und modulierende follikulären Aktivierung im Zusammenhang mit der Erhaltung der Fruchtbarkeit bzw. Unfruchtbarkeit bei großen sein.

Introduction

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Krebs nach wie vor zu den häufigsten Todesursachen in den Industrieländern noch jahrzehntelanger Forschung haben erhebliche Fortschritte bei den meisten Arten von Krebs, und in einigen Fällen fast verdoppelten überleben Preise1geführt. Chemotherapeutika sind leider oft lokalisierten, zum Abbau der Reserve der primordialfollikel in den Eierstöcken und Verringerung der Fruchtbarkeit2. Dieses Bevölkerungswachstum profitieren von verschiedenen Methoden der Fruchtbarkeit Erhaltung einschließlich Kryokonservierung von Eizellen oder Embryonen, Patienten, die eine sofortige Einleitung der Krebstherapie und präpubertären Patienten sind jedoch nicht für eine dieser Optionen. Als Alternative haben einige Patienten eierstockgewebe Tiefgefrieren vor dem Unternehmen ihre therapeutische Therapie und Erholung und Remission, Auto-Transplantation von Gewebe zur Wiederherstellung der Fruchtbarkeit3. Doch bislang bleiben Transplantat-überleben und follikulären Ausgabe nach Auto-Transplantation relativ niedrigen4, vor allem auf Gewebe Ischämie und Hypoxie5,6,7. Trotz zahlreicher Versuche, die Rentabilität der Eierstöcke kortikalen Grafts zu verbessern verwenden Anti-Oxidantien8,9, Pro-angiogenen Zytokine10,11,12,1 3oder mechanische Manipulationen14, Transplantat Ischämie in einem Fenster 5 bis 7 Tage nach der Transplantation untergräbt die Lebensfähigkeit und das Überleben des Transplantats7. Um dieses Problem anzugehen, haben wir eine Zell-basierte Strategie zur Anastomose Host und Transplantat Schiffe erleichtern und somit beschleunigen Reperfusion des ovariellen Gewebe entwickelt.

Neben der ischämische Beleidigung für veredelte eierstockgewebe im Fenster nach der Transplantation kann die Unterbrechung der Inter follikulären Signalisierung zu einer Erschöpfung der Pool15,16beitragen. Da exogene Endothelzellen (Führungskräfte), stabile und funktionierende Gefäße in der Peripherie des Transplantats beitragen, präsentieren sie eine einmalige Gelegenheit, einen definierten Molekulare Eingang transplantierten Gewebes zu vermitteln. Als Beweis des Prinzips waren ExECs, express Super-physiologischen Ebenen des Anti-Müller-Hormon (AMH), ein Mitglied der transformierende Wachstumsfaktor-Beta (TGFβ)-Superfamilie entwickelt, die gezeigt worden, um follicular Wachstum17zu beschränken. Vergleich der follikulären Verteilung in Transplantate gemeinsam mit Steuerung und AMH exprimierenden Zellen transplantiert überprüft die biologische Aktivität und die Potenz der veränderter ExECs.

Zusammenfassend lässt sich sagen kann dieser Ansatz durch die Verbesserung der Transplantat Lebensfähigkeit und unterdrücken vorzeitiger Mobilisierung des follikulären Pools, die Produktivität von Auto verpflanzt eierstockgewebe bei Patienten mit Erhaltung der Fruchtbarkeit erhöhen. Darüber hinaus ermöglicht die ExEC-basierte Plattform experimentelle Befragung der molekularen Regulatoren, die in follikulären Entwicklung verwickelt waren.

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Protocol

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Alle Verfahren, die tierische Themen wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) am Weill Cornell Medical College genehmigt. Alle Xenotransplantation Experimente mit eierstockgewebe wurden im Einklang mit geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Menschlichen eierstockgewebe wurde von Patienten für Chemo- oder Strahlentherapie zur Behandlung von Krebs oder vorherige Knochenmark-Transplantation geplant gesammelt. Das institutionelle Review Board (IRB) Ausschuss der Weill Cornell Medical College genehmigt die Sammlung des Gewebes für autologe Einsatzmöglichkeiten und nach Einwilligung des Patienten, eine Spende in Höhe von bis zu 10 % ihrer Ovargewebe für Forschungszwecke durchgeführt wurde.

1. Sammlung von menschlichen Eierstockgewebe

Hinweis: Bei einer ovariellen Gewebe von einem remote-Standort-Transit transportiert wird, sollte mal 5 h18,19nicht überschreiten.

  1. Das eierstockgewebe zu sammeln und mit einer sterilen Kochsalzlösung spülen.
  2. Platzieren Sie den Eierstock in einen sterilen Behälter.
  3. Gießen Sie Leibovitzs L-15 Medium bis Eierstock komplett in das Medium eingetaucht ist.
  4. Schließen Sie und verschließen Sie den Behälter.
  5. Transport des Containers auf dem Eis.

2. Verarbeitung der beschafften Eierstockgewebe, adaptiert von Schmidt Et al. 18

  1. Vorbereitungen für die Eierstöcke Verarbeitung und Einfrieren
    1. 100 mL des Mediums für die Verarbeitung vorbereitet: Leibovitzs L-15 mittlere 99 mL + 1 mL Antibiotikum antimykotische Lösung. Filtermedien Sie mit 0,2 µm-Filter. Halten Sie das Medium gekühlt.
    2. Bereiten Sie 100 mL eiskalte Lösung mit DMSO als Cryo-Schutzmittel. Fügen Sie 69,64 mL Leibovitz L-15 Mittel, 17,66 mL fötalen Rinderserum (FBS), 3,42 g Saccharose (erstelle ich eine Endkonzentration von 0,1 Mol/L), 10,65 mL DMSO (erstelle ich eine Endkonzentration von 1,5 Mol/L) und 1 mL Antibiotikum antimykotische Lösung. Filtern Sie das Medium mit einer 150 mL-Filter-Einheit, 0,2 µm. Store das Medium bei 4 ° C.
    3. Sterilisieren Sie die chirurgische Instrumente mit Autoklav für einen umschlossenen Feststoffe Sterilisationszyklus programmiert.
  2. Bei der Ankunft des Gewebes
    1. Inmitten der sterilen chirurgischen Werkzeugen der Biosicherheit Kabinett: Skalpell mit Klinge Nr. 21, gut scharf gebogene Schere und Zange auf unterschiedliche Größen: lange (ca. 150 mm Länge) und 2 mittlerer Größe (ca. 110 mm Länge).
    2. Tragen Sie sterile Handschuhe, öffnen Sie den Container innerhalb der Biosicherheit Kabinett. Nehmen Sie den Eierstock und legen Sie sie in einem 150 mm Petrischale und Gießen Sie kaltes Medium bereit im Schritt 2.1.1 auf dem Eierstock, Austrocknung der ovariellen Gewebe zu verhindern.
    3. Isolieren Sie des Eierstocks aus jeder verbleibende Gewebe und spülen Sie ihn mit kaltem Medium, bis es frei von Blut und Gewebe ist.
    4. Legen der Eierstöcke in einem sauberen 150 mm Petrischale, kalt Mittel, vorbereitet in Schritt 2.1.1 bis der Fruchtknoten halb unter Wasser drin ist.
  3. Dissektion der ovariellen Gewebe
    1. Halbieren Sie der Eierstöcke und entfernen Sie die Medulla zuerst durch scharfe Dissektion mit gekrümmten feinen Schere. Dann kratzen Sie die Medulla entfernt, mit einem sterilen Skalpell mit einer Klinge Nr. 21. Vorausgehen Sie, bis die kortikale Gewebe 1-1,5 mm dick ist.
    2. Splitter von 2-3 mm in der Breite der kortikale Gewebe geschnitten, wird die Länge des Streifens die gesamte Länge der Eierstöcke Stück sein, die verarbeitet wurde.

3. ovariellen Gewebe langsam Einfrieren, Adapted von Newton Et Al. und Oktay Et al. 6 , 20

  1. Vorbereitung für das Einfrieren
    1. Label Cryovials (1,8 mL).
    2. Zugeben Sie 1,5 mL die eiskalte Lösung vorbereitet in Schritt 2.1.2 jedes Fläschchen.
    3. Transfer einer kortikalen Streifen pro kryogenen Fläschchen mit dem Einfrieren Lösung.
    4. Equilibrate den kortikalen Strip für 20 min auf einer rotierenden Platte, sanfte Erregung bei 4 ° c anwenden
  2. Langsames Einfrieren von eierstockgewebe
    1. Laden Sie die Cryovials in einem programmierbaren Hobel Gefrierschrank beginnend bei 0 ° C.
    2. Bei 2 ° C/min bis-7 ° c abkühlen
    3. Halten Sie das Gewebe auf diese konstanten Temperatur 10 min. lang.
    4. Führen Sie die manuelle seeding für Eis Kristall Keimbildung Induktion, indem er jedes Cryoröhrchen mit einem Wattetupfer eingetaucht in flüssigem Stickstoff (LN2).
    5. Weiterhin bei 0,3 ° C/min abkühlen lassen, bis Probentemperatur-40 ° C.
    6. Kühlen Sie mit einer schnelleren Rate von 10 ° C/min bis-140 ° C.
    7. Cryovials auf die Dewar für die Lagerung in LN2 übertragen (-196 ° C).

4. Vorbereitungen für die Operationen (bilateraler Oophorectomy und Co Transplantation)

  1. Vorbereitung der Platten
    1. Einen Tag vor dem Auftauen der ovariellen Gewebes für Transplantationen
      1. Legen Sie ein Stück aus einem Kunststoff Paraffin-Film am unteren Rand ein 50 mm Petrischale, besprühen Sie sie mit 70 % Ethanol bis es vollständig verdeckt wird.
      2. Lassen Sie die Petrischalen über Nacht in der Biosicherheit Kabinett. 2 Petrischalen per Mausklick vorzubereiten.
    2. Am Tag der Operationen
      1. Aspirieren Sie Ethanol aus der Petrischale mit Kunststoff Paraffin Film innerhalb der Biosicherheit Kabinett.
      2. Lassen Sie die Petrischale Führung halb offen, bis Ethanol vollständig verdampft.
      3. Schließen Sie den Deckel der Petrischale, wenn der Kunststoff Paraffin Film vollständig trocken ist. Halten Sie es innerhalb der Biosicherheit Kabinett.
      4. Label-Brunnen von einem 6 Teller gut entsprechend 0,1 Mol/L Saccharose + 1 Mol/L DMSO, 0,1 Mol/L Saccharose + 0,5 Mol/L DMSO, 0,1 Mol/L Saccharose, grundlegende Auftauen Lösung (BTS), Medium.
  2. Vorbereitung der Lösungen
    1. 100 mL BTS vorbereiten: Leibovitzs L-15 mittlere 79 mL + FBS 20 mL + Antibiotikum antimykotische Lösung 1 mL. Filtern Sie mit einem 0,22 µm-Filter-System.
    2. 10 mL BTS mit 0,1 Mol/L Saccharose vorzubereiten. Skalieren Sie 0,342 g Saccharose zu und 10 mL BTS vorbereitet im Schritt 4.2.1, Rühren sanft, bis der Zucker vollständig aufgelöst ist. Die Lösung mit einer Spritze 0,22 µm filter.
    3. Bereiten Sie die Lösungen gemäß Tabelle 1. Decken Sie Röhrchen mit DMSO mit Alufolie ab. Bis zur Verwendung aufbewahren.

(5) Eierstockgewebe schnelle Auftauen

  1. Entnehmt der LN2 Dewar ein Fläschchen mit Einfrieren von eierstockgewebe und halten Sie sie bei Raumtemperatur für 30 s.
  2. Wischen Sie das Fläschchen mit einem Papiertuch sauber.
  3. Tauchen Sie das Fläschchen in einem 30 ° C Wasserbad für ca. 1-2 min. bis seine "Inhalt aufgetaut.
  4. Öffnen Sie das Fläschchen und des kortikalen Streifens in die erste Vertiefung, die 3 ml die erste Lösung (0,1 Mol/L Saccharose + 1 Mol/L DMSO, zubereitet im Schritt 4.2.3) enthält.
    Hinweis: Alle Schritte mit Öffnen des Deckels der Platte werden unter Laminar-Flow erfolgen.
  5. Inkubieren Sie die 6-well-Platte auf einer rotierenden Platte bei 4 ° C für 5 min. halten die Platte abgedeckt mit Alufolie für diesen Schritt.
  6. Übertragen des kortikalen Streifens in der zweite gut mit 3 mL des zweiten Lösung (0,1 Mol/L Saccharose + 0,5 Mol/L DMSO, zubereitet im Schritt 4.2.3).
  7. Inkubieren Sie die 6-well-Platte auf einer rotierenden Platte für sanfte Agitation bei 4 ° C für 5 min. halten die Platte abgedeckt mit Alufolie für diesen Schritt.
  8. Übertragen Sie die kortikalen Streifen in den dritten Brunnen, mit 4 mL der Lösung (BTS mit 0,1 Mol/L Saccharose, zubereitet im Schritt 4.2.2).
  9. Auf einer rotierenden Platte für sanfte Agitation bei 4 ° C für 5 min inkubieren.
  10. Übertragen des kortikalen Streifens in der vierten gut mit 4 mL der Lösung (BTS, zubereitet im Schritt 4.2.1).
  11. Auf einer rotierenden Platte für sanfte Agitation bei 4 ° C für 5 min inkubieren.
  12. Übertragen Sie den kortikalen Streifen in den letzten gut mit 4 mL kaltes Medium (vorbereitet in Schritt 2.1.1). Halten Sie aufgetaute Ovargewebe auf Eis, bis die Transplantation durchführen.

6. Kapselung der ovariellen Gewebe

  1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen
    1. Bereiten Sie 25 mL 20 Mmol/L HEPES-Puffer in 0,9 % Kochsalzlösung. Filtern und Lagerung bei 4 ° C.
    2. Bereiten Sie 1 mL CaCl2 bei der Konzentration von 1 Mol/L. Filter und Lagerung bei 4 ° C.
  2. Bereiten Sie eine Fibrinogen 50 mg/mL Stammlösung
    1. Fügen Sie 1 g Fibrinogen in 20 mL 20 Mmol/L HEPES-Puffer in 0,9 % Kochsalzlösung durch das Mischen von Fibrinogen langsam in die HEPES gepufferten Kochsalzlösung über mehrere Stunden bei 37 ° C.
    2. Beschriften Sie 1,7 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.
    3. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,45 µm-Spritze-Filter und dann durch einen 0,2 µm Spritze Filter.
    4. Aliquoten die Lösung in 200 µL in Mikro-Zentrifugenröhrchen und Store bei-20 ° C.
  3. Bereiten Sie eine Stammlösung Thrombin 100 U/mL
    Hinweis: Thrombin Lösungen adsorbieren, Glas, aliquoten die Lösung in Kunststoff Rohre/Fläschchen.
    1. 2,5 mL sterile Kochsalzlösung 0,9 % bis 250 U Thrombin hinzugeben.
    2. Sanftes Schütteln bis die Lösung vollständig auflösen.
    3. Beschriften Sie 1,7 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.
    4. Filtern Sie durch einen 0,2 µm Spritze Filter, aliquoten 50 µL in Mikro-Zentrifuge Tuben und Speicher bei-80 ° C.
  4. Machen Sie ein Fibrin-Gerinnsel von 70 µL, erhalten eine Endkonzentration von 10 mg/mL Fibrinogen und 5 U/mL Thrombin
    Hinweis: Stellen Sie sicher, schnell, die Lösung Klumpen in wenigen Sekunden zu arbeiten. Vermeiden Sie auch die Zugabe von Luftblasen auf die Mischung.
    1. Bereiten Sie eine Fibrinogen-Lösung in einem Mikro-Zentrifugenröhrchen 1,7 mL.
      1. Fügen Sie 360 µL 20 Mmol/L HEPES Buffer in 0,9 % Kochsalzlösung, die regelmäñig 200 µL der Fibrinogen-Aktie im Schritt 6.2.4 vorbereitet.
      2. Durch sanfte pipettieren mischen.
      3. Halten Sie es auf dem Eis.
    2. Bereiten Sie eine Thrombin-Lösung in eine zweite Mikro-Zentrifugenröhrchen.
      1. Die regelmäñig 50 µL der Thrombin-Aktie 148.7 µL DMEM hinzufügen im Schritt 6.3.4 vorbereitet.
      2. Durch sanfte pipettieren mischen.
      3. 1.3 µL 1 Mol/L CaCl2hinzufügen.
      4. Durch sanfte pipettieren mischen.
      5. Halten Sie es auf dem Eis.
    3. Bereiten Sie eine einzelne Zelle Aufhängung, In einem dritten Mikro-Zentrifugenröhrchen.
      1. Veränderten Endothelzellen aus der Platte mit einem Enzym Zelle Ablösung Medium zu lösen.
      2. Spin-down der und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer mit einem Deckglas.
      3. Verwenden Sie 20.000 Zellen pro alle 1 mm2 von eierstockgewebe. Berechnen Sie 20.000 X Fläche von Ovargewebe in mm2.
      4. Spin-down veränderten Endothelzellen und hängen Sie es erneut im Basismedium (DMEM), ein Gesamtvolumen von 16,8 µL zu erreichen.
      5. Halten Sie es auf dem Eis.
    4. Legen Sie ein Stück von eierstockgewebe auf eine sterile Gaze Schwamm es für ein paar Sekunden trocknen lassen.
    5. Legen Sie das Stück von eierstockgewebe auf Kunststoff Paraffin Film innerhalb der 50 mm Petrischale.
    6. Fügen Sie 39,2 µL der Fibrinogen-Lösung, zubereitet im Schritt 6.4.1.2, in die Zellsuspension in Schritt 6.4.3.4, Mix von sanften pipettieren vorbereitet. Halten Sie es auf dem Eis.
    7. Fügen Sie 14 µL der Thrombin-Lösung im Schritt 6.4.2.4 vorbereitet. Mischen Sie durch pipettieren einmal vorsichtig. Arbeiten Sie schnelles.
    8. Legen Sie die Mischung auf das eierstockgewebe pipettieren in Form eines länglichen Tropfens.
    9. Legen Sie die Petrischale mit den Klumpen im Inkubator bei 37 ° C.

7. bilaterale zurückliegend und Co Transplantation von menschlichen Eierstockgewebe mit veränderter Endothelzellen, NSG Mäuse

Hinweis: Zehn bis vierzehn Wochen alten weiblichen NSG Mäuse21 dienten (Jackson Labs).

  1. Bereiten Sie alle chirurgischen Instrumente, wie in Schritt 2.1.3, stellen Sie sicher, dass Sie alle Nähte, Pads und chirurgische Bänder praktisch.
  2. Die Maus mit einem Anästhesiesystem mit Isofluran zu betäuben.
    1. Platzieren Sie den Mauszeiger in der Kammer Induktion, schließen Sie Deckel und öffnen Sie den entsprechenden Absperrhahn.
    2. Offenen Durchflussmesser auf 1.000 mL/min schalten Sie den Verdampfer und setzen Sie ihn auf 2-3,5 % liefern.
    3. Beobachten Sie die Auswirkungen der Narkose; Verlust des Bewusstseins, langsame und regelmäßige Atemzüge.
    4. Übertragen Sie auf die bugnase, Narkose aufrechtzuerhalten. Drehen Sie den Verdampfer um 1-3 %, je nach Vitalfunktionen zu liefern.
    5. Abwesenheit von Pedal oder Schweif Reflex zu überprüfen. Wenn der Reflex vorhanden ist, erhöhen Sie Isofluran, bis es nicht vorhanden ist.
  3. Schneiden Sie die Maus wieder Haare, vom Heck bis zu den Schlüsselbeinen Linie, mit einem elektrischen Haarschneider.
  4. Platzieren Sie den Mauszeiger in Bauchlage auf die chirurgische Plattform.
  5. Fixieren Sie die bugnase zur chirurgischen Plattform mit einem chirurgischen Klebeband.
  6. Die Maus Glieder sanft auf die chirurgische Plattform mit 1,25 cm breiten chirurgischen Papierband mit Klebeband.
  7. Verwenden Sie eine sterile Gleitmittel Gelee und setzen Sie einen Thermometer PR Fix das Thermometer durch die chirurgische Plattform mit einem 1,25 cm breit perforiert plastische chirurgische Band abkleben.
  8. Das Heck auf die chirurgische Plattform mit 2,5 cm Breite chirurgische Papierband mit Klebeband.
  9. Wärme, mit einem Infrarot- oder ein Heizkissen, Warmwasser und überwachen die Maus Körpertemperatur während des Verfahrens. Halten Sie die Körpertemperatur im Bereich von 35-37 ° C.
  10. Reinigen Sie Löschbereichs mit einem sterilen Tupfer-Stock Povidon-Jod-Lösung und wischen Sie mit sterilem Alkohol Prep.
  11. Wiederholen Sie Schritt zwei weitere 6,9.
  12. Geben Sie einen Tropfen der sterilen okuläre Schmierstoff Tierarzt Salbe über die Maus Augen vor Austrocknung zu schützen und Schäden an der Hornhaut.
  13. Decken Sie die Maus mit einem sterilen op-Tuch ab.
  14. Buprenorphin (1 mg/Kg) subkutane (S/C) zu injizieren.
  15. Führen Sie eine längs-mediale dorsale Inzision mit einem Skalpell (Klinge #21).
  16. Durchführen Sie einer bilateralen zurückliegend, verwenden Sie einen dorsalen Ansatz.
    1. Befreien Sie das subkutane Bindegewebe durch stumpfe Dissektion mit der Schere.
    2. Kneifen Sie die Faszie seitlich an der Mittellinie machen einen Schnitt und erreichen Sie die Bauchhöhle mit der scharfen Schere zu.
    3. Schnappen Sie sich die Eierstöcke fettlappen und Eierstock vorsichtig mit einer Pinzette und aus der Bauchhöhle herausziehen.
    4. Fassen Sie den Eierstock und Fettpolster mit einer vaskulären Klammer.
    5. Verbinden Sie den Eierstock und mittels einer 4/0 Monofile resorbierbaren Naht an der Basis des Eierstocks, der Eileiter distal Fettpolster.
    6. Clip des Eierstocks distal der Krawatte. Stellen Sie sicher, es gibt keine Blutungen aus der Basis des Stumpfes.
    7. Legen Sie das Gewebe wieder in die Bauchhöhle und Naht der Faszie mit geflochtenen resorbierbaren Naht 6/0.
    8. Wiederholen Sie die Etappen 7.15.1-7.15.7 auf der kontralateralen Seite.
  17. Das eierstockgewebe Co zu verpflanzen.
    1. Führen Sie einen horizontalen Schnitt in der Faszie über den Gluteus Maximus, in der Länge, die Klumpen Abmessungen passt. Erstellen Sie eine Tasche in diesem virtuellen Raum durch das Öffnen der Schere unterhalb der Faszie.
    2. Einteiler der gekapselten kortikalen Gewebe, holen Sie ab, wie in Schritt 6.4.8 vorbereitet und legen Sie sie in diesem Fach.
    3. Naht der Faszie mit 6/0 geflochten resorbierbaren Naht.
  18. Wiederholen Sie die Etappen 7.16.1-7.16.3 auf der kontralateralen Seite sowie.
  19. Schließen der dorsalen Wand durch einfache unterbrochene Nähte mit einer 4/0 Monofile resorbierbaren Naht.
  20. Injektion von Lidocain 0,5 % (1,2 mL/Kg) S/C an der Schnitt-Stelle.
  21. Verwenden Sie eine sterile Alkohol-Prep, um die Haut zu reinigen.
  22. Schalten Sie die Isofluran während der Maus Temperaturüberwachung.
  23. Geben Sie 1 – 2 min. O2, ohne Isofluran. Erwärmung zu halten auf der Maus, bis es anfängt zu bewegen und ins Bewusstsein zurück.
  24. Platzieren Sie den Mauszeiger in eine saubere Wiederherstellung Käfig und später Haus der Maus in einem separaten Käfig, bis die vollständige Heilung der Operationswunde.
  25. Buprenorphin (1 mg/Kg) S/C bei Bedarf alle 8-12 h 24 Stunden postoperativ zu injizieren.
  26. Halten Sie die Mäuse in getrennten Käfigen, wenn alle Nahrung, Wasser, Bettwäsche, Käfige autoklaviert, bis zum Ende des Experiments sind. Halten Sie die Käfige in einem unter Druck stehenden belüfteten Raum. Persönliche Schutzausrüstung verwenden wenn die Mäuse zu behandeln.

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Representative Results

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Um festzustellen, ob Co Transplantation von ExECs einen Vorteil für Patienten Gewebe bietet, waren aufgetaute Eierstock kortikale Streifen in gleich große Stücke geteilt und pfropfte bilateral in Immuno-gefährdet, NOD scid Gamma (NSG), Mäuse. Mit einer Seite eingebettet in ein Fibrin Gerinnsel allein (kein ECs) und die andere mit ExECs (Abbildung 1a) jede Maus diente als seine eigene Kontrolle. ExECs erhielten über Isolierung der primären Endothel von menschlichen Nabelschnur und anschließende Behandlung mit adenoviralen gen Fragment E4-ORF1, wie zuvor beschrieben22,23. Innerhalb der Abschnitte 2 bis 5, menschliche nabelader ECs (HUVECs) wurden mit Lentivirale Partikel, die konstitutive Expression cDNA Kodierung adenoviralen gen Fragment E4-ORF1 kodieren behandelt. Diese Behandlung verbessert das Überleben und das angiogenen Potenzial des Endothels wie oben beschrieben22,23. Nach zwei Wochen bildeten sich funktional PERFUNDIERTEN Schiffe von GFP-Label Führungskräfte an der Schnittstelle von Wirtsgewebe und das Transplantat (Abbildung 1 b). Um funktionelle Gefäße beschriften, wurden Mäuse mit 100 mL Lektin (0,5 mg/mL) Isoflurane Narkose 10 Minuten vor der Ernte des Gewebes injiziert. Quantifizierung der Follikel 2 Wochen folgende Transplantation einen erheblichen Vorteil, relative Follikel demonstriert zählen in ExECs unterstützt Transplantate, die zwei Wochen (Abbildung 1 c) deutlich wurde. Exogene ECs funktionelle Gefäße gebildet, wenn Co transplantierten mit eierstockgewebe (Abbildung 1 b) und kortikalen Stücke zusammen mit der Maus transplantiert oder menschlichen ExECs stieg die Zahl der Überlebenden Follikel relativ zum Steuerelement Transplantate (Abbildung 1 c ). Dieser Vorteil wurde auf den verringerten fibrotische ExECs unterstützt Transplantate (Abbildung 1-d) verbunden – von jedem transplantierten Transplantat 3 Sektionen waren voller Flecken, mit Trichrome, ein etabliertes Mittel zur Abgrenzung der fibrotische Gewebe24, bewerten fibrotische Bereich: ein Mittelteil und 600 µm Tiefe Ausschnitt aus der oberen und unteren Seiten des Transplantats. Gefärbten Abschnitte wurden gescannt und analysiert mit ImageJ, um die Fläche zu quantifizieren und fibrotische Bereich wurde manuell beschrieben und quantifiziert als Prozentsatz der gesamten Transplantat Gegend (ImageJ-Software). Endwerte wurden für jedes Transplantat als der Durchschnitt der 3 Abschnitte analysiert berechnet. Wichtig ist, zeigte Transplantate, die zusammen mit menschlichen Vorhaut Fibroblasten transplantierten waren schlechte Gewebe Lebensfähigkeit und relativ wenige Follikel. (Abbildung 1e).

Wir beurteilen als nächstes die langfristige Funktion der Eierstöcke gewebetransplantate mit und ohne ExECs (Abb. 2ad, f, h). Nach 14 Wochen wurden Mäuse angeregt täglich mit menotropine für Variable Längen der Zeit, bevor Tiere geopfert wurden, mit dem Fortschreiten des Follikelwachstums in zwei Mäuse über MRI (Abbildung 2 b-C) überwacht. Entwickelnden Follikel festgestellt wurden in Kontrolle (Abb. 2e) und ExECs unterstützt Transplantate (Abbildung 2 g, i). Mehr und größere mittelständische Follikel wurden in die ExECs unterstützt Grafts (Abbildung 2 g, ich) bemerkt. Im Vergleich zu antrale Follikel leitet sich aus der gleiche Patient Gewebe, mit menotropine stimuliert und Co mit ExECs verpflanzt, die Granulosa Zelle Schicht im erweiterten Follikel erhöhten Ausdruck der ovulatorische Marker CD4425 angezeigt und HABP126, sowie erhöhte Zelltod (Caspase), und reduzierte Verbreitung (Ki67) (Abb. 2j).

Mehrere Studien haben gezeigt, dass der Pool der Follikel nach Transplantat von eierstockgewebe27,28,29,30vorzeitig aktiviert ist. Wir beobachteten eine ähnliche Entwicklung in mehrere Transplantate aus einem einzigen Patienten nach 2, 3 und 14 Wochen (Abbildung 3a). Damit die vermuteten Funktion des AMH nutzen können in unterdrücken Aktivierung und/oder Wachstum der Follikel17,31, entwickelt wir ExECs mit Lentivirus konstitutiv zum Ausdruck bringen und somit eine direkte Parakrine Quelle von AMH, absondern transplantierten eierstockgewebe (Abb. 3 b). Lentivirale Transduktion erhöht 100-fold oben GC in ExEC, die sonst nicht nachweisbare Mengen von AMH ausgedrückt. Granulosa Zellen Tumorzellen, abgesondert auf der anderen Seite eine basale Ebene des AMH in der Zellkultur überstand. (Abb. 3 c). Zwei Wochen nach der Transplantation Co, abgeleitet von ExECs Schiffe wurden an der Host-Transplantat-Schnittstelle beobachtet und Immunostaining offenbart reichlich AMH-Protein in das Lumen der Gefäße abgeleitet von AMH-ExECs (Abbildung 3d) im Vergleich zu Schiffe aus gebildet ExECs zu kontrollieren. Um die Funktion des AMH unabhängig von der Pro-angiogenen Einfluss von ExECs testen, benutzten wir mesenchymalen Stammzellen (MSC), der aus Fragmenten der ovarian Medulla isoliert wurden. Diese Zellen wurden mit Lentivirale Partikel Codierung AMH ausgestrahlt und in Kultur für den Einsatz in Co Transplantation erweitert. Auf Co-Transplantation mit AMH-ExECs wurde eine 2-fache Erhöhung des Anteils der primordialfollikel beobachtet. Dies führt jedoch zu einer Abnahme des Anteils der primären Follikel. AMH-MSCs führen zu erhöhten Eigentumsvorbehalt primordialfollikel von 10-divisibel relativ zum Steuerelement MSCs (Abbildung 3f, h). Der wichtigste Vorteil für die Beibehaltung des ruhenden follikulären Pools wurde durch AMH-ECs verliehen, wenn ein Vergleich zwischen MSCs ExECs, nicht-zellulären Transplantationen (Ctl), AMH-MSCs ExEC und AMH-ExECs (Abbildung 3i) gemacht wurde.

Figure 1
Abbildung 1: Co Transplantation von Eierstockkrebs kortikalen Streifen mit ExECs verbessert die Lebensfähigkeit und bewahrt den follikulären Pool. (a) Schema der Versuchsanordnung. Aufgetauten menschlichen eierstockgewebe wurde in ein Fibrin-Gerinnsel, mit oder ohne ExECs gekapselt. Die Klumpen waren in oophorectomized NSG Mäusen verpflanzt und am Endpunkt des Experiments geerntet. (b) menschlichen kortikalen Grafts verpflanzt Co mit HUVECs abgeleitet ExECs (grün); rote Blutkörperchen sind gekennzeichnet durch TER-119 und Grenzen des Transplantats sind in weiß dargestellt. (c) der mittlere Anteil der gesamten Follikel von Transplantation mit und ohne Maus oder menschlichen ExECs + Mad * P < 0,05. (d) der mittlere Anteil der fibrotische Bereich Transplantation mit und ohne Maus oder menschlichen ExECs + Mad ** P < 0,001. (e) repräsentative Abschnitte der Eierstöcke Grafts verpflanzt Co mit ExECs, ohne Zellen, und menschliche Vorhaut Fibroblasten. Diese Zahl wurde von Mann Et Al. modifiziert Sci-Rep 2017 15 Aug; 1:8203. Doi: 10.1038/s41598-017-08491-Z. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: langfristige Rentabilität und die Funktion der Eierstöcke gewebetransplantate verbessert, indem ExECs. In Zahlen b, c, d, f und h sind die Transplantate auf der linken Seite die Kontrolle-kein ECs, während auf der rechten Seite der Grafts mit ExECs Co verpflanzt. (a) experimentelle Schema für langfristige Xenograft von kortikalen eierstockgewebe. (b) In Zahlen b und c stellt das Sternchen (Rechte Seite) der ovarielle Gewebe zusammen mit ECs, verpflanzt, während die Pfeilspitze (linke Seite) der ovarielle Gewebe verpflanzt mit keine Zellen darstellt. Maus #1 war xenografted mit Gewebe von einem 6 Jahre alten Spender und überwacht von MRI zu Beginn der Stimulation (14 Wochen, Links) und nach zehn Tagen der Stimulation (15,5 Wochen, rechts) wieder. (c) Maus #3 war xenografted mit Gewebe von einem 19 Jahre alten Spender und überwacht mittels MRT bei 6 (20 Wochen nach der Transplantation), 7 (21 w) und 8 (22 w) Wochen nach dem Beginn der Stimulation. (d) makroskopische Bild von der eingepflanzt menschlichen eierstockgewebe geerntet bei 15,5 Wochen Maus #1, das Transplantat auf der rechten Seite ist der ExEC-gestützte Prothese und eine histologische Kontrolle Transplantat ist in (e) angezeigt. (f) makroskopische Bild der Grafts, Maus #2 wurde nach 20 Wochen geopfert und Kontrolle und ExEC-gestützte Transplantate wurden für die histologische Analyse geerntet; die ExEC-gestützte Prothese zeigt sich in (g). (h) makroskopische Bild der Grafts in Maus #3, die nach 22 Wochen geopfert wurde, histologische Analyse der ExEC-gestützte Prothese (i) zeigt. (j) Abschnitte der ExEC-gestützte Grafts aus Maus #2 und #3 Maus für molekulare Marker gefärbt waren und sind im zugehörigen Feld vergrößert. Skalieren von Balken = 100 µm. Diese Zahl wurde von Mann Et Al. modifiziert Sci-Rep 2017 15 Aug; 1:8203. Doi: 10.1038/s41598-017-08491-Z. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: ExECs entwickelt, um die AMH express erhalten einen ruhenden follikulären Pool. (a) der Anteil der Follikel war für mehrere eierstockgewebe Fragmente vom selben Patienten quantifiziert, die lang- und kurzfristigen Abständen Co transplantierten mit ECs wurden; n = 3 bei 2 Wochen, n = 4 auf 3 Wochen und n = 2 bei 14 Wochen. (b) Schema der Versuchsanordnung. Aufgetauten menschlichen eierstockgewebe wurde in ein Fibrin-Gerinnsel ExECs/MSCs ausgestrahlt mit ein RFP Lentivirale Partikel dienen als Kontrolle oder ExECs/MSCs ausgestrahlt mit einem AMH-mCherry Lentivirale Partikel erzeugen AMH-ECs/MSCs gekapselt. Die Klumpen waren in oophorectomized NSG Mäusen verpflanzt und 2 Wochen geerntet. (c) ExECs wurden mit Lentivirus Codierung sekretierten menschlichen AMH ausgestrahlt; Zelle Kultur überstand der AMH ausgestrahlt ExECs wurde mit COV-434-Kultur-Granulosa-Zell-Tumor-Linie und Kontrolle ExECs verglichen. (d) zwei Wochen nach der Transplantation, eierstockgewebe Fragmente, die mit beiden ECs (links) Co transplantiert wurden oder AMH-ExECs (rechts) waren voller Flecken mit einem Antikörper spezifisch für AMH-Protein. (e) der relative Anteil der Follikel in Xenotransplantate Co mit Steuerung und AMH-ExECs transplantiert wurde nach 2 Wochen quantifiziert (n = 6). (f) der relative Anteil der Follikel in Xenotransplantate Co mit Steuerung und AMH-MSCs transplantiert wurde nach 2 Wochen quantifiziert (n = 6). (g) der Median + MAD des relativen Anteils der Follikel war gegenüber im Xenotransplantate mit Steuerung und AMH ausgestrahlt ExECs transplantiert (n = 6) 2 Wochen folgen. (h) der mittlere + MAD relativen Anteil der Follikel war gegenüber im Xenotransplantate verpflanzt mit Steuerung und AMH ausgestrahlt MSCs (n = 6) 2 Wochen folgen. (i) der mittlere Anteil der beobachteten primordialfollikel pro Graft verpflanzt mit MSCs Xenotransplantate (n = 6), ExECs (n = 6), AMH-MSCs (n = 6), und AMH-ExECs (n = 6) verglich in ihrer Gesamtheit zur Kontrolle Bedingungen (keine Zellen, n = 15). Einsätze in (d) sind in den Feldern auf der rechten Seite für AMH-ExECs und vergrößert die damit für Ctl ExECs; rote und blaue Strich Linien in (d) umreißen Gewebe und Host eierstockgewebe, beziehungsweise. Fehlerindikatoren in (c) repräsentieren die Standardabweichung auf 3 Wiederholungen. Fehler-bars in (a, g-i) MAD zwischen der Anzahl der Wiederholungen aufgeführt oder des Diagramms darstellen. Maßstabsleiste = 100 µm (d). * P < 0,05, ** P < 0,005. Diese Zahl wurde von Mann Et Al. modifiziert Sci-Rep 2017 15 Aug; 1:8203. Doi: 10.1038/s41598-017-08491-Z. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Lösung Saccharose-BTS (vorbereitet in Schritt 4.2.2) in μL DMSO in μL
Saccharose-BTS mit 1 Mol/L DMSO 2787 213
Saccharose-BTS mit 0,5 Mol/L DMSO 2894 106

Tabelle 1: Vorbereitung der Saccharose-Lösung.

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Discussion

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Hier zeigen wir, dass Co Transplantation von ExECs bietet einen erheblichen Vorteil eierstockgewebe Rentabilität und Funktion nach Xenograft bei Mäusen. Normen für die klinische Anwendung von eierstockgewebe Auto-Transplantation für die Erhaltung der Fruchtbarkeit wurden nicht gesetzt und die optimalen Parameter (Größe, Transplantation Ort, Dauer des Transplantats, usw.) 32 , 33 , 34 für die Erweiterte Wiederherstellung des follikulären Pools bleiben undefiniert. Wenn Auto-Transplantation durchgeführt wird, erfolgt die avaskulären Pfropfung der aufgetauten kortikalen eierstockgewebe vor allem im Becken-Seiten wie die verbleibenden Eierstock, Eierstöcke Fossa oder breiten Ligamentum35,36. Da keine End-to-End-Anastomose stattfindet, führt diese Transplantation-Methode eine Welle von ischämischen Gewebeverlust und vorzeitigen Aktivierung der Follikel, die ihren Wohnsitz innerhalb der Prothese. Daher, während Co Transplantation mit ExECs Lieferung proliferative Endothelzellen mit sich, die viel weitere Prüfung erfordern bringt vor der Prüfung wird für die klinische Anwendung, dieser Ansatz kann Gewebe Revaskularisation beschleunigen und retten kann ein robuste Anteil der Follikel im Eierstock Transplantate.

Diese Erkenntnisse streckte eine neuartige vaskuläre zellbasierte Strategie zur Optimierung von eierstockgewebe Lebensfähigkeit und Funktion nach Transplantation. Angesichts der wachsenden Pool von Patienten entscheiden sich für eierstockgewebe und Anrufverlauf für Transplantationen eierstockgewebe Tiefgefrieren von experimentellen Status wechseln, um die klinische Anwendung37,38öffnen, kann diese Methode bieten eine therapeutische Strategie, die es höhere Rentabilität der Grafts ermöglicht, wodurch die Anzahl der Eierstöcke kortikalen Streifen, die transplantiert werden muss und die Erhöhung ihrer Langlebigkeit und/oder Funktion.

Vorzeitige Rekrutierung oder "Burnout", wurde auch die Erschöpfung des follikulären Pools während der Chemotherapie39sowie folgende Auto-Transplantation von eierstockgewebe34verbunden. Zahlreiche Studien haben Signalwege die Funktion zur Aktivierung des unterdrückens follikulären Mobilisierung identifiziert, und die Störung dieser regulatorischen Funktion kann dazu führen, dass eine Masse Aktivierung des follikulären Pools während einer kritischen ischämischen Fenster bei der metabolischen Bedürfnisse der im Entstehen begriffene Follikel können nicht erfüllt werden. Anwendung der in diesem Zusammenhang ExECs Reperfusion nicht nur beschleunigen würde, aber aufgrund ihrer potenziellen Engraftment können ExECs auch ausgeführt werden, um eine direkte Parakrine Faktoren, dass direkte follikulären Mobilisierung versorgen. Der Begriff der Verwendung von AMH als Modulator der follikulären Wachstums wurde von anderen Gruppen sowie angewandt. Kano Et al. gelieferten AMH über entweder osmotischen Pumpen mit rekombinanten Proteinen oder IP-Injektion von Viruspartikel40. Diese Ansätze ergab eine ähnliche Tendenz in der Beibehaltung der primordialfollikel, aber die Lieferung war systemische. Als Alternative ExECs sezernierenden AMH bieten eine lokale und nachhaltige Quelle für AMH, jedoch ist die Aufnahme von veränderter vaskuläre Zellen im Eierstock gewebetransplantate durch unzählige Risiken im Zusammenhang mit Zelltherapien begrenzt. Immunantwort auf fremde Antigene auf ExECs ist möglich und Verwendung von proliferativen Zellen ergibt sich die Möglichkeit der Zellen im Umlauf, Implantation und neoplastischen Wachstum an anderer Stelle im Körper zu fördern. Während diese Einschränkungen Übersetzung dieses Ansatzes für aktuelle Patienten, die Auto-Transplantation auszuschließen, belegen diese Experimente das Potenzial für Pro-angiogenen Einflüsse und Unterdrückung der vorzeitigen follikulären Mobilisierung zu erweitern die Ausgabe von eierstockgewebe Transplantationen und Einrichtung eines robusten Xenograft-Modell für die mechanistische Untersuchung der Eierstöcke Humanphysiologie.

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Disclosures

Michael Ginsberg ist Angestellter des Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Vereinigte Staaten, das isoliert, mit E4-ORF-1 transfiziert und beschriftet die Endothelzellen, die wir verwendet.

Acknowledgments

Omar Alexander Mann für die Illustrationen.
L.M wurde unterstützt durch einen Pilot-Award von der Cornell-klinische und Translationale Science Center und ein ASRM Forschungsstipendium.
Die Autoren möchten James Labor für kritische Lektüre des Manuskripts danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

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Co Transplantation von menschlichen Eierstockgewebe mit veränderter Endothelzellen: eine Zell-basierte Strategie-Kombination beschleunigt Perfusion mit direkten Parakrine Lieferung
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Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

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