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Bioengineering

इंजीनियर Endothelial कोशिकाओं के साथ मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के सह प्रत्यारोपण: प्रत्यक्ष Paracrine वितरण के साथ त्वरित छिड़काव के संयोजन एक सेल आधारित रणनीति

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57472
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4, 1,3, 1,3
1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Angiocrine Biosciences, Inc., 3Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College, 4Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

कुछ रोगियों के लिए, प्रजननता संरक्षण के लिए एकमात्र विकल्प डिम्बग्रंथि ऊतक के cryopreservation है । दुर्भाग्य से, विलंबित revascularization फुफ्फुसीय व्यवहार्यता को नजरअंदाज कर । यहाँ, हम एक सेल के रूप में उपयोग करने के लिए endothelial कोशिकाओं के साथ सह प्रत्यारोपण मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान सक्रिय अणुओं की एक सीधी paracrine वितरण के साथ त्वरित छिड़काव के संयोजन रणनीति.

Abstract

बांझपन कीमोथेरेपी और/या रेडियोथेरेपी के एक अक्सर पक्ष प्रभाव है और कुछ रोगियों के लिए, अंडाणुओं या भ्रूण के cryopreservation एक विकल्प नहीं है । एक विकल्प के रूप में, इन रोगियों की बढ़ती संख्या वसूली और छूट निम्नलिखित भ्रष्टाचार के लिए डिंबग्रंथि के ऊतकों cryopreserve करने के लिए चुन रहे हैं । cryopreserved डिम्बग्रंथि ऊतक के ऑटो प्रत्यारोपण के दौर से गुजर रोगियों के बीच परिणामों में सुधार के बावजूद, भ्रष्टाचारी ऊतक के कुशल revascularization एक बड़ी बाधा बनी हुई है. ischemia को कम करने और इस तरह ऑटो प्रत्यारोपण के दौर से गुजर रोगियों में परिणामों में सुधार, हम डिम्बग्रंथि ऊतक के छिड़काव में तेजी लाने के लिए एक संवहनी कोशिका आधारित रणनीति विकसित की है । हम एक माउस xenograft मॉडल में cryopreserved डिम्बग्रंथि ऊतक के साथ exogenous endothelial कोशिकाओं (ExECs) के सह प्रत्यारोपण के लिए एक विधि का वर्णन । हम इस दृष्टिकोण का विस्तार करने के लिए ExECs है कि constitutively एक्सप्रेस विरोधी Mullerian हार्मोन (AMH), इस प्रकार डिंबग्रंथि भ्रष्टाचारियों को निरंतर paracrine संकेतन इनपुट को सक्षम करने के लिए इंजीनियर गया है काम करते हैं । ExECs के साथ सह-प्रत्यारोपण की गई तोंसिल्लितिस की मात्रा और सुधार कोटरीय कूप विकास, और AMH-व्यक्त ExECs quiescent मौलिक के रोम के प्रतिधारण को बढ़ावा दिया । इस संयुक्त रणनीति के ischemia को कम करने और प्रजनन क्षमता के संरक्षण के संदर्भ में फुफ्फुसीय सक्रियण मॉडुलन के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है या बड़े पैमाने पर/

Introduction

कैंसर विकसित दुनिया में मौत के प्रमुख कारणों में से एक है, अभी तक अनुसंधान के दशकों के कैंसर के अधिकांश प्रकार के लिए महत्वपूर्ण प्रगति की उपज है, और कुछ मामलों में लगभग जीवित रहने की दर1दोगुनी । दुर्भाग्य से, कीमोथेरेपी एजेंटों अक्सर gonadotoxic हैं, अंडाशय में मौलिक कूप के आरक्षित घट रही है और प्रजनन क्षमता को कम करने2। इस बढ़ती आबादी oocyte और/या भ्रूण cryopreservation सहित प्रजननता संरक्षण के विभिंन तरीकों से लाभ उठा सकते हैं, तथापि, कैंसर थेरेपी और पूर्व pubertal रोगियों के शीघ्र दीक्षा की आवश्यकता रोगियों इन विकल्पों के लिए अयोग्य हैं । एक विकल्प के रूप में, कुछ रोगियों को अपने चिकित्सीय आहार उपक्रम से पहले डिम्बग्रंथि ऊतक cryopreserve चुना है, और वसूली और छूट पर, ऑटो-प्रत्यारोपण ऊतक प्रजनन क्षमता को बहाल करने के लिए3. फिर भी, तिथि करने के लिए, भ्रष्टाचार जीवन रक्षा और तोंसिल्लितिस उत्पादन निंनलिखित ऑटो प्रत्यारोपण अपेक्षाकृत कम4रहना, मुख्य रूप से ऊतक ischemia और हाइपोक्सिया5,6,7के कारण । विरोधी oxidants का उपयोग कर डिम्बग्रंथि cortical भ्रष्टाचार की व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए कई प्रयासों के बावजूद8,9, प्रो-angiogenic साइटोकिंस10,11,12,1 3, या यांत्रिक जोड़तोड़14, भ्रष्टाचार के ischemia में एक 5 से 7 दिन खिड़की के बाद प्रत्यारोपण व्यवहार्यता और भ्रष्टाचार7के अस्तित्व को नजरअंदाज कर । इस पते के लिए, हम मेजबान और भ्रष्टाचार के जहाजों की सम्मिलन की सुविधा के लिए एक सेल आधारित रणनीति विकसित की है और इस तरह डिम्बग्रंथि ऊतक के reperfusion गुजारिश की ।

बाद प्रत्यारोपण खिड़की में भ्रष्टाचारी डिम्बग्रंथि ऊतक के लिए कोरोनरी अपमान के अलावा, अंतर-तोंसिल्लितिस के विघटन के पूल में कमी करने के लिए योगदान कर सकते हैं15,16. क्योंकि exogenous endothelial कोशिकाओं (ExECs) भ्रष्टाचार की परिधि में स्थिर और कामकाजी जहाजों के लिए योगदान, वे प्रत्यारोपण ऊतक के लिए एक परिभाषित आणविक इनपुट व्यक्त करने के लिए एक अनूठा अवसर मौजूद. सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, ExECs विरोधी Mullerian हार्मोन (AMH), बदलने वाले विकास कारक बीटा (TGFβ) superfamily कि तोंसिल्लितिस विकास को सीमित करने के लिए दिखाया गया है के एक सदस्य के सुपर शारीरिक स्तर व्यक्त करने के लिए इंजीनियर थे17. भ्रष्टाचारियों में तोंसिल्लितिस के वितरण की तुलना नियंत्रण और AMH-व्यक्त कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपण जैविक गतिविधि और इंजीनियर exECs की शक्ति की पुष्टि ।

सारांश में, भ्रष्टाचार व्यवहार्यता में सुधार और तोंसिल्लितिस पूल के समय से पहले जुड़ाव को दबाने के द्वारा, इस दृष्टिकोण प्रजनन क्षमता संरक्षण के दौर से गुजर रोगियों में ऑटो प्रत्यारोपण डिम्बग्रंथि ऊतक की उत्पादकता में वृद्धि कर सकते हैं । इसके अलावा, ExEC-मंच आधारित आणविक नियामकों है कि तोंसिल्लितिस के विकास में फंसा दिया गया है की प्रयोगात्मक पूछताछ सक्षम बनाता है ।

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Protocol

पशु विषयों को शामिल सभी प्रक्रियाओं Weill कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है । डिम्बग्रंथि ऊतक का उपयोग कर सभी xenotransplantation प्रयोगों प्रासंगिक दिशा निर्देशों और विनियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया. मानव डिम्बग्रंथि ऊतक कैंसर के उपचार या पूर्व अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के लिए कीमोथेरेपी या रेडियोथेरेपी के लिए अनुसूचित रोगियों से एकत्र किया गया था । Weill कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज की संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) समिति ने संभावित ऑटोलॉगस उपयोग के लिए ऊतक के संग्रह को मंजूरी दे दी है, और रोगी के सूचित सहमति पर अनुसंधान के उपयोग के लिए उनके डिम्बग्रंथि ऊतक के 10% तक का दान किया गया था ।

1. मानव डिम्बग्रंथि ऊतक का संग्रह

नोट: जब एक डिम्बग्रंथि ऊतक दूरस्थ सुविधा पारगमन से पहुंचाया जाता है, तो समय 5 एच18,19से अधिक नहीं होना चाहिए ।

  1. डिम्बग्रंथि ऊतक ले लीजिए और एक बाँझ खारा समाधान के साथ कुल्ला.
  2. अंडाशय बाँझ कंटेनर में रखें ।
  3. Leibovitz के एल-15 मध्यम डालो जब तक अंडाशय पूरी तरह से मध्यम में डूब गया है ।
  4. कंटेनर को बंद करें और सील करें.
  5. बर्फ पर कंटेनर परिवहन ।

2. प्रसंस्करण की खरीद डिम्बग्रंथि ऊतक, श्मिट एट अल से अनुकूलित. 18

  1. डिम्बग्रंथि प्रसंस्करण और ठंड के लिए तैयारियां
    1. प्रसंस्करण के लिए १०० मिलीलीटर मध्यम तैयार करें: Leibovitz के एल-15 मध्यम ९९ मिलीलीटर + 1 मिलीलीटर एंटीबायोटिक-antimycotic समाधान । फ़िल्टर मीडिया ०.२ µm फ़िल्टर का उपयोग कर । मध्यम प्रशीतित रखें ।
    2. एक क्रायो-संरक्षक के रूप में DMSO का उपयोग कर ठंड समाधान के १०० मिलीलीटर तैयार करें । जोड़ें ६९.६४ एमएल Leibovitz के एल-15 मध्यम, १७.६६ मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), सुक्रोज के ३.४२ ग्राम (०.१ मॉल के अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए/एल), १०.६५ एमएल DMSO (१.५ मॉल के अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए/एल), और 1 मिलीलीटर एंटीबायोटिक-antimycotic समाधान । एक १५० मिलीलीटर फिल्टर इकाई, ०.२ µm. 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम स्टोर का उपयोग कर मध्यम फ़िल्टर ।
    3. एक लिपटे ठोस नसबंदी चक्र के लिए क्रमादेशित एक आटोक्लेव का उपयोग कर सर्जिकल उपकरण निष्फल ।
  2. ऊतक के आगमन पर
    1. सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरण सेट करें: ब्लेड नंबर 21 के साथ स्केलपेल, तेज महीन घुमावदार कैंची और विविध आकारों में संदंश: लंबे (लगभग १५० मिमी लंबाई) और 2 मध्यम आकार के (लगभग ११० मिमी लंबाई) ।
    2. बाँझ दस्ताने पहनते हैं, के भीतर सुरक्षा कैबिनेट के कंटेनर खुला । अंडाशय ले लो और यह एक १५० mm पेट्री डिश में जगह और ठंडे मध्यम डिम्बग्रंथि ऊतक के निर्जलीकरण को रोकने के लिए अंडाशय के शीर्ष पर कदम 2.1.1 में तैयार डालो ।
    3. किसी भी अवशिष्ट ऊतक से अंडाशय को अलग और इसे ठंडे माध्यम से कुल्ला जब तक यह ऊतक और रक्त से रहित है ।
    4. अंडाशय को एक साफ १५० mm पेट्री डिश में रखें, ठंडा मध्यम, चरण 2.1.1 में तैयार जब तक अंडाशय आधा में जलमग्न हो जाता है ।
  3. डिम्बग्रंथि ऊतक के विच्छेदन
    1. अंडाशय Bisect और तेज विच्छेदन से पहले मज्जा को दूर, घुमावदार ठीक कैंची का उपयोग कर । फिर मज्जा दूर परिमार्जन, एक ब्लेड संख्या 21 के साथ बाँझ स्केलपेल का उपयोग कर । पहले जब तक cortical ऊतक मोटाई में 1-1.5 मिमी है ।
    2. चौड़ाई में 2-3 mm के अभिजात्य में cortical ऊतक काटें, पट्टी की लंबाई डिम्बग्रंथि टुकड़ा है कि संसाधित किया गया था की पूरी लंबाई हो जाएगा ।

3. डिम्बग्रंथि ऊतक धीमी ठंड, ंयूटन एट अलसे अनुकूलित । और Oktay एट अल । ६ , 20

  1. ठंड के लिए तैयारी
    1. लेबल cryovials (१.८ mL).
    2. प्रत्येक शीशी के लिए कदम 2.1.2 में तैयार ठंड समाधान के १.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. एक क्रायोजेनिक शीशी ठंड समाधान युक्त प्रति एक cortical पट्टी स्थानांतरण ।
    4. एक घूर्णन प्लेट पर 20 मिनट के लिए cortical पट्टी Equilibrate, 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन लागू होते हैं ।
  2. डिम्बग्रंथि ऊतक की धीमी ठंड
    1. 0 ° c पर प्रारंभ कर रहा है एक प्रोग्राम प्लानर फ्रीजर में cryovials लोड ।
    2. 2 ° c/मिनट के लिए-7 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा ।
    3. इस लगातार तापमान पर 10 मिनट के लिए ऊतकों रखें ।
    4. बर्फ क्रिस्टल nucleation प्रेरण के लिए मैनुअल सीडिंग प्रदर्शन, एक कपास तरल नाइट्रोजन में डूबे टिप के साथ प्रत्येक cryovial को छूने से (LN2) ।
    5. ४० डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है जब तक नमूना तापमान पर ०.३ डिग्री सेल्सियस/
    6. 10 डिग्री सेल्सियस/-१४० डिग्री सेल्सियस के एक तेज दर पर ठंडा ।
    7. LN2 (-१९६ डिग्री सेल्सियस) में भंडारण के लिए देवर के लिए cryovials स्थानांतरण ।

4. सर्जरी के लिए तैयारियां (द्विपक्षीय Oophorectomy और सह-प्रत्यारोपण)

  1. प्लेटिंग की तैयारी
    1. प्रत्यारोपण के लिए डिम्बग्रंथि ऊतक गल करने के लिए एक दिन पहले
      1. एक ५० mm पेट्री डिश के तल पर एक प्लास्टिक आयल फिल्म का एक टुकड़ा प्लेस, यह ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे जब तक यह पूरी तरह से कवर किया जाएगा ।
      2. पेट्री व्यंजन को रात भर के लिए छोड़ दें । माउस प्रति 2 पेट्री व्यंजन तैयार करें ।
    2. सर्जरी के दिन
      1. महाप्राण ने पेट्री डिश से युक्त प्लास्टिक आयल फिल्म को ' द सेफ्टी कैबिनेट ' के भीतर इथेनॉल से भरा ।
      2. पेट्री डिश सीसा आधा खुला छोड़ जब तक इथेनॉल पूरी तरह से लुप्त हो जाता है ।
      3. प्लास्टिक आयल फिल्म पूरी तरह से शुष्क होने पर पेट्री डिश का ढक्कन बंद कर लें । यह सुरक्षा कैबिनेट के भीतर रखो ।
      4. एक 6 खैर प्लेट के लेबल कुओं तदनुसार, ०.१ मॉल/l सुक्रोज + 1 मॉल/l DMSO, ०.१ मॉल/l सुक्रोज + ०.५ मॉल/l DMSO, ०.१ मॉल/l सुक्रोज, बेसिक गल सॉल्यूशन (बीटीएस), मीडियम.
  2. समाधान की तैयारी
    1. बीटीएस के १०० मिलीलीटर तैयार करें: Leibovitz के एल-15 मीडियम ७९ एमएल + FBS 20 एमएल + एंटीबायोटिक-Antimycotic सॉल्यूशन 1 एमएल । ०.२२ µm फ़िल्टर सिस्टम के साथ फ़िल्टर करें ।
    2. ०.१ मॉल/L सुक्रोज के साथ बीटीएस की 10 मिलीलीटर तैयार करें । स्केल ०.३४२ g of सुक्रोज और चरण 4.2.1 में तैयार बीटीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे आंदोलन जब तक सुक्रोज पूरी तरह से भंग है । समाधान एक सिरिंज फ़िल्टर ०.२२ µm का उपयोग कर फ़िल्टर करें ।
    3. तालिका 1के अनुसार समाधान तैयार करें । आवरण एल्यूमीनियम पंनी के साथ DMSO युक्त ट्यूबों । उपयोग तक प्रशीतित रखें ।

5. डिम्बग्रंथि ऊतक तेजी से गल

  1. LN2 देवर एक शीशी जमे हुए डिम्बग्रंथि ऊतक युक्त बाहर ले और 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर रखने के लिए ।
  2. शीशी साफ एक टिशू पेपर का उपयोग कर पोंछ ।
  3. 1-2 मिनट के लिए एक 30 ° c पानी स्नान में शीशी विसर्जित जब तक ' अपनी सामग्री गल गया है ।
  4. शीशी खोलो और पहले अच्छी तरह से है कि पहले समाधान के 3ml शामिल में cortical पट्टी जगह (०.१ मॉल/l सुक्रोज + 1 मॉल/l DMSO, चरण 4.2.3 में तैयार) ।
    नोट: सभी कदम प्लेट के ढक्कन खोलने को शामिल लामिना प्रवाह के तहत किया जाएगा ।
  5. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन थाली पर 6 अच्छी तरह से थाली मशीन । इस कदम के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर प्लेट रखो ।
  6. स्थानांतरण cortical पट्टी दूसरी अच्छी तरह से युक्त दूसरा समाधान के 3 मिलीलीटर (०.१ मॉल/एल सुक्रोज + ०.५ मॉल/l DMSO, चरण 4.2.3 में तैयार) ।
  7. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के लिए एक घूर्णन थाली पर 6 अच्छी तरह से थाली मशीन । इस कदम के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर प्लेट रखो ।
  8. तीसरी अच्छी तरह से cortical पट्टी हस्तांतरण, समाधान के 4 मिलीलीटर युक्त (०.१ मॉल/L सुक्रोज के साथ बीटीएस, चरण 4.2.2 में तैयार) ।
  9. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के लिए एक घूर्णन प्लेट पर मशीन ।
  10. चौथी अच्छी तरह से समाधान के 4 मिलीलीटर (बीटीएस, चरण 4.2.1 में तैयार) युक्त में cortical पट्टी स्थानांतरण ।
  11. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के लिए एक घूर्णन प्लेट पर मशीन ।
  12. पिछले अच्छी तरह से युक्त 4 शीत मध्यम (2.1.1 चरण में तैयार) में cortical पट्टी स्थानांतरण । ट्रांसप्लांटेशन प्रदर्शन जब तक बर्फ पर गल डिम्बग्रंथि ऊतक रखें ।

6. डिम्बग्रंथि ऊतक के encapsulation

  1. निंन समाधान तैयार करें
    1. ०.९% खारा में 20 mmol/L HEPES बफर के 25 मिलीलीटर तैयार करें । 4 ° c पर फ़िल्टर और स्टोर करें ।
    2. 4 ° c पर 1 मॉल/एल फिल्टर और स्टोर की एकाग्रता पर CaCl2 की 1 मिलीलीटर तैयार करें ।
  2. एक फाइब्रिनोजेन तैयार ५० मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान
    1. जोड़ें फाइब्रिनोजेन के 20 मिलीलीटर में 20 mmol/एल HEPES बफर में से ०.९% खारा धीरे HEPES में फाइब्रिनोजेन मिश्रण से कई घंटे से अधिक ३७ डिग्री सेल्सियस पर खारा बफर ।
    2. लेबल १.७ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों ।
    3. एक ०.४५ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से और फिर एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर.
    4. Aliquot में समाधान २०० µ l में माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब और स्टोर में-20 ° c.
  3. एक Thrombin १०० यू/एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें
    नोट: Thrombin समाधान adsorb ग्लास करने के लिए, aliquot प्लास्टिक ट्यूबों में समाधान/
    1. जोड़ें २.५ मिलीलीटर की ०.९% बाँझ खारा करने के लिए २५० यू ऑफ Thrombin.
    2. कोमल हिला जब तक समाधान पूरी तरह से भंग करने के लिए ।
    3. लेबल १.७ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों ।
    4. एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर, aliquot ५० µ एल में माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों और दुकान पर-८० ° c.
  4. ७० µ एल का एक फाइब्रिन थक्का बनाने, 10 मिलीग्राम की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने/एमएल फाइब्रिनोजेन और 5 यू/एमएल Thrombin
    नोट: तेजी से काम करने के लिए सुनिश्चित करें, कुछ ही सेकंड में समाधान के थक्के. भी, मिश्रण करने के लिए बुलबुले के अलावा से बचें ।
    1. एक १.७ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब में एक फाइब्रिनोजेन समाधान तैयार करें ।
      1. जोड़ें ३६० µ एल के 20 mmol/l HEPES बफर में ०.९% खारा समाधान µ स्टॉक के aliquoted २०० फाइब्रिनोजेन L के लिए, चरण 6.2.4 में तैयार.
      2. कोमल pipetting द्वारा मिश्रण ।
      3. इसे बर्फ पर रखें ।
    2. एक दूसरे माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब में एक Thrombin समाधान तैयार करें ।
      1. Thrombin स्टॉक के aliquoted ५० µ l के लिए DMEM के १४८.७ µ l को जोड़ें, स्टेप 6.3.4 में तैयार करें ।
      2. कोमल pipetting द्वारा मिश्रण ।
      3. जोड़ें १.३ µ एल के 1 मॉल/एल CaCl2।
      4. कोमल pipetting द्वारा मिश्रण ।
      5. इसे बर्फ पर रखें ।
    3. एक एकल सेल निलंबन तैयार, एक तिहाई माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब में ।
      1. एक एंजाइम सेल टुकड़ी मध्यम का उपयोग कर थाली से इंजीनियर endothelial कोशिकाओं अलग ।
      2. नीचे स्पिन और एक कवर ग्लास के साथ एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती ।
      3. डिम्बग्रंथि ऊतक के प्रत्येक 1 मिमी2 प्रति २०,००० कोशिकाओं का उपयोग करें । मिमी2में डिम्बग्रंथि ऊतक के 20, 000x क्षेत्र की गणना ।
      4. इंजीनियर endothelial कोशिकाओं नीचे स्पिन और बुनियादी माध्यम (DMEM) में इसे फिर से निलंबित १६.८ µ एल की कुल मात्रा तक पहुँचने के लिए
      5. इसे बर्फ पर रखें ।
    4. एक बाँझ धुंध स्पंज पर डिंबग्रंथि के ऊतकों का एक टुकड़ा प्लेस यह कुछ सेकंड के लिए शुष्क करने के लिए ।
    5. ५० mm पेट्री डिश के भीतर प्लास्टिक आयल फिल्म के शीर्ष पर डिंबग्रंथि के ऊतकों का टुकड़ा रखें ।
    6. फाइब्रिनोजेन सॉल्यूशन के ३९.२ µ l को जोड़ें, स्टेप 6.4.1.2 में तैयार किया गया, स्टेप 6.4.3.4 में तैयार सेल सस्पेंशन में, कोमल pipetting से मिक्स करें । इसे बर्फ पर रखें ।
    7. चरण 6.4.2.4 में तैयार Thrombin समाधान के 14 µ l को जोड़ें । एक बार pipetting करके धीरे से मिलाएं । तेजी से काम ।
    8. डिम्बग्रंथि ऊतक के शीर्ष पर मिश्रण प्लेस, यह एक लंबी छोटी बूंद के रूप में प्लास्टिक ।
    9. ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में थक्का के साथ पेट्री पकवान प्लेस ।

7. द्विपक्षीय Oophorectomy और एनएसजी चूहों के लिए इंजीनियर Endothelial कोशिकाओं के साथ मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के सह प्रत्यारोपण

नोट: दस से चौदह सप्ताह की आयु वाली महिला एनएसजी चूहों21 (जैक्सन लैब्स) का इस्तेमाल किया गया ।

  1. सभी शल्य चिकित्सा उपकरण तैयार, के रूप में कदम 2.1.3 में सविस्तार, सुनिश्चित करें कि आप सभी टांके, पैड, और शल्य चिकित्सा टेप काम करते हैं ।
  2. Anesthetize माउस Isoflurane के साथ एक संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग कर ।
    1. प्रेरण कक्ष में माउस रखें, ढक्कन बंद करें और उपयुक्त टोंटी खोलें.
    2. खुला flowmeter करने के लिए १,००० मिलीलीटर/vaporizer चालू करें और इसे 2-3.5% वितरित करने के लिए सेट करें ।
    3. संज्ञाहरण के प्रभाव का निरीक्षण; चेतना की हानि, धीमी और नियमित सांस ।
    4. नाक शंकु करने के लिए स्थानांतरण संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए । vaporizer बारी करने के लिए 1-3% उद्धार, महत्वपूर्ण संकेत के आधार पर ।
    5. पेडल या पूंछ पलटा के अभाव की पुष्टि करें । यदि पलटा मौजूद है, isoflurane वृद्धि जब तक यह अनुपस्थित है ।
  3. है माउस वापस ट्रिम कर दीजिए, पूंछ से clavicles लाइन तक, एक बिजली के बाल trimmer का उपयोग कर ।
  4. शल्य चिकित्सा मंच पर एक प्रवण स्थिति में माउस रखें ।
  5. एक शल्य टेप का उपयोग कर सर्जिकल मंच के लिए नाक शंकु ठीक करें ।
  6. एक १.२५ सेमी चौड़ा सर्जिकल कागज टेप का उपयोग कर शल्य मंच को धीरे माउस के अंगों टेप ।
  7. एक बाँझ स्नेहक जेली का प्रयोग करें और एक थर्मामीटर पीआर डालें. एक १.२५ सेमी व्यापक छिद्रित प्लास्टिक सर्जिकल टेप का उपयोग कर सर्जिकल मंच के लिए यह टेप द्वारा थर्मामीटर फिक्स ।
  8. एक २.५ सेमी चौड़ा सर्जिकल पेपर टेप का उपयोग करके पूंछ सर्जिकल मंच के लिए टेप करें ।
  9. गर्मी, एक अवरक्त या एक गर्म पानी हीटिंग पैड का उपयोग कर, और प्रक्रिया भर में माउस के शरीर के तापमान की निगरानी । 35-37 ° c की सीमा के भीतर शरीर का तापमान रखें ।
  10. एक बाँझ Povidone-आयोडीन समाधान झाड़ू छड़ी के साथ छंटनी क्षेत्र को साफ और बाँझ शराब प्रस्तुत करने का उपयोग कर पोंछ ।
  11. दोहराएं चरण ६.९ दो बार अधिक ।
  12. निर्जलीकरण और कॉर्निया को नुकसान से बचाने के लिए माउस की आंखों में से प्रत्येक पर बाँझ नेत्र स्नेही डॉक्टर मरहम की एक बूंद प्लेस ।
  13. एक बाँझ सर्जिकल कपड़े का उपयोग कर माउस को कवर ।
  14. Buprenorphine सुई (1 मिलीग्राम/उप चमड़े के नीचे (एस/
  15. एक अनुदैर्ध्य औसत दर्जे का पृष्ठीय एक स्केलपेल (ब्लेड #21) का उपयोग कर चीरा प्रदर्शन ।
  16. एक द्विपक्षीय oophorectomy प्रदर्शन, एक पृष्ठीय दृष्टिकोण का उपयोग करें ।
    1. कुंद लकीर कैंची का उपयोग करके उप चमड़े के नीचे संयोजी ऊतक नि: शुल्क ।
    2. प्रावरणी बाद में midline एक चीरा बनाने के लिए चुटकी और तेज कैंची का उपयोग कर पेरिटोनियल गुहा तक पहुँचने.
    3. डिम्बग्रंथि वसा पैड और अंडाशय को चिमटी से धीरे से पकड़ लें और उसे उदर गुहा से बाहर निकाल लें ।
    4. अंडाशय और एक संवहनी दबाना के साथ वसा पैड समझ ।
    5. अंडाशय और फैलोपियन ट्यूब के लिए बाहर, अंडाशय के आधार पर एक 4/0 monofilament अवशोषित सीवन का उपयोग कर Ligate और वसा पैड ।
    6. के लिए टाई बाहर अंडाशय क्लिप । सुनिश्चित करें कि स्टंप के आधार से कोई खून बह रहा है ।
    7. ऊतक वापस उदर गुहा में रखें और एक 6/0 लट अवशोषित सीवन का उपयोग प्रावरणी टांका ।
    8. दोहराएँ चरणों 7.15.1-7.15.7 contralateral पक्ष में.
  17. डिम्बग्रंथि ऊतक सह प्रत्यारोपण ।
    1. Gluteus Maximus के ऊपर प्रावरणी में एक क्षैतिज चीरा प्रदर्शन, लंबाई है कि थक्के आयाम फिट बैठता है पर. प्रावरणी के नीचे कैंची खोलकर इस आभासी अंतरिक्ष के भीतर एक जेब बनाएं ।
    2. कदम 6.4.8 में तैयार है और यह इस जेब में जगह के रूप में, encapsulated cortical ऊतक का एक टुकड़ा उठाओ ।
    3. एक 6/0 लट अवशोषित सीवन का उपयोग कर प्रावरणी टांका ।
  18. दोहराएँ चरणों 7.16.1-7.16.3 contralateral ओर के रूप में अच्छी तरह से.
  19. एक 4/0 monofilament अवशोषित टांका के साथ सरल बाधित टांके का उपयोग पृष्ठीय दीवार बंद करें ।
  20. चीरा साइट पर Lidocaine ०.५% (१.२ एमएल/किग्रा) S/
  21. एक बाँझ शराब प्रस्तुत करने के लिए त्वचा को साफ का प्रयोग करें ।
  22. माउस के तापमान की निगरानी करते समय isoflurane को बंद कर दें ।
  23. Isoflurane के बिना, O2का 1-2 min प्रदान करें । माउस वार्मिंग पर रखो जब तक यह कदम और चेतना को वापस शुरू होता है ।
  24. एक साफ वसूली पिंजरे में माउस प्लेस और बाद में शल्य घाव की पूरी चिकित्सा जब तक एक अलग पिंजरे में माउस को घर ।
  25. Buprenorphine सुई (1 मिलीग्राम/किग्रा) के रूप में आवश्यकता के रूप में हर 8-12 एच, 24 के लिए h पश्चात ।
  26. जब सब भोजन, पानी, बिस्तर, और पिंजरों autoclaved रहे हैं, प्रयोग के अंत बिंदु तक चूहों अलग पिंजरों में रखें । एक दबाव हवादार कमरे में पिंजरों रखो । जब भी चूहों को संभाल व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग करें ।

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Representative Results

यह निर्धारित करने के लिए कि ExECs का सह-प्रत्यारोपण मरीजों के ऊतकों को लाभ प्रदान करता है, गल डिम्बग्रंथि cortical स्ट्रिप्स को बराबर आकार के टुकड़ों में बाँटा गया और engrafted में द्विपक्षीय रूप से इंयूनो-समझौता, मंजूरी scid गामा (एनएसजी), चूहों में विभाजित किया गया. एक पक्ष के साथ एक फाइब्रिन थक्का अकेले में एंबेडेड (कोई ईसीएस) और अंय युक्त ExECs (चित्र 1a), प्रत्येक माउस को अपने स्वयं के नियंत्रण के रूप में कार्य किया । ExECs मानव गर्भनाल और Adenoviral जीन टुकड़ा E4-ORF1 के साथ बाद में उपचार से प्राथमिक endothelium के अलगाव के द्वारा प्राप्त किए गए थे, के रूप में पहले वर्णित22,23। 2-5 मार्ग के भीतर, मानव नाल नस ईसीएस (hUVEC) lentiviral कणों के साथ इलाज किया गया है कि सांकेतिक शब्दों में बदलना सीडीएनए adenoviral जीन टुकड़ा एंकोडिंग E4-ORF1 । इस उपचार के अस्तित्व और endothelium की angiogenic क्षमता को बढ़ाता है के रूप में पहले वर्णित22,23। दो सप्ताह के बाद, कार्यात्मक perfused जहाजों GFP से गठन किया गया-मेजबान ऊतक और भ्रष्टाचार (आंकड़ा 1b) के इंटरफेस पर लेबल exECs. आदेश में कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं लेबल करने के लिए, चूहों isoflurane संज्ञाहरण के तहत १०० मिलीलीटर लेक्टिन (०.५ मिलीग्राम/एमएल) के साथ इंजेक्शन थे 10 ऊतक कटाई से पहले मिनट. 2 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण पर कूप के ठहराव ExECs में सापेक्ष कूप गिनती के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रदर्शन-भ्रष्टाचार है कि दो सप्ताह में स्पष्ट रूप से स्पष्ट था सहायता (चित्रा 1c) । Exogenous ईसीएस का गठन जब सह डिम्बग्रंथि ऊतक के साथ प्रत्यारोपण (आंकड़ा 1b) और cortical टुकड़े सह माउस या मानव ExECs के साथ प्रत्यारोपण-भ्रष्टाचार नियंत्रण के सापेक्ष रोम जीवित कूप की संख्या में वृद्धि हुई है (चित्रा 1c ). यह लाभ ExECs में घटी हुई fibrotic क्षेत्र से जुड़ा हुआ था-भ्रष्टाचार की सहायता (चित्रा 1 डी)-प्रत्येक प्रत्यारोपित भ्रष्टाचार से, 3 वर्गों Trichrome, delineating fibrotic ऊतक के एक स्थापित साधन के साथ दाग थे24, का मूल्यांकन करने के लिए fibrotic क्षेत्र: एक मध्य अनुभाग और भ्रष्टाचार के ऊपरी और निचले पक्षों से एक ६०० µm गहराई अनुभाग । सना हुआ वर्गों और स्कैन किया गया ImageJ का उपयोग करने के लिए सतह क्षेत्र और fibrotic क्षेत्र यों तो मैंयुअल रूप से रेखांकित और पूरे भ्रष्टाचार क्षेत्र (ImageJ सॉफ्टवेयर) के एक प्रतिशत के रूप में quantified का प्रयोग विश्लेषण किया गया । अंतिम मूल्यों का विश्लेषण 3 वर्गों के औसत के रूप में प्रत्येक भ्रष्टाचार के लिए गणना की गई । महत्वपूर्ण बात, भ्रष्टाचार कि सह मानव चमड़ी fibroblasts के साथ प्रत्यारोपण किया गया गरीब ऊतक व्यवहार्यता और अपेक्षाकृत कुछ कूप दिखाया । (चित्रा 1e).

हम अगले डिम्बग्रंथि ऊतक भ्रष्टाचार के साथ और बिना ExECs के दीर्घकालिक समारोह का मूल्यांकन (चित्रा 2a, डी, एफ, एच). 14 सप्ताह के बाद, चूहों समय के चर लंबाई के लिए menotropins के साथ दैनिक उत्तेजित थे से पहले पशुओं, कूप विकास एमआरआई के माध्यम से दो चूहों में निगरानी की प्रगति के साथ बलिदान दिया गया था (चित्र बीसी) । विकासशील रोम दोनों नियंत्रण (चित्रा 2e) और ExECs-मदद की भ्रष्टाचार (चित्रा 2 जी, मैं) में नोट किया गया । अधिक और बड़े आकार के रोम ExECs में देखा गया-भ्रष्टाचार की सहायता (चित्रा 2g, मैं) । कोटरीय एक ही रोगी के ऊतकों से व्युत्पंन कूप की तुलना में, menotropins और सह ExECs के साथ प्रत्यारोपण के साथ उत्तेजित, और अधिक उंनत कूप में granulosa सेल परत ovulatory मार्करों की अभिव्यक्ति में वृद्धि प्रदर्शित CD4425 और HABP126, और साथ ही वृद्धि हुई कोशिका-मृत्यु (Caspase), और कम प्रसार (Ki67) (चित्रा 2j) ।

कई अध्ययनों से पता चला है कि कूप के पूल समय से पहले डिम्बग्रंथि ऊतक के भ्रष्टाचार के बाद सक्रिय है27,28,29,30. हम 2, 3 और 14 सप्ताह (चित्र 3ए) में एक ही मरीज से कई भ्रष्टाचारियों में एक समान प्रवृत्ति मनाया । को भुनाने में AMH के माना समारोह पर कैपिटल के लिए सक्रियण और/या कूप17,31के विकास, हम lentivirus के साथ constitutively एक्सप्रेस के लिए इंजीनियर ExECs और इस तरह के एक प्रत्यक्ष paracrine स्रोत प्रदान करने के लिए गुप्त AMH प्रत्यारोपण डिम्बग्रंथि ऊतक (चित्र बी) । Lentiviral transduction वृद्धि हुई १००-ExEC जो अंयथा AMH की undetectable मात्रा व्यक्त में GC से ऊपर गुना । Granulosa कोशिकाओं ट्यूमर कोशिकाओं, दूसरी ओर, सेल संस्कृति supernatant में AMH का एक बेसल स्तर स्रावित । (चित्र 3 c) । दो सप्ताह के सह-प्रत्यारोपण के बाद, ExECs से व्युत्पंन जहाजों की मेजबानी में मनाया गया-भ्रष्टाचार अंतरफलक और immunostaining से व्युत्पंन वाहिकाओं के लुमेन में प्रचुर मात्रा में AMH प्रोटीन का पता चला AMH-ExECs (चित्रा 3d) से गठित जहाजों के सापेक्ष नियंत्रण ExECs. आदेश में ExECs के समर्थक angiogenic प्रभाव से स्वतंत्र रूप से AMH के समारोह का परीक्षण करने के लिए, हम mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (MSC) है कि डिम्बग्रंथि मज्जा के टुकड़े से अलग किया गया था । इन कोशिकाओं को lentiviral AMH एंकोडिंग और सह प्रत्यारोपण में उपयोग के लिए संस्कृति में विस्तार के साथ transduced थे । AMH-ExECs के साथ सह-प्रत्यारोपण पर, मौलिक कूप के अनुपात में 2 गुना वृद्धि देखी गई । हालांकि, यह प्राथमिक कूप के प्रतिशत में कमी की ओर जाता है । AMH-MSCs का नेतृत्व करने के लिए मौलिक रोम के बढ़ते प्रतिधारण 10 से नियंत्रण MSCs के सापेक्ष गुना (चित्रा 3f, एच) । quiescent तोंसिल्लितिस पूल की अवधारण के लिए सबसे महत्वपूर्ण लाभ AMH-ईसीएस द्वारा संमानित किया गया था जब एक तुलना MSCs, ExECs, गैर सेलुलर भ्रष्टाचारियों (Ctl), AMH-MSCs ExEC और AMH-ExECs (चित्रा 3i) के बीच किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: डिम्बग्रंथि cortical स्ट्रिप्स के साथ सह प्रत्यारोपण ExECs व्यवहार्यता को बेहतर बनाता है और तोंसिल्लितिस पूल को बरकरार रखता है । (क) प्रायोगिक डिजाइन की योजना । जमे हुए-गल मानव डिम्बग्रंथि ऊतक एक फाइब्रिन थक्का, के साथ या ExECs के बिना में समझाया गया था । थक्के oophorectomized एनएसजी चूहों में प्रत्यारोपण किया गया और प्रयोग के अंत बिंदु पर काटा । (ख) मानव cortical भ्रष्टाचार hUVEC-व्युत्पन्न ExECs (हरा) के साथ सह-प्रत्यारोपित; लाल रक्त कोशिकाओं को तेर द्वारा लेबल-११९ और भ्रष्टाचार की सीमाओं सफेद में उल्लिखित हैं । (ग) के साथ और बिना माउस या मानव exECs + पागल प्रत्यारोपण से कुल कूप का औसत प्रतिशत । * P < 0.05. (घ) के साथ और बिना माउस या मानव ExECs + पागल ट्रांसप्लांटेशन से fibrotic क्षेत्र का औसत प्रतिशत । * * P < 0.001 । (ङ) डिम्बग्रंथि भ्रष्टाचारियों के प्रतिनिधि वर्गों, कोशिकाओं के बिना, और मानव चमड़ी fibroblasts के साथ ExECs के साथ सह प्रत्यारोपित । यह आंकड़ा मैन एट अल से संशोधित किया गया है । विज्ञान प्रतिनिधि २०१७ अगस्त 15; 7 (1): 8203 । दोी: 10.1038/s41598-017 -08491-z. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: दीर्घकालिक व्यवहार्यता और डिम्बग्रंथि ऊतक भ्रष्टाचार के समारोह exECs द्वारा सुधार कर रहे हैं । आंकड़ों में बी, सी, डी, एफ, और एच छोड़ दिया पर भ्रष्टाचार नियंत्रण कर रहे है-नहीं ईसीएस, जबकि दाईं ओर भ्रष्टाचारियों सह ExECs के साथ प्रत्यारोपित । (क) डिम्बग्रंथि cortical ऊतक के दीर्घकालिक xenograft के लिए प्रयोगात्मक योजना. (b) आंकड़ों में b और c, तारांकन (दाईं ओर), ईसीएस के साथ सह-प्रत्यारोपण डिम्बग्रंथि ऊतक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि arrowhead (बाईं ओर) डिम्बग्रंथि ऊतक का प्रतिनिधित्व करता है कोई कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित. माउस #1 एक 6 वर्षीय दाता से ऊतक के साथ xenografted था और उत्तेजना की शुरुआत (14 सप्ताह, बाएं) और फिर उत्तेजना के दस दिनों के बाद (१५.५ सप्ताह, सही) पर एमआरआई से नजर रखी । (ग) माउस #3 एक 19 वर्षीय दाता से ऊतक के साथ xenografted था और 6 पर एमआरआई द्वारा निगरानी (20 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण), 7 (21 डब्ल्यू), और 8 (22 डब्ल्यू) उत्तेजना की शुरुआत के बाद सप्ताह । (घ) engrafted मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के Macroscopic छवि १५.५ सप्ताह माउस #1 में काटा, सही पक्ष पर भ्रष्टाचार ExEC सहायता भ्रष्टाचार और नियंत्रण भ्रष्टाचार के एक ऊतकवैज्ञानिक दृश्य है (ई) में दिखाया गया है । (च) भ्रष्टाचारियों की Macroscopic छवि, माउस #2 के बाद बलिदान दिया गया था 20 सप्ताह और नियंत्रण और exEC-सहायता भ्रष्टाचार ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए काटा गया; ExEC-सहायता वाले भ्रष्टाचार में (g) दिखाया गया है. (ज) माउस में भ्रष्टाचारियों की Macroscopic छवि #3 जो 22 हफ्तों के बाद बलिदान दिया था, ExEC-सहायता भ्रष्टाचार के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण में दिखाया गया है (मैं) । (जंमू) ExEC-माउस #2 और माउस से भ्रष्टाचार की सहायता के वर्गों #3 आणविक मार्करों के लिए दाग रहे थे और जुड़े बॉक्स में बढ़े हैं । स्केल बार्स = १०० µm । यह आंकड़ा मैन एट अल से संशोधित किया गया है । विज्ञान प्रतिनिधि २०१७ अगस्त 15; 7 (1): 8203 । दोी: 10.1038/s41598-017 -08491-z. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ExECs एक्सप्रेस AMH एक quiescent तोंसिल्लितिस पूल संरक्षित करने के लिए इंजीनियर । (क) कूप का अनुपात एक ही रोगी है कि लंबे और अल्पकालिक अंतराल के लिए ईसीएस के साथ सह-प्रत्यारोपण किया गया से कई डिंबग्रंथि ऊतक टुकड़े के लिए quantified था; n = 2 सप्ताह में 3, n = 4 सप्ताह में 3 और n = 2 पर 14 सप्ताह । (ख) प्रायोगिक डिजाइन की योजना. फ्रोजन-गल मानव डिम्बग्रंथि ऊतक एक फाइब्रिन थक्का में समझाया गया था, एक आरएफपी lentiviral कण के साथ या तो ExECs/MSCs transduced के साथ एक नियंत्रण के रूप में सेवारत, या ExECs एक MSCs transduced AMH कण पैदा mCherry-ईसीएस/lentiviral के साथ AMH/ oophorectomized एनएसजी चूहों में थक्के का प्रत्यारोपण किया गया और 2 सप्ताह में काटा गया । (ग) ExECs के साथ transduced थे lentivirus एंकोडिंग स्रावित मानव AMH; सेल कल्चर supernatant ऑफ AMH-transduced exECs की तुलना COV-४३४ कल्चर granulosa सेल ट्यूमर लाइन और कंट्रोल exECs से की गई । (घ) दो सप्ताह के प्रत्यारोपण के बाद, डिम्बग्रंथि ऊतक टुकड़े कि या तो ईसीएस (बाएँ) या AMH-ExECs (दाएँ) के साथ सह-प्रत्यारोपण किया गया एक AMH प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग थे. (ङ) xenografts में रोम के सापेक्ष अनुपात-नियंत्रण और AMH-ExECs के साथ प्रत्यारोपित 2 सप्ताह (n = 6) के बाद quantified था । (च) xenografts में रोम के सापेक्ष अनुपात नियंत्रण और AMH-MSCs के साथ प्रत्यारोपित 2 सप्ताह (n = 6) के बाद quantified था । (g) माध्य + कूप के सापेक्ष अनुपात के पागल नियंत्रण और AMH-transduced ExECs (n = 6) निंनलिखित 2 सप्ताह के साथ प्रत्यारोपित xenografts में तुलना में था । (h) माध्य + कूप के सापेक्ष अनुपात xenografts की तुलना में नियंत्रण और AMH-transduced MSCs (n = 6) के साथ प्रत्यारोपण किया गया था 2 सप्ताह के बाद । (i) MSCs (n = 6) के साथ प्रत्यारोपित xenografts में भ्रष्टाचार के प्रति मनाया मौलिक कूप का औसत प्रतिशत, ExECs (n = 6), AMH-MSCs (n = 6), और AMH-ExECs (n = 6) की शर्तों को नियंत्रित करने के लिए समग्र में तुलना की गई (कोई कक्ष, n = 15) । (घ) में presets AMH-ExECs के लिए सही करने के लिए बक्से में बढ़े हुए है और Ctl ExECs के लिए ऐसा न हो; (d) में लाल और नीले स्ट्रोक लाइनें क्रमशः डिम्बग्रंथि ऊतक और मेजबान ऊतक की रूपरेखा । (c) में त्रुटि पट्टियां 3 प्रतिकृति के बीच मानक विचलन दर्शाते हैं । में त्रुटि पट्टियां (a, g-i) सूचीबद्ध या ग्राफ़ में दिखाए गए प्रतिकृति की संख्या के बीच पागल का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार = १०० µm (d) । * p < 0.05, * * p < 0.005 । यह आंकड़ा मैन एट अल से संशोधित किया गया है । विज्ञान प्रतिनिधि २०१७ अगस्त 15; 7 (1): 8203 । दोी: 10.1038/s41598-017 -08491-z. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समाधान μL में सुक्रोज-बीटीएस (step 4.2.2 में तैयार) μL में DMSO
1 मॉल के साथ सुक्रोज-बीटीएस/L DMSO २७८७ २१३
०.५ मॉल के साथ सुक्रोज-बीटीएस/L DMSO २८९४ १०६

तालिका 1: सुक्रोज समाधान तैयारी ।

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Discussion

यहाँ हम exECs के सह-प्रत्यारोपण डिम्बग्रंथि ऊतक व्यवहार्यता और चूहों में xenograft निम्नलिखित समारोह के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है कि प्रदर्शन. डिंबग्रंथि ऊतक के नैदानिक आवेदन के लिए मानक फर्टिलिटी संरक्षण के लिए ऑटो प्रत्यारोपण सेट नहीं किया गया है और इष्टतम मापदंडों (आकार, ट्रांसप्लांटेशन साइट, भ्रष्टाचार की अवधि, आदि) ३२ , ३३ , ३४ तोंसिल्लितिस पूल की बढ़ी हुई वसूली के लिए अपरिभाषित रहते हैं । जब ऑटो प्रत्यारोपण किया जाता है, avascular गल cortical डिम्बग्रंथि ऊतक के भ्रष्टाचार के शेष अंडाशय, डिम्बग्रंथि खात, या व्यापक बंधन३५,३६जैसे श्रोणि साइटों में मुख्य रूप से किया जाता है । के बाद से कोई अंत करने वाली अंत सम्मिलन जगह लेता है, इस प्रत्यारोपण विधि कोरोनरी ऊतक हानि और भ्रष्टाचार के भीतर रहने वाले कूप के समय से पहले सक्रियण की एक लहर में परिणाम है । इसलिए, जबकि exECs के साथ सह प्रत्यारोपण नैदानिक आवेदन के लिए विचार किया जा रहा से पहले बहुत आगे जांच की आवश्यकता होती है कि प्रफलन endothelial कोशिकाओं के वितरण पर जोर देता, इस दृष्टिकोण ऊतक revascularization को तेज कर सकते हैं और एक उबार सकता है डिम्बग्रंथि भ्रष्टाचार के भीतर कूप का मजबूत अनुपात ।

इन निष्कर्षों आगे एक उपंयास संवहनी सेल डिम्बग्रंथि ऊतक व्यवहार्यता के अनुकूलन और प्रत्यारोपण के बाद समारोह के लिए आधारित रणनीति डाल दिया । cryopreserve डिम्बग्रंथि ऊतक और डिम्बग्रंथि ऊतक प्रत्यारोपण के लिए हाल ही में कॉल करने के लिए प्रयोगात्मक स्थिति से स्थानांतरित करने के लिए नैदानिक आवेदन३७,३८खोलने के लिए चयन रोगियों के बढ़ते पूल को देखते हुए, इस विधि एक चिकित्सीय पेशकश कर सकते हैं रणनीति है कि भ्रष्टाचारियों की अधिक से अधिक व्यवहार्यता सक्षम बनाता है, जिससे डिंबग्रंथि cortical स्ट्रिप्स कि प्रत्यारोपण किया जाना चाहिए की संख्या को कम करने और उनकी दीर्घायु और/

समय से पहले भर्ती, या "burnout", भी कीमोथेरेपी३९के दौरान तोंसिल्लितिस पूल की कमी से जोड़ा गया है, साथ ही डिम्बग्रंथि ऊतक३४के बाद ऑटो प्रत्यारोपण । कई अध्ययनों से संकेतन रास्ते की पहचान की है कि कार्य के लिए फुफ्फुसीय जुड़ाव को दबा के सक्रिय है, और इस विनियामक समारोह के विघटन एक महत्वपूर्ण कोरोनरी खिड़की के दौरान तोंसिल्लितिस पूल के एक बड़े पैमाने पर सक्रियण में परिणाम कर सकते है जब नवजात कूप के चयापचय की जरूरत को पूरा नहीं किया जा पा रहे हैं । इस संदर्भ में exECs के आवेदन न केवल reperfusion में तेजी लाने के लिए, लेकिन उनकी engraftment क्षमता के कारण, exECs भी कारकों है कि प्रत्यक्ष तोंसिल्लितिस संघटन की एक सीधी paracrine आपूर्ति प्रदान करने के लिए इंजीनियर जा सकता है । तोंसिल्लितिस के विकास का एक मॉडुलन के रूप में AMH के उपयोग की धारणा के रूप में अच्छी तरह से अन्य समूहों द्वारा लागू किया गया है । कानो एट अल. या तो आसमाटिक रिकॉमबिनेंट प्रोटीन या वायरल कणों के आईपी इंजेक्शन से युक्त पंपों के माध्यम से AMH दिया४०। इन दृष्टिकोण मौलिक कूप की अवधारण में एक समान प्रवृत्ति के परिणामस्वरूप, लेकिन प्रसव प्रणालीगत था । एक विकल्प के रूप में, exECs स्रावित AMH AMH के एक स्थानीय और निरंतर स्रोत प्रदान करते हैं, तथापि, डिम्बग्रंथि ऊतक भ्रष्टाचार में इंजीनियर संवहनी कोशिकाओं का शामिल असंख्य सेल आधारित चिकित्सा के साथ जुड़े जोखिम द्वारा सीमित है. exECs पर विदेशी एंटीजन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया संभव है और प्रफलन कोशिकाओं का उपयोग कोशिकाओं परिसंचारी, प्रत्यारोप और शरीर में कहीं नवोत्पादित विकास को बढ़ावा देने की संभावना उठाती है । हालांकि इन सीमाओं बाधा वर्तमान रोगियों के लिए इस दृष्टिकोण के अनुवाद ऑटो प्रत्यारोपण के दौर से गुजर, इन प्रयोगों समर्थक angiogenic प्रभाव और समयपूर्व तोंसिल्लितिस जुड़ाव के दमन के लिए क्षमता बढ़ाने के लिए हस्तगत डिम्बग्रंथि ऊतक भ्रष्टाचार के उत्पादन और मानव डिंबग्रंथि शरीर विज्ञान के यंत्रवत अध्ययन के लिए एक मजबूत xenograft मॉडल की स्थापना ।

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Disclosures

माइकल गिंसबर्ग Angiocrine विज्ञान के एक कर्मचारी है, Inc, सैन डिएगो, CA, ९२१३०, संयुक्त राज्य अमेरिका, कि पृथक, E4 के साथ transfected-ओआरएफ-1 और endothelial कोशिकाओं को हम इस्तेमाल किया लेबल ।

Acknowledgments

उदाहरण के लिए उमर अलेक्जेंडर मैन ।
लक्ष्मीमल्ल कॉर्नेल नैदानिक और शोधों विज्ञान केंद्र और एक ASRM अनुसंधान अनुदान से एक पायलट पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था.
लेखक को पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जेंस लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

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References

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समस्या १३५ प्रजनन संरक्षण डिम्बग्रंथि ऊतक cryopreservation डिंबग्रंथि ऑटो प्रत्यारोपण सह प्रत्यारोपण Exogenous endothelial कोशिकाओं (exECs) Revascularization समयपूर्व तोंसिल्लितिस संघटन विरोधी Mullerian हार्मोन (AMH)
इंजीनियर Endothelial कोशिकाओं के साथ मानव डिम्बग्रंथि ऊतक के सह प्रत्यारोपण: प्रत्यक्ष Paracrine वितरण के साथ त्वरित छिड़काव के संयोजन एक सेल आधारित रणनीति
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Man, L., Park, L., Bodine, R.,… More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

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