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Bioengineering

공동 설계 된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식: 세포 기반 전략 결합 가속 직접 Paracrine 배달 관류

doi: 10.3791/57472 Published: May 16, 2018

Summary

일부 환자에 대 한 다 산 보존에 대 한 유일한 옵션은 난소 직물의 cryopreservation. 불행히도, 지연된 revascularization follicular 생존을 위태롭게합니다. 여기, 우리는 공동 bioactive 분자의 직접 paracrine 배달 가속 결합 세포 기반 전략으로 활용 관류에 대 한 내 피 세포와 인간 난소 조직을 이식 하는 프로토콜을 제시.

Abstract

불 임은 화학요법 또는 방사선 치료와 일부 환자에 대 한 빈번한 부작용, oocytes 또는 배아의 cryopreservation는 옵션이 아니다. 대신,이 환자의 증가 cryopreserve autograft 위한 난소 조직을 선택 하는 복구 및 면제. 개선 결과 자동-cryopreserved 난소 조직 이식 받은 환자 중에 불구 하 고 효율적인 revascularization 이식할 조직의 주요 장애물 남아 있습니다. 허 혈을 완화 하 고 따라서 자동 이식 환자에 있는 결과 개선, 우리 난소 조직 관류 가속을 위한 혈관 세포 기반 전략 개발. 마우스가 종이 식 모델에서 cryopreserved 난소 조직으로 외 인 내 피 세포 (경영진)의 공동 이식 하는 방법을 설명합니다. 우리는 지속적인된 paracrine 난소 이식에 대 한 입력 신호를 활성화 constitutively 안티 Mullerian 호르몬 (AMH)를 표현 하기 위해 설계 되었습니다 경영진을이 이렇게 확장. 그리고 임원으로 공동 이식 증가 follicular 볼륨과 향상 된 antral 여 포 개발, AMH 표현 임원 승진 무부하 원시 낭의 보존. 이 결합 된 전략 허 혈을 완화 및 다 산 보존 불 임 대형의 컨텍스트에서 follicular 활성화 변조에 대 한 유용한 도구 있을 수 있습니다.

Introduction

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개발된 된 세계에서 죽음의 주요 원인 가운데 암 남아 아직 수 십년 연구의 중요 한 진행 암, 그리고 일부의 경우 거의 두 배로 생존 율1에 대부분의 종류에 대 한 굴복 했다. 불행히도, 종종 화학요법 에이전트는 gonadotoxic, 원시 낭 난소에서의 파괴 및 불 임2감소. 그러나이 인구 증가 다 산 보존 oocyte 또는 배아 cryopreservation 등의 다양 한 방법에서 혜택을 받을 수,, 암 치료와 사전 pubertal 환자의 신속한 개시를 요구 하는 환자는 이러한 옵션에 적격이 지 않다. 대신, 일부 환자는 전과 그들의 치료 처방 사업 복구 및 면제, 자동 이식 조직 다 산3복원 시 난소 조직 cryopreserve 선택 했습니다. 그러나, 날짜, 이식 생존 및 follicular 출력 자동 이식 다음에 상대적으로 낮은4, 조직 허 혈과 저 산소 증5,,67때문에 주로 남아 있습니다. 난소의 피 질 이식의 생존 능력을 개선 하기 위해 수많은 노력에도 불구 하 고 안티 oxidants8,9, 프로-신생 cytokines10,,1112,1 사용 하 여 3또는 기계적인 조작14이식 허 혈 5-7 일 창 포스트 이식 가능성 및 이식7의 생존 저해. 이 해결 하기 위해 우리는 호스트와 이식 혈관의 문 합을 촉진 하기 위하여 따라서 난소 조직의 reperfusion 서두르는 셀 기반 전략을 개발 했다.

포스트 이식 창에서 이식할된 난소 조직에 허 혈 성 모욕 뿐만 아니라 간 follicular 신호 중단 풀15,16의 고갈에 기여할 수 있습니다. 외 인 내 피 세포 (임원)는 이식의 주변에 있는 혈관을 안정적이 고 기능에 기여, 때문에 그들은 이식된 조직에 정의 된 분자 입력을 전달 하는 독특한 기회를 제시. 원리의 증거로, 경영진 안티 Mullerian 호르몬 (AMH), 소 낭 모양 성장17제한 표시 되었습니다 변형 성장 인자 베타 (TGFβ) superfamily의 구성원의 익스프레스 슈퍼 생리 적 수준으로 설계 했다. 공동 제어와 AMH 표현 세포 이식 이식 follicular 분포의 비교는 생물 학적 활동 엔지니어링된 경영진의 힘을 확인 합니다.

요약 하자면, 이식 가능성 및 억제 조 동원 follicular 풀을 개선 하 여이 이렇게 자동 이식 환자 다 산 보존 난소 조직의 생산성을 증가할 수 있다. 또한, ExEC 기반 플랫폼 follicular 개발에 연루 되어 분자 레 귤 레이 터의 실험 심문 수 있습니다.

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Protocol

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동물 주제와 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) Weill 코넬 의학 대학에 의해 승인 되었습니다. 난소 조직을 사용 하 여 모든 xenotransplantation 실험 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 인간의 난소 조직 화학 요법 이나 방사선 암 치료 또는 이전 골 수 이식 치료 예정 환자에서 수집 되었다. 기관 심사 위원회 (IRB) 위원회의 Weill 코넬 의학 대학 조직의 잠재적인 헌 용, 그리고 환자의 동의 연구 사용에 대 한 그들의 난소 조직의 최대 10%의 기부를 수행한 컬렉션 승인.

1입니다. 인간 난소 조직의 수집

참고: 때 난소 조직을 원격 시설 교통에서 수송 된다, 시간 5 h18,19을 초과 하지 말아야 합니다.

  1. 난소 조직 수집 하 고는 멸 균 생리 식 염 수로 헹 구 십시오.
  2. 멸 균 용기에 난소를 놓습니다.
  3. 난소는 완전히 매체에 잠기 다 때까지 Leibovitz의 L-15 매체를 붓는 다.
  4. 닫고 컨테이너를 밀봉 합니다.
  5. 얼음에 컨테이너를 수송.

2. 슈미트 외. 에서 적응 조달된 난소 조직 처리 18

  1. 난소 처리 및 동결에 대 한 준비
    1. 100 mL 매체의 처리를 위한 준비: Leibovitz의 L-15 중간 99 + 1 mL 항생제 antimycotic 솔루션. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 미디어를 필터링 합니다. 냉장 하는 매체를 유지.
    2. 100 mL cryo 막는으로 DMSO를 사용 하 여 냉동 솔루션의 준비. 추가 69.64 mL Leibovitz L-15 중간, 17.66 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 3.42 g (0.1 mol/L의 최종 농도 만들려고) 자당의 10.65 mL (1.5 mol/L의 최종 농도 만들려고) DMSO, 1 mL 항생제 antimycotic 솔루션. 150 mL 필터 유닛, 0.2 µ m. 4 ° c.에 중간 저장소를 사용 하 여 매체를 필터링
    3. 래핑된 고체 살 균 주기 위해 프로그램 압력솥을 사용 하 여 수술 도구를 소독.
  2. 조직의 도착 시
    1. 무 균 수술 도구는 biosafety 내각 설정: 날카로운 곡선 잘 블레이드 번호 21, 메스가 위와 집게에 다양 한 크기: 긴 (약 150 m m 길이)와 중간 크기의 2 (약 110 m m 길이).
    2. 멸 균 장갑을 착용, biosafety 내각 내에서 컨테이너를 엽니다. 난소를가지고 하 고 150 mm 페 트리 접시에 부 어 냉 매체 난소 조직의 탈수를 방지 하기 위해 난소 위에 2.1.1 단계에서 준비.
    3. 어떤 잔여 조직에서 난소를 분리 하 고 조직 및 혈액 없다 때까지 차가운 매체와 그것을 씻어.
    4. 깨끗 한 150 mm 페 트리 접시에에서 난소, 차가운 추가 중간, 2.1.1 난소는 절반 그것에 빠져들 때까지 단계에서 준비.
  3. 난소 조직의 해 부
    1. 난소를 이등분 하 고 곡선된 좋은 위를 사용 하 여 예리한 해 부에 의해 모 수를 먼저 제거 하는 방법. 다음에 블레이드 번호 21 살 균 메스를 사용 하 여, 모 다쳤어요. 대뇌 피 질의 조직 될 때까지 1-1.5 m m 두께에 앞.
    2. 대뇌 피 질의 조직 폭에서 2-3 mm의 조각으로 잘라, 스트립의 길이 처리 된 난소 작품의 전체 길이 될 것입니다.

3. 난소 조직 느린 동결, 뉴턴 에서 적응. 그리고 아나 외. 6 , 20

  1. 동결에 대 한 준비
    1. 라벨 cryovials (1.8 mL).
    2. 2.1.2 각 유리병에 단계에서 준비 냉동 솔루션의 1.5 mL를 추가 합니다.
    3. 극저온 유리병 동결 솔루션이 포함 된 당 한 대뇌 피 질의 스트립 전송.
    4. Equilibrate 회전 접시에 20 분에 대 한 대뇌 피 질의 스트립, 부드러운 동요 4 ° c.에 적용
  2. 천천히 난소 조직 동결
    1. 0 ° c.에 시작 하는 프로그래밍 가능한 평면 냉장고에는 cryovials를 로드
    2. 2 ° C/min-7 ° c에 냉각
    3. 10 분이 일정 한 온도에서 조직 유지.
    4. 액체 질소 (선2)에 목화 팁 각 cryovial으로 얼음 크리스탈 nucleation 유도, 수동 시드를 수행 합니다.
    5. 0.3 ° C/min에 시료의 온도-40 ° c.에 도달할 때까지 계속
    6. -140 ° c에 10 ° C/min의 빠른 속도로 냉각
    7. LN2에 저장 dewar cryovials 전송 (-196 ° C).

4. 수술 (양측 Oophorectomy와 공동 이식)에 대 한 준비

  1. 접시의 준비
    1. 이식에 대 한 난소 조직을 녹고 전날
      1. 50 mm 페 트리 접시의 하단에 플라스틱 파라핀 필름 조각을 넣으십시오, 스프레이 그것을 70% 에탄올까지 완전히 덮여 있을 것입니다.
      2. 페 트리 접시 하룻밤에 떠나지는 biosafety 캐비닛. 마우스 당 2 접시를 준비 합니다.
    2. 수술 날에
      1. Biosafety 내각 내에서 플라스틱 파라핀 영화를 포함 하는 배양 접시에서 에탄올 발음
      2. 에탄올을 완전히 증발 될 때까지 페 트리 접시 리드를 반 열어 둡니다.
      3. 플라스틱 파라핀 영화는 완전히 건조 될 때 페 트리 접시의 뚜껑을 닫습니다. 유지는 biosafety 내 캐비닛.
      4. 0.1 mol/L 자당 + 1 mol/L DMSO, 0.1 mol/L 자당 + 0.5 mol/L DMSO, 0.1 mol/L 자당, 기본적인 녹고 솔루션 (BTS), 매체는 6의 레이블 우물 잘 따라, 플레이트.
  2. 솔루션의 준비
    1. BTS의 100 mL를 준비: Leibovitz의 L-15 중간 79 mL + FBS 20 mL + 항생제 Antimycotic 솔루션 1 mL. 0.22 μ m 필터 시스템으로 필터링 합니다.
    2. 0.1 mol/l 자당 BTS의 10 mL를 준비 합니다. 자당의 0.342 g 확장 하 고 준비 단계 4.2.1, 동요는 자당 완전히 해산 될 때까지 부드럽게에서 BTS의 10 mL를 추가 합니다. 필터 주사기를 사용 하 여 솔루션 0.22 μ m 필터.
    3. 표 1에 따라 솔루션을 준비 합니다. 커버 알루미늄 호 일로 DMSO를 포함 하는 관. 사용할 때까지 냉장 하십시오.

5. 난소 조직을 급속 한 해빙

  1. LN2 를 꺼내 dewar 난소 조직 동결을 포함 하는 유리병 30 실 온에서 보관 하 고 s.
  2. 티슈 페이퍼를 사용 하 여 깨끗 한 유리병을 닦아냅니다.
  3. 1-2 분까지 30 ° C 물 욕조에 유리병을 담가 그것의 ' 콘텐츠 해 동.
  4. 유리병을 열고 첫 번째 솔루션 (0.1 mol/L 자당 + 1 mol/L DMSO, 단계 4.2.3에서에서 준비) 3 ml를 포함 하는 첫 번째 잘에서 대뇌 피 질의 스트립을 놓습니다.
    참고: 모든 단계는 접시의 뚜껑을 열고 관련 된 층 류에서 수행 됩니다.
  5. 알루미늄 호 일이 단계에 대 일 분 접시 덮여 유지 4 ° C에서 회전 접시에 6 잘 플레이트를 품 어.
  6. 두 번째 솔루션 (0.1 mol/L 자당 + 0.5 mol/L DMSO, 단계 4.2.3에서에서 준비)의 두 번째 잘 포함 3 mL에 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다.
  7. 알루미늄 호 일이 단계에 대 일 분 접시 덮여 유지 위한 4 ° C에서 부드러운 동요에 대 한 회전 접시에 6 잘 플레이트를 품 어.
  8. 솔루션 (0.1 mol/L 자당, 4.2.2 단계에서 준비와 BTS)의 4 mL를 포함 하는 세 번째 잘으로 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다.
  9. 5 분 동안 4 ° C에서 부드러운 동요에 대 한 회전 접시에 품 어.
  10. 솔루션 (BTS, 단계 4.2.1에서에서 준비)의 네 번째 잘 포함 4 mL에 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다.
  11. 5 분 동안 4 ° C에서 부드러운 동요에 대 한 회전 접시에 품 어.
  12. (2.1.1 단계에서 준비) 차가운 매체의 마지막 잘 포함 4 mL에 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다. 얼음 해 동된 난소 조직을 이식 수행까지 유지.

6입니다. 난소 조직의 캡슐화

  1. 다음 솔루션을 준비
    1. 25 mL의 0.9% 식 염 수에 20 mmol/L HEPES 버퍼를 준비 합니다. 필터와 4 ° c.에 게
    2. CaCl2 농도 1 mol/l. 필터의 1 mL를 준비 하 고 4 ° c.에 저장
  2. Fibrinogen 50 mg/mL 재고 솔루션을 준비
    1. 천천히 fibrinogen는 HEPES에 혼합 하 여 0.9% 식 염 수에 20 mmol/L HEPES 버퍼의 20 mL으로 Fibrinogen의 1 g 37 ° c.에 몇 시간 동안 염 분 버퍼 추가
    2. 1.7 mL 마이크로 원심 튜브 라벨.
    3. 0.45 μ m 주사기 필터를 통해 그리고 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
    4. 약 수 마이크로 원심 튜브와-20 ° c.에 게 200 µ L로 솔루션
  3. 트 롬 빈 100 U/mL 재고 솔루션을 준비
    참고: 트 롬 빈 솔루션 adsorb 유리, aliquot 플라스틱 튜브/튜브에 솔루션.
    1. 트 롬 빈의 U 250에 0.9% 멸 균 식 염 수의 2.5 mL를 추가 합니다.
    2. 솔루션 완전히 녹을 때까지 부드럽게 흔들어입니다.
    3. 1.7 mL 마이크로 원심 튜브 라벨.
    4. 마이크로 원심 튜브 및 저장소-80 ° c.에 aliquot 50 µ L 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 필터링
  4. 70 µ L, 10 mg/mL fibrinogen 및 5 U/mL 트 롬 빈의 최종 농도 얻기의 섬유 소 혈전을 만들기
    참고: 빨리, 몇 초에 솔루션 병 일 있는지 확인 합니다. 또한, 혼합물에 거품의 추가 하지 마십시오.
    1. 1.7 mL 마이크로 원심 튜브에서 Fibrinogen 솔루션을 준비 합니다.
      1. 360 추가 20 mmol/L의 µ L HEPES Fibrinogen 주식의 aliquoted 200 µ L 0.9% 염 분 해결책에서 버퍼링 단계 6.2.4에서에서 준비.
      2. 부드러운 pipetting으로 혼합.
      3. 얼음에 그것을 유지.
    2. 두 번째 마이크로 원심 튜브에서 트 롬 빈 솔루션을 준비 합니다.
      1. DMEM의 148.7 µ L, 트 롬 빈의 aliquoted 50 µ L을 추가 단계 6.3.4에서에서 준비.
      2. 부드러운 pipetting으로 혼합.
      3. 1 mol/L CaCl2의 1.3 µ L를 추가 합니다.
      4. 부드러운 pipetting으로 혼합.
      5. 얼음에 그것을 유지.
    3. 3 마이크로 원심 튜브에서 단일 셀 정지를 준비 합니다.
      1. 격판덮개는 효소 세포 분리 매체를 사용 하 여에서 설계 된 내 피 세포를 분리 합니다.
      2. 스핀 다운는 커버 유리를 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 카운트.
      3. 난소 조직 마다 1 m m2 당 20000 셀을 사용 합니다. M m2에서 난소 조직의 20000 x 영역을 계산 합니다.
      4. 설계 된 내 피 세포 아래로 회전 시키십시오 그리고 다시 기본 매체 (DMEM) 16.8 µ L의 총 볼륨에 도달에서 그것을 중단.
      5. 얼음에 그것을 유지.
    4. 몇 초 동안 그것을 건조 멸 균 거 즈 스펀지에 난소 조직의 조각을 넣으십시오.
    5. 50 mm 페 트리 접시 내 플라스틱 파라핀 필름 위에 난소 조직의 조각 장소.
    6. 세포 현 탁 액 단계 6.4.3.4, 부드러운 pipetting으로 믹스에서에서 준비에 준비 단계 6.4.1.2, Fibrinogen 솔루션의 39.2 µ L를 추가 합니다. 얼음에 그것을 유지.
    7. 6.4.2.4 단계에서 준비 하는 트 롬 빈 솔루션의 14 µ L를 추가 합니다. 한 번 pipetting으로 부드럽게 혼합. 빠른 작업.
    8. 난소 조직 위에 혼합 배치 피펫으로 길쭉한 작은 물방울의 형태로.
    9. 37 ° c.에 인큐베이터에는 응고와 페 트리 접시를 놓으십시오

7. 양자 Oophorectomy와 공동 NSG 마우스 조작된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식

참고: 10 14 주 된 여성 NSG 쥐21 사용 했다 (잭슨 실험실).

  1. 2.1.3 단계에서 정교로 모든 수술 도구를 준비, 모든 봉합, 패드, 및 유용 외과 테이프를가지고 있는지 확인 하십시오.
  2. 마우스와 Isoflurane 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize
    1. 유도 챔버에 마우스를 놓고 뚜껑 닫고 적절 한 자 지를 엽니다.
    2. 오픈 유량 1000 mL/분 하는 기화 기에 설정 하 고 설정 2-3.5% 제공.
    3. 마 취;의 효과 관찰 의식, 천천히 그리고 일반 호흡의 손실입니다.
    4. 마 취를 유지 하는 원뿔을 전송. 생체 신호에 따라 1-3%를 제공 하는 기화 기를 설정 합니다.
    5. 페달 또는 꼬리 반사의 부재를 확인 합니다. 그것은 결 석 때까지 반사 있으면 isoflurane 증가.
  3. 전기 헤어 트리머를 사용 하 여 clavicles 줄에서 마우스의 뒤로 머리를 잘라.
  4. 수술 플랫폼에서 발생 하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다.
  5. 외과 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼 코 콘 수정 합니다.
  6. 1.25 cm 넓은 외과 종이 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼을 부드럽게 마우스의 사지를 테이프.
  7. 살 균 윤활제 젤리를 사용 하 고 수술 플랫폼 1.25 c m 구멍 플라스틱 외과 테이프를 사용 하 여 그것을 녹화 하 여 홍보 수정 온도계 온도계를 삽입.
  8. 테이프 2.5 c m 넓은 외과 종이 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼에 꼬리.
  9. 적외선 또는 열 패드, 온수를 사용 하 여 열 하 고 절차를 통해 마우스의 온도 모니터링 합니다. 35-37 ° c.의 범위 내에서 체온을 유지
  10. 살 균 Povidone-요오드 솔루션 면봉 막대기로 잘린된 영역을 청소 하 고 닦아 무 균 알코올 준비를 사용 하 여.
  11. 6.9 두 번 더 반복 합니다.
  12. 탈수에서 보호 하 고 각 막에 손상에 마우스의 눈의 각각 메 마른 눈 윤활제 수 의사 연 고의 드롭 장소.
  13. 메 마른 외과 용 드 레이프를 사용 하 여 마우스를 커버.
  14. 주사 Buprenorphine (1 mg/Kg) 하위 피부 (S/C).
  15. 메스 (블레이드 #21)를 사용 하 여 경도 중간 등 쪽 절 개를 수행 합니다.
  16. 양국간 oophorectomy를 지 방식을 사용 합니다.
    1. 피하 결합 조직 무딘 해 부가 위를 사용 하 여 무료.
    2. 중간 확인 절 개를 옆으로 근 막 꼬 집 고 날카로운가 위를 사용 하 여 복 막 구멍에 도달.
    3. 난소와 난소 지방 패드 부드럽게 핀셋으로을 복 부 구멍에 그것을 꺼내.
    4. 혈관 클램프와 난소 및 지방 패드를 파악.
    5. 난소와 난소, 나 팔 관을 원심의 기지에서 4/0 monofilament 흡수 봉합 사를 사용 하 여 지방 패드를 선.
    6. 넥타이 원심 난소를 클립. 그 루터 기의 기지에서 아무 출혈은 다는 것을 확인 하십시오.
    7. 복 부 구멍으로 다시 조직을 놓고 6/0 꼰된 흡수 봉합 사를 사용 하 여 근 막 봉합 합니다.
    8. Contralateral 측면 단계 7.15.1-7.15.7를 반복 합니다.
  17. 공동 난소 조직을 이식.
    1. Gluteus Maximus 혈전 크기에 맞는 길이에 위에 근 막에 수평 절 개를 수행 합니다. 근 막 아래가 위를 열어이 가상 공간 내에서 포켓을 만듭니다.
    2. 단계 6.4.8에서에서 준비 캡슐화 대뇌 피 질의 조직의 원피스를 선택 하 고이 주머니에.
    3. 6/0를 사용 하 여 근 막 봉합 꼰 흡수 봉합 사.
  18. 또한 contralateral 측면 단계 7.16.1-7.16.3를 반복 합니다.
  19. 간단한 중단된 바늘 4/0 monofilament 흡수 봉합 사를 사용 하 여 등 쪽 벽을 닫습니다.
  20. Lidocaine 주사 0.5% (1.2 mL/Kg) 절 개 사이트에 S/C.
  21. 무 균 알코올 준비를 사용 하 여 피부를 청소.
  22. 해제는 isoflurane 마우스의 온도 모니터링 하는 동안.
  23. O2, Isoflurane 없이 1-2 분을 제공 합니다. 그것은 이동 하 고 의식 돌아가기 시작 될 때까지 마우스를 온난화에 계속.
  24. 깨끗 한 복구에 마우스를 놓고 수술 상처의 완전 한 치료까지 나중에 별도 마우스를 집.
  25. 필요에 따라 모든 8-12 h 24 h postoperatively Buprenorphine (1 mg/Kg) S/C를 주입.
  26. 실험의 끝 지점까지 모든 음식, 물, 침구, 및 감 금 소는 압력가 마로 소독, 쥐 별도 연습장에 계속. 가압 통풍이 방에 감 금 소를 유지. 개인 보호 장비를 사용 하 여 쥐를 처리 하는 때마다.

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Representative Results

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경영진의 공동 이식 환자의 조직에 게 혜택 제공 여부를 확인 하려면 해 동된 난소 외피 스트립 동등한 크기의 조각으로 분할 되었고 양측 면역-손상, 끄 덕 scid 감마 (NSG), 쥐에 engrafted. 한쪽에 포함 된 섬유 소 혈전 혼자 (ECs) 그리고 다른 포함 임원 (그림 1a)와 각 마우스 자체 컨트롤을 역임 했습니다. 경영진은 인간의 탯 및 앞에서 설명한22,23으로 Adenoviral 유전자 조각 E4-ORF1 후속 치료에서 1 차 피 내 막의 절연을 통해 얻은 했다. 구절 2-5, 인간의 탯 줄 정 맥 ECs (hUVEC) 내에서 제정 식 cDNA adenoviral 유전자 조각 E4-ORF1 인코딩을 인코딩할 lentiviral 입자 치료 했다. 이 치료는 생존을 강화 하 고 신생 잠재력 endothelium의 앞에서 설명한22,23. 2 주 후, 혈관 기능 끼얹는다 호스트 조직 이식 (그림 1b)의 인터페이스에서 GFP 표시 경영진에서 형성 되었다. 레이블 기능 혈관, 위해 마우스는 조직 수확 전에 10 분 100 mL lectin isoflurane 마 취 (0.5 mg/mL)와 함께 주입 했다. 다음 이식 상대에 상당한 혜택을 설명 하는 2 주에 낭의 부 량 2 주 (그림 1c)에 명확 하 게 분명 했다 경영진 기반 이식에 계산 합니다. 외 인 ECs 공동 난소 조직 (그림 1b)와 대뇌 피 질의 조각 공동 마우스로 이식 이식 또는 인간의 기능 혈관 형성 제어 이식 (그림 1 c 기준으로 살아남은 모 낭의 수를 증가 하는 임원 ). 이 혜택은 경영진 기반 이식 (그림 1의 d)에 감소 거리 지역에 연결-각 이식된 이식에서 3 섹션 했다 물 들일 Trichrome, 평가를24거리 조직 묘사의 설립된 방법 거리 지역: 중간 섹션과 이식의 상단 및 하단 측면에서 600 µ m 깊이 섹션. 얼룩진된 부분 스캔 했다 ImageJ를 사용 하 여 노출 영역을 계량 분석 그리고 거리 지역 설명 수동으로 되었고 전체 이식 지역 (ImageJ 소프트웨어)의 비율로 계량. 최종 값 각각 이식 분석 3 섹션의 평균으로 계산 했다. 중요 한 것은, 인간의 포 피 섬유 아 세포와 함께 이식 된 이식 보여 상대적으로 적은 낭 가난한 조직 생존 능력. (그림 1e)입니다.

우리는 다음 임원 (그림 2ad, f, h) 없이 난소 조직 이식의 장기 기능을 평가합니다. 14 주, 다음 쥐 동물 희생 했다, 여 포 성장 두 쥐 MRI (그림 2b-c)를 통해 모니터링 되 고 진행 하기 전에 시간 가변 길이 대 한 menotropins와 매일 자극 했다. 개발 낭 컨트롤 (그림 2e)와 임원 기반 이식 (그림 2 g, i)에 주목 했다. 점점 더 큰 크기의 낭 경영진 기반 이식 (그림 2 g, i)에 발견 했다. Antral 낭 같은 환자의 조직, menotropins와 자극된에서 파생 하 고 공동 경영진으로 이식에 비해, 고급 뿌리에서 granulosa 셀 레이어 표시 ovulatory 마커 CD4425 의 증가 식 및 HABP126, 뿐만 아니라로 증가 세포 죽음 (Caspase), 그리고 확산 (Ki67) 감소 (그림 2j).

몇 가지 연구는 낭의 수영장 중간 활성화 난소 조직27,,2829,30의 이식에 따라 나타났습니다. 우리 2, 3, 14 주 (그림 3a) 한 환자에서 여러 이식에서 비슷한 추세를 관찰 했다. 활성화 및 낭17,31의 성장을 억압에 AMH의 추정된 기능에 투자, 우리 constitutively 표현 하 고 따라서 직접 paracrine 소스 제공 lentivirus 경영진 공학에 AMH 분 비 이식된 난소 조직 (그림 3b) Lentiviral 변환 증가 표현 불가능 한 양의 AMH ExEC에서 100 위의 GC. Granulosa 셀 종양 세포, 다른 한편으로, 표면에 뜨는 세포 배양에 AMH의 기저 수준 은닉. (그림 3c)입니다. 공동 이식 후 2 주 선박 경영진에서 파생 된 호스트 이식 인터페이스에서 관찰 되었다 및 immunostaining에서 형성 하는 혈관에 상대적인 AMH-임원 (그림 3)에서 파생 된 혈관의 루멘에서 풍부한 AMH 단백질 공개 경영진을 제어 합니다. 경영진의 프로 신생 영향에서 독립적으로 AMH의 기능을 테스트 하려면 우리는 난소 수 질의 조각에서 격리 된 중간 엽 줄기 세포 (MSC)를 사용 합니다. 이러한 셀 lentiviral 입자 AMH 인코딩 불리고 있었고 공동 이식에 사용 하기 위해 문화에 확장. AMH 임원으로 공동 이식 시 2-fold 증가 원시 낭의 비율에서 관찰 되었다. 그러나 이것,, 기본 낭의 비율에 있는 감소에 지도. AMH MSCs 제어 MSCs (그림 3 층, h)를 기준으로 10 여 원시 낭의 증가 보존으로 이어질. MSCs, 경영진, 비 세포 이식 (Ctl), AMH MSCs ExEC 및 AMH-임원 (그림 3i) 사이의 비교를 만들 때 무부하 follicular 풀의 보존에 가장 중요 한 혜택 AMH ECs에 의해 수 여 되었다.

Figure 1
그림 1:와 난소 외피 스트립의 공동 이식 임원 생존 능력을 향상 하 고 보존 follicular 풀. 실험적인 디자인의 (a) 체계. 인간의 난소 조직 냉동-해 동 섬유 소 혈전, 또는 경영진 없이에서 캡슐화 되었습니다. 혈전 oophorectomized NSG 쥐에 이식 되었고 실험의 끝 지점에서 수확. (b) 인간 대뇌 피 질의 이식 공동 hUVEC 파생 임원 (녹색);와 이식 적혈구는 TER-119 레이블로 사용 하 고는 이식의 경계는 흰색에 설명 되어 있습니다. (c)와 마우스 또는 인간의 임원 + MAD. 없이 이식에서 총 낭의 평균 비율 * P < 0.05. (d) 의 이식 없이 마우스 또는 인간의 임원 + MAD.에서에서 거리 영역 평균 비율 * * P < 0.001. (e) 공동 경영진, 셀, 없이 인간의 포 피 섬유 아 세포를 이식 하는 난소 이식의 대표 섹션. 이 그림 남자 에서 수정 되었습니다. Sci 의원 2017 8 월 15 일; 7 (1): 8203. 도: 10.1038/s41598-017-08491-z. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 장기 생존 및 난소 조직 이식의 기능 경영진에 의해 개량 된다. 그림 b, c, d, f, 그리고 h 왼쪽에 이식에서는 컨트롤 없음 ECs, 오른쪽에는 이식 공동 경영진으로 이식 하는 동안 있습니다. 난소 외피 조직의 장기이 종이 식에 대 한 (a) 실험적인 체계. (b) 그림 b와 c, 별표 (오른쪽) 공동 화살촉 (왼쪽) 셀과 이식 난소 조직을 대표 하는 그러나, ECs와 이식 난소 조직을 나타냅니다. 마우스 #1 6 세 기증자 로부터 조직으로 xenografted 되었고 자극 (14 주, 왼쪽)와 자극 (15.5 주, 오른쪽)의 10 일 후 다시 발병에 MRI에 의해 모니터링. (c) 마우스 #3 xenografted 19 세 기증자 로부터 조직으로 되었고 6 (20 주 후 이식), MRI에 의해 모니터링 7 (21 승), 그리고 8 (22 승) 주 자극의 개시에 따라. (d) 거시적인 이미지 engrafted 인간 난소 조직 15.5 주 마우스 #1, 오른쪽에 이식에서 수확의 ExEC 기반 이식 이며 컨트롤 이식의 조직학 보기 (e)에 표시 됩니다. (f) 거시적인 이미지 이식, 마우스 # 2의 20 주 후 희생 했다 및 제어 및 exEC 기반 이식 조직학 분석; 대 한 수확 했다 ExEC 기반 이식 에서처럼 (g). (h) 22 주 후 희생 했다 마우스 # 3에에서 이식의 거시적인 이미지, ExEC 기반 이식의 조직학 분석에 표시 됩니다 (i). (j) 마우스 # 2와 #3 마우스에서 ExEC 기반 이식의 섹션 분자 마커 대 한 스테인드 했다 고 연결된 상자에서 확대 됩니다. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림 남자 에서 수정 되었습니다. Sci 의원 2017 8 월 15 일; 7 (1): 8203. 도: 10.1038/s41598-017-08491-z. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 임원 AMH를 표현 하기 위해 설계 된 보존 무부하 follicular 풀. (a) 낭의 비율 이었다 계량 길고 단기 간격; 공동 ECs와 이식 된 동일한 환자에서 여러 난소 조직 파편에 대 한 n = 3 n 2 주 3 주 및 n = 4 = 14 주 2. (b) 체계 실험 설계입니다. 인간 난소 조직 냉동-해 동 했다 임원/MSCs 제어로 봉사 하는 RFP lentiviral 입자와 불리고 또는 임원/MSCs 불리고 AMH-ECs/MSCs 생성 AMH mCherry lentiviral 입자와 섬유 소 혈전에 캡슐화 됩니다. 혈전 oophorectomized NSG 쥐에 이식 되었고 2 주 수확. (c) 임원 분 비 인간의 AMH; 인코딩 lentivirus를 불리고 있었다 AMH 불리고 경영진의 셀 문화 상쾌한 COV 434 문화 granulosa 셀 종양 선 및 제어 경영진에 비교 되었다. (d) 이식 후 2 주, 난소 조직 파편을 어느 ECs (왼쪽)와 함께 공동 이식 했다 또는 AMH 임원 (오른쪽) AMH 단백질에 대 한 항 체 관련 물 했다. (e) xenografts 공동 제어와 AMH 경영진 이식 모 낭의 상대적 비율 2 주 후 계량 했다 (n = 6). (f) xenografts 공동 제어와 AMH MSCs 이식 모 낭의 상대적 비율 2 주 후 계량 했다 (n = 6). (g) 중간 + 낭의 상대적 비율의 매드 xenografts 제어와 AMH 불리고 경영진 이식에 비교 되었다 (n = 6) 다음 2 주. (h) 낭의 중간 + 미친 상대 비율 xenografts 제어와 AMH 불리고 MSCs 이식에 비교 되었다 (n = 6) 다음 2 주. (i) 중간의 비율 xenografts MSCs와 이식에서 이식 당 관찰된 원시 낭 (n = 6), 임원 (n = 6), AMH MSCs (n = 6), 그리고 AMH 임원 (n = 6) 제어 조건에는 집계에 비교 했다 (셀, n = 15). (D) 인세트는 AMH 경영진에 대 한 및 오른쪽 상자에 확대는 하지 않도록 Ctl 경영진;에 대 한 빨간색과 파란색 선 라인 (d)에 각각 난소 조직 및 호스트 조직 개요. (C)에 오차 막대 3 복제 사이의 표준 편차를 나타냅니다. 오류 막대 (a, g-i)에 나열 된 또는 그래프에 표시 된 복제의 수 사이 매드 대표. 눈금 막대 = 100 µ m (d). * P < 0.05, * * P < 0.005. 이 그림 남자 에서 수정 되었습니다. Sci 의원 2017 8 월 15 일; 7 (1): 8203. 도: 10.1038/s41598-017-08491-z. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

솔루션 자당-BTS (준비 단계 4.2.2)에서 μ Μ에 DMSO
자당-BTS 1 mol/L DMSO와 2787 213
자당-BTS 0.5 mol/L DMSO와 2894 106

표 1: 자당 솔루션 준비입니다.

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Discussion

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여기 우리 경영진의 그 공동 이식 보여 난소 조직 생존 능력 및 기능 마우스에이 종이 식 다음에 상당한 혜택을 제공 합니다. 난소 조직 자동-다 산 보존을 위한 이식의 임상 적용에 대 한 표준을 설정 하 고 최적의 매개 변수 (크기, 이식 사이트, 이식 의 기간) 되지 않은 32 , 33 , 34 follicular 풀의 향상 된 복구에 대 한 정의 되지 않은 남아 있습니다. 자동 이식 때 해 동 외피 난소 조직의 avascular 접목 나머지 난소, 난소 포 등 광범위 한 인35,36골반 사이트에서 주로 수행 됩니다. 아무 엔드-투-엔드 문 합 일어나기 때문이 이식 방법은 허 혈 성 조직 손실의 물결과는 이식 내 거주 하는 모 낭의 조기 활성화에 결과. 따라서, 임원으로 공동 이식 임상 응용 프로그램에 대 한 고려 되 고 전에 훨씬 더 감시를 필요로 하는 증식 내 피 세포의 배달 수반,이 이렇게 조직 revascularization 신속 하 게 수 고 인양 수는 내 난소 이식 모 낭의 강력한 비율입니다.

이러한 연구 결과 나온 소설 혈관 세포 기반 이식 다음 기능과 난소 조직 생존을 최적화 하기 위한 전략. 임상 응용37,38여 실험 상태에서 이동 cryopreserve 난소 조직 및 난소 조직 이식에 대 한 최근 호출을 선택 하는 환자의 성장 수영장을 감안할 때,이 방법은 치료를 제공할 수 있습니다. 이식, 이식 해야 난소 외피 스트립의 수를 줄이는 그들의 장 수 및 기능을 증가 하 고의 더 큰 가능성을 수 있도록 하는 전략.

조기 채용, 또는 "소진", 또한 화학 요법39, 동안 follicular 수영장의 고갈 뿐만 아니라 난소 조직34의 다음 자동 이식에 연결 되었습니다. 수많은 연구 follicular 동원, 억제의 활성화 하는 기능 신호 경로 식별 하 고이 규제 기능 장애는 중요 한 허 혈 성 창 follicular 수영장의 대량 활성화를 발생할 수 있습니다 때는 초기 낭의 대사 요구는 충족 될 수 없습니다. 이런이 맥락에서 경영진의 응용 프로그램에만 reperfusion 가속 하지 것 이라고 하지만 그들의 engraftment 잠재적인, 때문에 경영진도 설계 될 수 있다 그 직접 follicular 동원 요인의 직접적인 paracrine 공급을 제공 하. AMH follicular 성장의 변조기로 활용의 개념 뿐만 아니라 다른 그룹에 의해 적용 되었습니다. 카노 외. 포함 하는 재조합 단백질 이나 바이러스 성 입자40의 IP 주입 중 삼 투 펌프를 통해 배달된 AMH. 이러한 접근의 원시 낭의 보존에 비슷한 추세 가져왔지만 배달을 조직 했다. 그러나 대신, 경영진 은닉 AMH AMH의 로컬 및 지속적인 소스를 제공,, 난소 조직 이식에 설계 된 혈관 세포의 세포 기반 치료와 관련 된 무수 한 위험에 의해 제한 됩니다. 경영진에 외국 항 원에 면역 반응을 가능 하며 증식 세포의 사용은 셀 순환, 이식 및 시체에서 종양 약 성장 육성 가능성을 제기 하고있다. 이러한 제한은 현재 자동 이식 환자에 대 한이 접근의 번역을 배제, 하는 동안 이러한 실험 입증할 프로 신생 영향 및 조 follicular 동원의 억압에 대 한 잠재력을 증대 난소 조직의 출력 이식 하 고 인간 난소 생리학의 기계 론 적인 연구에 대 한 강력한이 종이 식 모델 확립.

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Disclosures

마이클 진 버그 Angiocrine 생물 과학, inc., 샌디에고, 캘리포니아 92130, 미국, 절연, E4-ORF-1 페와 우리가 사용 하는 내 피 세포를 표시 하는 직원입니다.

Acknowledgments

오마르 알렉산더 남자 그림에 대 한입니다.
들어가게 과학 센터와는 ASRM 연구 보조금 및 임 코넬 임상에서 파일럿 수상에 의해 지원 되었다.
저자는 제임스 연구소 회원 원고의 중요 한 독서에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

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References

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공동 설계 된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식: 세포 기반 전략 결합 가속 직접 Paracrine 배달 관류
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Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).More

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