Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ExCYT: उच्च आयामी Cytometry डेटा के विश्लेषण को व्यवस्थित करने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/57473
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,5
1The Bloomberg~Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine, 2The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Immunology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

ExCYT एक MATLAB आधारित ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (GUI) है कि उपयोगकर्ताओं को उनके प्रवाह के माध्यम से cytometry डेटा का विश्लेषण करने की अनुमति देता है उच्च आयामी डेटा के लिए विश्लेषणात्मक तकनीक के माध्यम से टी-SNE, स्वचालित और मैनुअल की एक किस्म क्लस्टरिंग तरीके, heatmaps, और उपंयास उच्च आयामी प्रवाह भूखंडों ।

Abstract

पैरामीटर की बढ़ती संख्या को मापने में सक्षम प्रवाह cytometers के आगमन के साथ, वैज्ञानिकों को phenotypically अपने सेलुलर नमूनों की विशेषताओं का पता लगाने के लिए बड़ा पैनल विकसित करने के लिए जारी है । हालांकि, इन तकनीकी प्रगति उच्च आयामी डेटा सेट है कि तेजी से पारंपरिक मैनुअल आधारित गेटिंग कार्यक्रमों के भीतर होना चाहिए विश्लेषण मुश्किल हो उपज । आदेश में बेहतर विश्लेषण और वर्तमान डेटा, bioinformaticians के साथ वैज्ञानिकों साथी उच्च आयामी डेटा का विश्लेषण करने के लिए उनके प्रवाह cytometry डेटा पार्स में विशेषज्ञता के साथ । हालांकि इन तरीकों को प्रवाह cytometry अध्ययन में अत्यधिक मूल्यवान हो दिखाया गया है, वे अभी तक एक सरल और आसान करने के लिए वैज्ञानिकों, जो गणना या प्रोग्रामिंग विशेषज्ञता की कमी के लिए उपयोग पैकेज में शामिल किया जाना है । इस जरूरत को हल करने के लिए, हम ExCYT, एक MATLAB आधारित ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (GUI) है कि उच्च आयामी सहित डेटा के लिए सामांयतः कार्यरत विश्लेषणात्मक तकनीक को लागू करने के द्वारा उच्च आयामी प्रवाह cytometry डेटा के विश्लेषण को कारगर बनाने का विकास किया है टी द्वारा आयामी कमी-SNE, स्वचालित और मैनुअल clustering तरीकों, heatmaps, और उपंयास उच्च आयामी प्रवाह भूखंडों की एक किस्म । इसके अतिरिक्त, ExCYT और टी-SNE और clustering विश्लेषण के लिए ब्याज की चुनिंदा आबादी के पारंपरिक गेटिंग विकल्प प्रदान करता है और साथ ही टी-SNE भूखंडों पर सीधे गेट्स लागू करने की क्षमता । सॉफ्टवेयर या तो मुआवजा या क्षतिपूर्ति FCS फ़ाइलों के साथ काम करने का अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है । घटना में है कि बाद के अधिग्रहण मुआवजा की आवश्यकता है, उपयोगकर्ता के लिए कार्यक्रम के एकल दाग और एक दाग नमूना की एक निर्देशिका प्रदान चुन सकते हैं । कार्यक्रम सभी चैनलों में सकारात्मक घटनाओं का पता लगाता है और इस चयन डेटा का उपयोग करता है और अधिक निष्पक्ष मुआवजा मैट्रिक्स की गणना । संक्षेप में, ExCYT एक व्यापक विश्लेषण पाइपलाइन प्रदान करता है FCS फ़ाइलों के रूप में प्रवाह cytometry डेटा लेने के लिए और किसी भी व्यक्ति, गणना प्रशिक्षण की परवाह किए बिना अनुमति, अपने डेटा को समझने में नवीनतम एल्गोरिथम दृष्टिकोण का उपयोग करें ।

Introduction

प्रवाह cytometry में अग्रिम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जन cytometry के आगमन की अनुमति दी है चिकित्सकों और वैज्ञानिकों को तेजी से पहचान करने और phenotypically संकल्प के नए स्तर के साथ जैविक और चिकित्सकीय दिलचस्प नमूनों की विशेषताएं, बड़े बनाने उच्च आयामी डेटा सेट है कि जानकारी रिच1,2,3। जबकि ऐसे मैनुअल गेटिंग के रूप में प्रवाह cytometry डेटा का विश्लेषण करने के लिए पारंपरिक तरीके है प्रयोगों के लिए और अधिक सरल है जहां कुछ मार्करों और उन मार्करों नेत्रहीन समझदार आबादी है, इस दृष्टिकोण को उत्पंन विफल कर सकते है reproducible परिणाम जब उच्च आयामी डेटा सेट का विश्लेषण या एक स्पेक्ट्रम पर दाग मार्करों के साथ उन । उदाहरण के लिए, एक बहु-संस्थागत अध्ययन में, जहां अंतरराज्यीय सेलुलर धुंधला (आईसीएस) की परख की जा रही थी reproducibility का आकलन करने के लिए quantitating प्रतिजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं, अच्छी अंतर-प्रयोगशाला परिशुद्धता के बावजूद, विश्लेषण, विशेष रूप से गेटिंग,4परिवर्तनशीलता का एक महत्वपूर्ण स्रोत की शुरुआत की । इसके अलावा, गेटिंग की प्रक्रिया को मैंयुअल रूप से हितों की जनसंख्या, उच्च व्यक्तिपरक होने के अतिरिक्त अत्यधिक समय लगता है और गहन श्रम है । हालांकि, एक मजबूत, कुशल में उच्च आयामी डेटा सेट का विश्लेषण करने की समस्या है, और समय पर तरीके से अनुसंधान विज्ञान के लिए एक नया नहीं है । जीन अभिव्यक्ति अध्ययन अक्सर अत्यधिक उच्च आयामी डेटा सेट उत्पंन (अक्सर जीन के सैकड़ों के आदेश पर) जहां विश्लेषण के मैनुअल रूपों बस साध्य होगा । आदेश में इन डेटा सेट के विश्लेषण से निपटने के लिए, वहां bioinformatic उपकरण के विकास के लिए जीन अभिव्यक्ति डेटा5पार्स में बहुत काम किया गया है । इन एल्गोरिथम दृष्टिकोण अभी हाल ही में मानकों की संख्या के रूप में cytometry डेटा के विश्लेषण में अपनाया गया है वृद्धि हुई है और इन उच्च आयामी डेटा के विश्लेषण में अमूल्य साबित किया है6,7सेट ।

पीढ़ी और एल्गोरिदम और सॉफ्टवेयर संकुल की एक किस्म है कि वैज्ञानिकों को इन उच्च उनके प्रवाह cytometry डेटा के लिए आयामी bioinformatic दृष्टिकोण लागू करने की अनुमति के आवेदन के बावजूद, इन विश्लेषणात्मक तकनीक अभी भी मोटे तौर पर अप्रयुक्त रहते हैं । जबकि वहां कारकों की एक किस्म है कि cytometry8डेटा के लिए इन दृष्टिकोण के व्यापक अपनाने सीमित है हो सकता है, प्रमुख बाधा हम वैज्ञानिकों ने इन तरीकों के उपयोग में संदेह है, गणना ज्ञान की कमी है । वास्तव में, इन सॉफ्टवेयर संकुल के कई (यानी, flowCore, flowMeans, और OpenCyto) आर के रूप में प्रोग्रामिंग भाषाओं में लागू किया जा लिखा है कि अभी भी ठोस प्रोग्रामिंग ज्ञान की आवश्यकता है । इस तरह के FlowJo के रूप में सॉफ्टवेयर संकुल के उपयोग की सादगी और ' प्लग-एन-प्ले ' प्रकृति, साथ ही पीसी ऑपरेटिंग सिस्टम के साथ संगतता के कारण वैज्ञानिकों के बीच एहसान मिल गया है । आदेश में वैज्ञानिक अपरिचित प्रोग्रामिंग करने के लिए स्वीकार किए जाते है और मूल्यवान विश्लेषणात्मक तकनीक की विविधता प्रदान करने के लिए, हम ExCYT, एक ग्राफिक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस (जीयूआई) है कि आसानी से एक पीसी पर स्थापित किया जा सकता है विकसित की है/मैक कि नवीनतम तकनीकों के कई खींचती है सहज ज्ञान युक्त दृश्य, clustering तरीकों की एक किस्म के लिए आयामी कमी सहित साहित्य में उद्धृत, heatmaps और उपंयास उच्च आयामी प्रवाह के साथ इन clustering एल्गोरिदम के उत्पादन का पता लगाने के लिए उपंयास सुविधाओं के साथ साथ/

ExCYT एक ग्राफिकल यूजर MATLAB में निर्मित इंटरफेस है और इसलिए या तो MATLAB के भीतर सीधे चला जा सकता है या एक installer प्रदान की है कि किसी भी पीसी पर सॉफ्टवेयर स्थापित किया जा सकता है/ सॉफ्टवेयर https://github.com/sidhomj/ExCYT पर उपलब्ध है । हम कैसे डेटा आयात करने के लिए, पूर्व यह प्रक्रिया, टी SNE आयामी कमी, क्लस्टर डेटा, सॉर्ट & फ़िल्टर क्लस्टर उपयोगकर्ता वरीयताओं पर आधारित है, और heatmaps और उपंयास के माध्यम से ब्याज की समूहों के बारे में जानकारी प्रदर्शित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत उच्च-आयामी प्रवाह/बॉक्स भूखंडों (चित्रा 1)। टी-SNE भूखंडों में कुल्हाड़ियों मनमाने और मनमाने ढंग से इकाइयों में और जैसे हमेशा उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस की सादगी के लिए आंकड़े में नहीं दिखाया गया है । "t-SNE Heatmaps" में डेटा बिंदुओं का रंग इंगित मार्कर के सिग्नल के आधार पर नीले से पीले रंग का होता है । clustering समाधान में, डेटा बिंदु का रंग क्लस्टर संख्या पर मनमाने तरीके से आधारित है । कार्यप्रवाह के सभी भागों में एक पैनल जीयूआई (चित्रा 2 & तालिका 1)में किया जा सकता है । अंत में, हम पहले से प्रकाशित साहित्य में गुर्दे सेल कार्सिनोमा की प्रतिरक्षा परिदृश्य की खोज डेटा पर ExCYT के उपयोग को प्रदर्शित करेगा, भी इसी तरह के तरीकों के साथ विश्लेषण किया । नमूना डेटासेट हम नीचे प्रोटोकॉल के साथ इस पांडुलिपि में आंकड़े बनाने के लिए इस्तेमाल किया https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875 पर पाया जा सकता है, एक खाता दर्ज करने पर ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cytometry डेटा एकत्रित करना और तैयार करना

  1. एक फ़ोल्डर में सभी एकल दाग खुद के द्वारा और लेबल चैनल नाम द्वारा (fluorophore, नहीं मार्कर द्वारा) प्लेस ।

2. पूर्व प्रसंस्करण & डेटा आयात

  1. इस विश्लेषण पाइपलाइन को विराम देने या सहेजने के लिए, कार्यस्थान को ' के रूप में सहेजने के लिए प्रोग्राम के नीचे बाईं ओर स्थित कार्यस्थान सहेजें ' बटन का उपयोग करें । ' चटाई फ़ाइल है कि बाद में लोड कार्यक्षेत्र बटन के माध्यम से लोड किया जा सकता है । एक समय में प्रोग्राम के एक से अधिक इंस्टेंस न चलाएं । इसलिए, जब कोई नया कार्यस्थान लोड कर रहा है, तो जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई अंय आवृत्ति ExCYT चल रहा है ।
  2. विश्लेषण पाइपलाइन शुरू करने के लिए, पहले cytometry के प्रकार का चयन करें (फ्लो cytometry या मास cytometry – CYTOF), फ़ाइल चयन पैरामीटर के अंतर्गत फ़ाइल से नमूना करने के लिए घटनाओं की संख्या का चयन करें (इस उदाहरण के लिए उपयोग २,०००). एक बार डेटा सफलतापूर्वक आयात कर लिया गया है, एक संवाद बॉक्स पॉप अप उपयोगकर्ता कि डेटा सफलतापूर्वक आयात किया गया है सूचित करेगा ।
  3. प्रेस ऑटो मुआवजा बटन एक वैकल्पिक ऑटो मुआवजा कदम आचरण, के रूप में Bagwell & एडंस9द्वारा किया जाता है । एकल दाग युक्त निर्देशिका का चयन करें । उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस संवाद के भीतर अनदाग नमूने का चयन करें ।
    1. एक आगे/साइड-तितर बितर गेट इस निर्देशिका है कि घटनाओं का चयन करने के लिए मुआवजा मैट्रिक्स की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा में से किसी भी नमूने पर । यह इस प्रयोजन के लिए दाग नमूने का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । इस बिंदु पर, एक एल्गोरिथ्म एक दाग के प्रत्येक में सकारात्मक घटनाओं को परिभाषित करने के लिए क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स की गणना करने के लिए unstain हुआ नमूना के ९९वें प्रतिशत पर सुसंगत थ्रेसहोल्ड सेट लागू किया गया है । जब यह समाप्त हो जाता है, तो एक संवाद बॉक्स उपयोगकर्ता को सूचित करेगा कि क्षतिपूर्ति प्रदर्शन किया गया है ।
  4. अगला, प्रेस गेट जनसंख्या और ब्याज की कोशिकाओं की आबादी का चयन करें, के रूप में प्रवाह cytometry विश्लेषण में संमेलन है । जब कक्षों की जनसंख्या चयनित है, तो घटनाओं के प्रतिशत की संख्या दर्ज करें बहाव विश्लेषण (इस १०,००० घटनाओं में) ।
  5. इसके बाद, पूर्व-संसाधन बॉक्स (उदाहरण में दिखाए गए विशिष्ट चैनलों का उपयोग करें) के दूर दाईं ओर स्थित सूची बॉक् स में विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले संख् या चैनल का चयन करें ।

3. टी-SNE विश्लेषण

  1. t- SNE बटन दबाएँ करने के लिए प्रोग्राम प्रारंभ करें टी-SNE बटन के नीचे विंडो में विज़ुअलाइज़ेशन के लिए सेट कम आयामी डेटा की गणना करने के लिए शुरू. t-SNE की छवि सहेजने के लिए, TSNE छवि सहेजेंदबाएं । एक मशीन पर 8 सीपीयू @ ३.४ गीगा प्रत्येक और 8 जीएम रैम के साथ इस चरण के बारे में 2 मिनट लग जाना चाहिए १०,००० घटनाओं के लिए 10 मिनट, ५०,००० घटनाओं के लिए और 20 मिनट के लिए १००,००० घटनाओं ।
  2. एक ' टी-SNE हीटमैप ' बनाने के लिए, जैसा कि कई CYTOF प्रकाशनों में देखा गया है10,11, मार्कर-विशिष्ट t-SNE पॉप-अप मेनू से एक विकल्प का चयन करें (उदाहरण में दर्शाए अनुसार विशिष्ट मार्करों CD64 या CD3 का उपयोग करें) । एक आंकड़ा टी-SNE साजिश है कि चित्रा पीढ़ी के लिए बचाया जा सकता है की एक हीटमैप प्रतिनिधित्व दिखा पॉप जाएगा ।
  3. गेट टी-SNE बटन का उपयोग करके आगे के बहाव के विश्लेषण के लिए उपयोगकर्ता द्वारा t-SNE भूखंडों में रुचि के क्षेत्रों का चयन करें ।

4. क्लस्टर विश्लेषण

  1. clustering विश्लेषण आरंभ करने के लिए, क्लस्टरिंग विधि सूची बॉक्स में कोई विकल्प का चयन करें (इस उदाहरण में हमें DBSCAN की दूरी फ़ैक्टर के साथ 5 संवाद बॉक् स के दाईं ओर) । क्लस्टर बटन दबाएँ ।
  2. स्वचालित क्लस्टरिंग एल्गोरिथ्म ' स्वचालित clustering पैरामीटर ' कक्ष में पाया के लिए निंन विकल्पों में से एक का उपयोग करें:
    1. हार्ड KMEANS (t-SNE पर): सीमित 2-आयामी t-SNE डेटा के लिए क्लस्टरिंग k-means लागू करें और एल्गोरिथ्म12करने के लिए प्रदान करने के लिए क्लस्टर्स की संख्या की आवश्यकता है ।
    2. हार्ड KMEANS (HD डेटा पर): k-का अर्थ है कि t-SNE एल्गोरिथ्म के लिए दिया गया था मूल उच्च-आयामी डेटा के लिए clustering लागू करें । एक बार फिर, समूहों की संख्या एल्गोरिथ्म को प्रदान करने की आवश्यकता है ।
    3. DBSCAN: clustering, के घनत्व आधारित स्थानिक clustering के साथ शोर13 कि कम 2-आयामी t-SNE डेटा क्लस्टर और एक गैर आयामी दूरी कारक है कि सामांय आकार निर्धारित करता है की आवश्यकता के साथ आवेदन की clustering विधि लागू क्लस्टर्स. क्लस्टरिंग एल्गोरिथ्म के इस प्रकार यह क्लस्टर नॉन-spheroidal क्लस्टर में अक्सर कम t-SNE प्रतिनिधित्व में मौजूद है जो करने में सक्षम है के रूप में t-SNE कमी करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है । इसके अतिरिक्त, तथ्य यह है कि यह 2 आयामी डेटा पर चल रही के कारण, यह तेजी से clustering एल्गोरिदम में से एक है ।
    4. श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग: जहां पूरे इयूक्लिडियन दूरी मैट्रिक्स एल्गोरिथ्म क्लस्टर का आकार सेट करता है एक दूरी कारक प्रदान करने से पहले सभी ईवेंट्स के बीच परिकलित है उच्च-आयामी डेटा के लिए पारंपरिक पदानुक्रम clustering विधि लागू करें ।
    5. नेटवर्क ग्राफ- आधारित: एक clustering विधि है कि सबसे हाल ही में प्रवाह cytometry डेटा विश्लेषण में पेश किया गया है जब वहां दुर्लभ उपजनसंख्या है कि उपयोगकर्ता11,14का पता लगाने के लिए चाहता है लागू होते हैं । यह विधि पहले डेटा में सभी घटनाओं के बीच कनेक्शन निर्धारित करता है एक ग्राफ़ बनाने पर निर्भर करता है । इस कदम के लिए एक प्रारंभिक पैरामीटर प्रदान करने के लिए ग्राफ, जो कश्मीर की संख्या निकटतम पड़ोसियों है बनाने के होते हैं । यह पैरामीटर सामांयत: क्लस्टर्स के आकार को नियंत्रित करता है । इस बिंदु पर, एक और संवाद बॉक्स चबूतरे उपयोगकर्ता पूछ 5 clustering एल्गोरिदम कि ग्राफ के लिए आवेदन किया है में से एक को रोजगार । ये ग्राफ की मॉड्यूलरता को अधिकतम करने के लिए 3 विकल्प शामिल हैं, Danon विधि, और एक वर्णक्रमीय clustering एल्गोरिथ्म14,15, 16,17,18. एक आम तौर पर तेजी से clustering समाधान चाहता है, तो हम वर्णक्रमीय clustering या तेजी से लालची मॉड्यूलर अधिकतम की सिफारिश । जबकि Danon विधि के साथ मॉड्यूलरता प्रीहीट तरीकों क्लस्टर्स की इष्टतम संख्या निर्धारित करते हैं, वर्णक्रमीय क्लस्टरिंग कार्यक्रम के लिए दिया जा करने के लिए क्लस्टर की संख्या की आवश्यकता है ।
    6. स्व-संगठित मानचित्र: उच्च आयामी डेटा क्लस्टर के लिए एक कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क को रोजगार ।
    7. GMM-अपेक्षा अधिकतमीकरण: एक गाऊसी मिश्रण उंमीद अधिकतम (EM) तकनीक क्लस्टर उच्च आयामी डेटा का उपयोग कर मॉडल बनाएं । 19 इस प्रकार की क्लस्टरिंग विधि क्लस्टर्स की संख्या इनपुट करने के लिए उपयोगकर्ता भी आवश्यक है ।
    8. रूपांतरात्मक Bayesian अनुमान GMM के लिए: एक गाऊसी मिश्रण मॉडल लेकिन उंहें बनाने के विपरीत, यह स्वचालित रूप से मिश्रण घटक k.20 की संख्या निर्धारित कर सकते हैं, जबकि कार्यक्रम के लिए दिया जा करने के लिए समूहों की संख्या की आवश्यकता होती है (से बड़ा क्लस्टर की अपेक्षित संख्या), एल्गोरिथ्म अपने आप पर इष्टतम संख्या निर्धारित करेगा ।
  3. t-SNE प्लॉट के किसी विशेष क्षेत्र का अध्ययन करने के लिए, उपयोगकर्ता-निर्धारित क्लस्टर का एक सेट आरेखित करने के लिए क्लस्टर मैंयुअली का चयन करें बटन दबाएं । नोट, क्लस्टर सदस्य साझा नहीं कर सकता (यानी, प्रत्येक इवेंट केवल 1 क्लस्टर के लिए कर सकते हैं) ।

5. क्लस्टर निस्पंदन

  1. या तो मैन्युअल रूप से या ऊपर वर्णित स्वचालित विधियों में से एक के माध्यम से इस प्रकार के माध्यम से फिल्टर किया जा सकता है की पहचान की समूहों के सेट (ओं) ।
    1. समूहों ( क्लस्टर फ़िल्टर पैनल में) सॉर्ट करने के लिए प्रयोग में मापा मार्करों में से किसी के द्वारा, सॉर्ट पॉप-अप मेनू से एक विकल्प का चयन करें । यह सेट करने के लिए कि ऑर्डर आरोही या अवरोही क्रम में है, आरोही/अवरोही बटन को सॉर्ट करें पॉप-अप मेनू के दाईं ओर दबाएं । यह ' क्लस्टर्स (निस्पंदन) ' सूची बॉक्स में क्लस्टर्स और फिर से उन्हें उस मार्कर के माध्य क्लस्टर अभिव्यक्ति के घटते क्रम में आदेश का अद्यतन करेगा । ' क्लस्टर (निस्पंदन) ' सूची बॉक्स में प्रतिशत चिह्नित इस क्लस्टर का प्रतिनिधित्व करने वाली जनसंख्या का प्रतिशत को नोट करता है ।
    2. किसी निश्चित चैनल में दिए गए क्लस्टर के लिए ंयूनतम थ्रेशोल्ड मान सेट करने के लिए, थ्रेशोल्ड पॉप-अप मेनू से एक विकल्प चुनें (इस उदाहरण में हमें मार्कर CD65 और ०.७५ पर एक थ्रेशोल्ड सेट करें) । या तो ग्राफ़ के नीचे संख्यात्मक बॉक्स में कोई मान लिखें या थ्रेशोल्ड सेट करने के लिए स्लाइड-पट्टी का उपयोग करें. थ्रेशोल्ड सेट होने के बाद, ऊपर थ्रेशोल्ड जोड़ें दबाएँ या थ्रेशोल्ड की दिशा निर्दिष्ट करने के लिए थ्रेशोल्ड नीचे जोड़ें . एक बार इस थ्रेशोल्ड सेट किया गया है, यह ' क्लस्टर फ़िल्टर ' कक्ष के आगे थ्रेशोल्ड बॉक्स में सूचीबद्ध किया जाएगा जहां मार्कर, थ्रेशोल्ड मान, और दिशा सूचीबद्ध किया जाएगा ताकि उपयोगकर्ता यह जान सके कि कौन सी सीमाएं वर्तमान में लागू की जा रही हैं । अंत में, t-SNE भूखंड समूहों है कि निस्पंदन की आवश्यकताओं को पूरा नहीं करते और ' क्लस्टर्स (निस्पंदन) ' सूची बॉक्स कि निस्पंदन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए क्लस्टर दिखाने के लिए अद्यतन करेगा बाहर धुंधला द्वारा अद्यतन करेगा ।
    3. किसी क्लस्टर की आवृत्ति के लिए न्यूनतम थ्रेशोल्ड सेट करने के लिए, क्लस्टर आवृत्ति थ्रेशोल्ड में एक संख्यात्मक कट-ऑफ दर्ज करें (%) बॉक्स में क्लस्टर फ़िल्टर फलक (में इस उदाहरण का उपयोग 1%) ।

6. क्लस्टर विश्लेषण & विज़ुअलाइज़ेशन

  1. आगे विश्लेषण और दृश्यावलोकन के लिए क्लस्टर का चयन करने के लिए, क्लस्टर्स (निस्पंदन) सूची बॉक्स में क्लस्टर का चयन करें और उन्हें क्लस्टर विश्लेषण सूची बॉक्स में ले जाने के लिए à बटन का चयन करें दबाएँ ।
  2. क्लस्टर का heatmaps बनाने के लिए, क्लस्टर में रुचि के क्लस्टर्स का चयन करें सूची विश्लेषण और क्लस्टर का हीटमैप बटन दबाएँ । इस बटन दबाया जाता है, एक आंकड़ा क्लस्टर और पैरामीटर अक्ष पर dendrograms के साथ साथ एक गर्मी नक्शा युक्त पॉप जाएगा. अनुलंब अक्ष पर dendrogram क्लस्टर्स से संबंधित हैं, जबकि क्षैतिज अक्ष पर dendrogram समूह मार्करों को सह-संबद्ध है जो समूहीकृत करेगा । हीटमैप को बचाने के लिए, प्रेस फाइल । निर्यात सेटअप । निर्यात करें ।
  3. एक ' उच्च आयामी बॉक्स प्लॉट ' या ' उच्च आयामी प्रवाह भूखंड, ' बनाने के लिए क्लस्टर में रुचि के समूहों का चयन करें सूची विश्लेषण और या तो उच्च आयामी बॉक्स प्लॉट बटन या उच्च आयामी प्रवाह भूखंड बटन दबाएँ । इन भूखंडों का उपयोग नेत्रहीन सभी आयामों में विभिन्न समूहों के दिए गए चैनलों के वितरण का आकलन करने के लिए किया जा सकता है.
  4. पारंपरिक 2 डी प्रवाह भूखंडों में क्लस्टर दिखाने के लिए, पारंपरिक प्रवाह भूखंड पैनल में परिवर्तन (रैखिक, log10, arcsinh) और चैनल का चयन करें और पारंपरिक प्रवाह भूखंड दबाएँ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

आदेश में ExCYT की उपयोगिता का परीक्षण करने के लिए, हम एक उपचारात्मक डेटा Chevrier एट अल द्वारा प्रकाशित सेट का विश्लेषण किया । ' शीर्षक से एक प्रतिरक्षा एटलस स्पष्ट सेल गुर्दे कार्सिनोमा ' जहां समूह ट्यूमर ७३ से लिया नमूनों पर एक व्यापक प्रतिरक्षा पैनल के साथ CyTOF विश्लेषण का आयोजन किया मरीजों को11. दो अलग पैनल, एक माइलॉयड और लसीकावत् पैनल, phenotypically ट्यूमर microenvironment विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया । हमारे अध्ययन का उद्देश्य उनके टी-SNE और क्लस्टर विश्लेषण के परिणामों को दोहराऊंगा करना था, जिससे यह दर्शाया जा सके कि ExCYT का उपयोग उसी निष्कर्ष पर आने के लिए किया जा सकता है और साथ ही विज़ुअलाइज़ेशन और क्लस्टर विश्लेषण की अतिरिक्त विधियाँ भी दिखाएँ.

मूल पांडुलिपि में, समूह 22 टी सेल लसीकावत् पैनल और 17 सेल माइलॉयड पैनल द्वारा पहचान समूहों द्वारा की पहचान की समूहों का वर्णन किया । चित्रा 3 में & चित्र प्रकाशन के 4, समूह heatmaps समूहों, रंग कोडित clustering समाधान के साथ टी SNE भूखंडों, और टी SNE heatmaps उपपैनल ए, बी, & सी में दिखाता है । विश्लेषण करने के लिए, हमने Cytobank से मैंयुअल रूप से gated डेटा प्राप्त किया और प्रत्येक फ़ाइल से २,००० ईवेंट्स का नमूना लिया या यदि यह २,००० से कम घटनाओं था, तो मूल पांडुलिपि में सचित्र विश्लेषण पाइपलाइन का अनुसरण करते हुए संपूर्ण फ़ाइल ले ली । इस बिंदु पर, हम हमारे पोस्ट के माध्यम से १००,००० घटनाओं की कुल नमूना-गेटिंग नमूना पैरामीटर, टी SNE विश्लेषण का आयोजन किया, और विभिंन तरीकों से डेटा का पता लगाने के लिए clustering तरीकों की एक किस्म का उपयोग ।

सबसे पहले, हम टी SNE विश्लेषण को पूरा करने और विभिंन मार्करों (3 ए आंकड़ा) के heatmaps बनाने के द्वारा मूल पांडुलिपि के रूप में एक ही विश्लेषण पाइपलाइन का पालन करके माइलॉयड पैनल की जांच की । जबकि मूल पांडुलिपि प्रत्येक मार्कर के ९९वें प्रतिशत करने के लिए टी SNE heatmaps सामान्यीकृत, ExCYT इसके heatmaps के लिए सामान्यीकरण के इस प्रकार नहीं करता है. हालांकि, मार्कर सह अभिव्यक्ति के समान वितरण मूल पांडुलिपि में वर्णित के रूप में मनाया गया । हम तो एक नेटवर्क ग्राफ-१०० k-निकटतम पड़ोसियों के साथ ग्राफ बनाने के द्वारा डेटा clustering के आधार पर लागू किया है और ग्राफ की मॉड्यूलरता का अनुकूलन के माध्यम से ग्राफ तेजी से ExCYT के भीतर लालची कार्यांवयन का उपयोग करके, जहां हम 19 पाया उप कोशिकाओं की आबादी (चित्र बी) । जब इन मूल पांडुलिपि में प्रकाशित हीटमैप के साथ ExCYT द्वारा बनाई गई समूहों के हीटमैप की तुलना, हम नोट किया है कि हम माइलॉयड कोशिकाओं के समान समूहों की पहचान करने में सक्षम थे (आंकड़ा 3सी). नोट की, मूल पांडुलिपि की पहचान की और दो उप माइलॉयड कोशिकाओं की आबादी है कि हम अपने विश्लेषण में पहचान की एचएलए द्वारा परिभाषित-डॉintCD68intCD64intCD36+CD11b+ (क्लस्टर 13) और एचएलए-डॉ+ विपरीत CD4+CD68+CD64+CD36-CD11b- (क्लस्टर 18). इन दोनों की आबादी के उच्च-आयामी बॉक्स प्लॉट द्वारा विज़ुअलाइज़ेशन छह मार्करों (चित्रा 1 d) में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद (मान-Whitney) से पता चला.

अगले, हम एक और अधिक पारंपरिक और तेजी से श्रेणीबद्ध clustering दृष्टिकोण के साथ लसीकावत् पैनल का विश्लेषण किया । इस दृष्टिकोण टी-SNE heatmaps (चित्रा 4a) के माध्यम से इसी तरह मार्कर वितरण उपज । इसके अलावा, पदानुक्रम clustering (चित्रा 4B) के माध्यम से डेटा की clustering, लसीकावत् कोशिकाओं के समान समूहों (चित्रा 4c) का प्रदर्शन किया । नोट की, हम भी CD4 के रूप में परिभाषित मूल पांडुलिपि से अद्वितीय विनियामक टी सेल जनसंख्या की पहचान+CD25+Foxp3+CTLA-4+CD127- (क्लस्टर 17) हमारे उच्च आयामी प्रवाह भूखंड (चित्रा 4d) के माध्यम से ।

अंत में, हम ExCYT के भीतर एक विधि को काम करने के लिए जल्दी और मात्रात्मक सह का आकलन मार्करों के बीच संघों चाहता था । हम एक कठिन कश्मीर का उपयोग करके शुरू हुआ दो आयामी टी-SNE डेटा (चित्रा 4E) पर ५,००० समूहों नीचे बिछाने के लिए clustering एल्गोरिथ्म का मतलब है । हम तो इन समूहों (चित्रा 4F) से एक हीटमैप बनाने के लिए इन सभी समूहों के सभी मार्करों की औसत अभिव्यक्ति का इस्तेमाल किया । चूंकि इन heatmaps क्लस्टर पंक्तियों के साथ ही स्तंभ जो समान हैं, समूहों की एक ठीक मेष लागू करने और फिर एक हीटमैप बनाने के द्वारा डेटा सार के इस विधि हमें सह-संघों के सह-टिम-3, पीडी-1, CD38 के संघ के रूप में आसानी से लेने के लिए अनुमति देता है, और 4-1BB ।

Figure 1
चित्र 1: ExCYT पाइपलाइन & सुविधाएं । (क) ExCYT कच्चे FCS डेटा आयात करने से शुरू होता है, वैकल्पिक मुआवजा, गेटिंग, और बहाव विश्लेषण से पहले यादृच्छिक नमूना लागू । यह सुनिश्चित करता है सभी घटनाओं का विश्लेषण किया जा रहा प्रयोग करने के लिए प्रासंगिक है विश्लेषण किया जा रहा है । टी SNE आयामी कमी तो सभी घटनाओं और टी SNE heatmaps कल्पना करने के लिए किया जाता है phenotypic वितरण visualize उत्पंन किया जा सकता है । अंत में, clustering एल्गोरिदम की एक किस्म या तो टी SNE परिवर्तन या उच्च आयामी कच्चे डेटा पर लागू किया जा सकता है । (ख) उपंयास छंटाई और थ्रेसहोल्ड सुविधाओं उपयोगकर्ताओं को जल्दी संभवतः समूहों के सैकड़ों के माध्यम से तरह के हित के लोगों को खोजने के लिए अनुमति देते हैं । (ग) समूहों की Heatmaps कैसे एकाधिक समूहों एक दूसरे से तुलना के रूप में अच्छी तरह के रूप में जो मार्करों सह सहयोगी की जांच करने के लिए बनाया जा सकता है । (घ) उपन्यास उच्च-आयामी प्रवाह/बॉक्स भूखंडों डेटा के उच्च आयामी प्रकृति की प्रशंसा करते हुए मूल डेटा पर बैक-गेटिंग क्लस्टर्स के एक प्रपत्र के रूप में उत्पन्न किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ExCYT ग्राफिकल यूजर इंटरफेस: ExCYT ग्राफिकल यूजर इंटरफेस एक कारगर काम के लिए पैनल के बाएं से दाएं से काम कर प्रवाह के रूप में उपयोगकर्ता अपने डेटा आयात, टी SNE आयामी कमी, clustering, और अंतिम क्लस्टर विश्लेषण और दृश्य का आयोजन की अनुमति देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: माइलॉयड उप की Recapitulation-Chevrier एट अल से आबादी । (क) टोकन t-SNE माइलॉयड पैनल के heatmaps (बी) टी-SNE साजिश माइलॉयड पैनल रंग नेटवर्क द्वारा कोडित-ग्राफ clustering एल्गोरिथ्म (सी) माइलॉयड पैनल पर clustering समाधान (D) की पहचान की समूहों के हीटमैप तुलनात्मक उच्च आयामी बॉक्स साजिश विषम माइलॉयड उपजनसंख्या की तुलना (क्लस्टरों 13 & 18) मूल पांडुलिपि में संदर्भित इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: लसीकावत् उप की Recapitulation-Chevrier एट अल से आबादी । (A) टोकन t-SNE heatmaps of लसीकावत् पैनल (B) t-SNE प्लॉट ऑफ़ लसीकावत् पैनल रंग कोडित द्वारा श्रेणीबद्ध clustering एल्गोरिथ्म (C) हीटमैप पैनल पर clustering समाधान द्वारा पहचाने गए क्लस्टर्स की ( D) उच्च आयामी प्रवाह की पहचान की साजिश विनियामक टी सेल जनसंख्या (क्लस्टर 17) मूल पांडुलिपि में (ई) clustering समाधान ५,००० के क्लस्टर हार्ड k-means विश्लेषण पर t-SNE डेटा (F) हीटमैप द्वारा पहचाने गए क्लस्टर्स का मतलब लसीकावत् पर क्लस्टरिंग समाधान मार्कर सह संघों दिखा पैनल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नहीं. विवरण नाम (GUI में)
1 Cytometry के प्रकार का चयन करें ना
2 रॉ डेटा का यादृच्छिक नमूना ना
3 विश्लेषण के लिए फ़ाइलों का चयन करें फ़ाइल (फ़ाइलों) का चयन करें
4 ऑटो सॉफ्टवेयर के लिए प्रदान की एकल दाग की निर्देशिका के आधार पर रॉ डेटा का मुआवजा ऑटो मुआवजा
5 गेटिंग t-SNE और clustering विश्लेषण के लिए ईवेंट्स का चयन करने के लिए गेट जनसंख्या
6 gated डेटा का यादृच्छिक नमूना (निरपेक्ष संख्या) ना
7 gated डाटा का रेंडम उपनमूना (gated जनसंख्या का प्रतिशत) ना
8 विश्लेषण के लिए चैनल का चयन करें ना
9 रन टी-SNE आयामी कमी टी-SNE
10 टी-SNE विंडो ना
11 कार्यस्थान सहेजें कार्यस्थान सहेजें
12 कार्यस्थान लोड कार्यस्थान लोड
13 चयन मार्कर पर t-SNE हीटमैप बनाएं ना
14 गेट टी-SNE के लिए फिर से करें टी-SNE का चयन जनसंख्या का विश्लेषण गेट टी-SNE
15 छवि के रूप में टी-SNE विंडो सहेजें TSNE छवि सहेजें
16 क्लस्टरिंग एल्गोरिथ्म का चयन करें क्लस्टरिंग विधि
17 दिए गए एल्गोरिथ्म के लिए क्लस्टरिंग पैरामीटर दर्ज करें ना
18 क्लस्टर विश्लेषण क्लस्टर
19 समूहों को मैंयुअली आरेखित करना मैंयुअल रूप से क्लस्टर का चयन करें
20 क्लस्टर विश्लेषण फिर से करने के लिए सभी क्लस्टर साफ़ करें क्लस्टर साफ़ करें
21 वर्तमान फ़िल्टर शर्तों के तहत क्लस्टर्स दिखाएं क्लस्टर (निस्पंदन)
22 क्लस्टर समूह विश्लेषण सूची से चयन क्लस्टर निकालें < निकालें--
23 क्लस्टर के लिए क्लस्टर विश्लेषण सूची बॉक्स जोड़ें चुनें-->
24 विश्लेषण में सभी घटनाओं के पारंपरिक हीटमैप बनाएं घटनाओं की हीटमैप
25 समूहों का चयन मार्कर द्वारा क्रमबद्ध करें सॉर्ट
26 चयन मार्कर द्वारा थ्रेशोल्ड सेट करें थ्रेशोल्ड
27 क्लस्टर से चयन क्लस्टर का पारंपरिक हीटमैप बनाएं सूची विश्लेषण क्लस्टर की हीटमैप
28 सॉर्ट का फ्लिप क्रम आरोही अवरोही/
29 सभी थ्रेशोल्ड साफ़ करें सभी थ्रेशोल्ड साफ़ करें
30 क्लस्टर के लिए आवृत्ति थ्रेशोल्ड सेट करें क्लस्टर आवृत्ति थ्रेशोल्ड (%)
31 ' क्लस्टर्स (निस्पंदन) ' सूची बॉक्स पर सक्रिय वर्तमान थ्रेसहोल्ड की सूचि थ्रेसहोल्ड
३२ उच्च आयामी बॉक्स प्लॉट उच्च आयामी बॉक्स प्लॉट
३३ उच्च आयामी प्रवाह भूखंड उच्च आयामी प्रवाह भूखंड
३४ पारंपरिक प्रवाह भूखंड के लिए क्षैतिज अक्ष पैरामीटर ना
३५ पारंपरिक प्रवाह प्लॉट के लिए अनुलंब अक्ष पैरामीटर ना
३६ क्षैतिज अक्ष पर पारंपरिक प्रवाह प्लॉट के लिए डेटा रूपांतरण ना
३७ अनुलंब अक्ष पर पारंपरिक प्रवाह प्लॉट के लिए डेटा ट्रांस्फ़ॉर्मेशन ना
३८ पारंपरिक फ्लो प्लॉट बनाएं पारंपरिक प्रवाह भूखंड
३९ विश्लेषण के लिए क्लस्टर्स दिखाएं ना

तालिका 1: ExCYT GUI में मौजूद सभी फ़ंक्शंस का ओवरव्यू

सॉफ्टवेयर का नाम/ ExCYT CYT FCS एक्सप्रेस flowCore openCyto FlowMeans
प्रोग्राम प्रकार Matlab Matlab स्टैंड-अलोन अनुप्रयोग आर आर आर
उपयोगकर्ता के लिए मूल्य मुफ्त मुफ्त $१,००० मुफ्त मुफ्त मुफ्त
ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस हाँ हाँ हाँ नहीं नहीं नहीं
आयामी कमी तकनीक टी-SNE टी-SNE, पीसीए टी SNE, पीसीए, कुदाल कोई कोई कोई
क्लस्टरिंग एल्गोरिदम कश्मीर का मतलब
DBSCAN
पदानुक्रम क्लस्टरिंग
स्व-संगठित मानचित्र
एकाधिक नेटवर्क ग्राफ आधारित तरीकों
GMM-EM
GMM-रूपांतरित Bayesian अनुमान		 कश्मीर का मतलब
GMM-EM
एकल नेटवर्क-ग्राफ़ आधारित पद्धति (Phenograph)		 कश्मीर का मतलब कोई मैनुअल गेटिंग कार्यप्रवाह का स्वचालन कश्मीर का मतलब
/फ़िल्टर समूहों को सॉर्ट करने की क्षमता हाँ नहीं नहीं नहीं नहीं नहीं
उच्च आयामी प्रवाह भूखंड हाँ नहीं नहीं नहीं नहीं नहीं

तालिका 2: सॉफ़्टवेयर-सहायतापूर्ण प्रवाह Cytometry विश्लेषण समाधानों का ओवरव्यू

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां हम ExCYT, एक उपंयास ग्राफिकल यूजर इंटरफेस MATLAB-आधारित एल्गोरिदम चलाने के लिए उच्च आयामी cytometry डेटा के विश्लेषण को कारगर बनाने, प्रोग्रामिंग में कोई पृष्ठभूमि के साथ व्यक्तियों की अनुमति के लिए उच्च आयामी डेटा में नवीनतम लागू विश्लेषण एल्गोरिदम । व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए इस सॉफ्टवेयर की उपलब्धता वैज्ञानिकों को एक सहज और सरल कार्यप्रवाह में उनके प्रवाह cytometry डेटा का पता लगाने के लिए अनुमति देगा । टी-SNE आयामी कमी के संचालन के माध्यम से, एक clustering विधि लागू करने, जल्दी से इन समूहों के माध्यम से/फ़िल्टर सॉर्ट करने में सक्षम किया जा रहा है, और लचीला, अनुकूलन योग्य heatmaps और उच्च आयामी प्रवाह/ अपने नमूनों में अद्वितीय रूप से परिभाषित उपजनसंख्याों को समझें लेकिन ऐसे विज़ुअलाइज़ेशन बना सकेंगे जो उनके सहकर्मियों द्वारा सहज और आसानी से समझे जाते हैं.

जबकि कार्यक्रम डेटा प्रकार (पारंपरिक प्रवाह cytometry बनाम मास cytometry) की एक किस्म से निपटने में लचीला है, वहां कार्यक्रम के इष्टतम उपयोगिता के लिए कुछ विचार कर रहे हैं । इनमें से सबसे पहले डेटा की गुणवत्ता के बारे में है, विशेष रूप से प्रवाह cytometry डेटा की । उचित मुआवजा और अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के संकल्प सर्वोपरि महत्व का है । खराब मुआवजा डेटा अनजाने में गलत सह मार्करों और समूहों है कि सच जैविक महत्व के नहीं है गठन के संघों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, यह बहुत उचित है कि इनपुट डेटा टी के साथ आगे बढ़ने से पहले ध्वनि की गुणवत्ता की है SNE विश्लेषण और आगे बहाव विश्लेषण । इसके अलावा, स्वचालित मुआवजा एल्गोरिथ्म का उपयोग ExCYT में लागू सभी चैनलों के लिए स्पष्ट एकल दाग की आवश्यकता है ताकि सही क्षतिपूर्ति मापदंडों की गणना करने के लिए ।

ExCYT के उपयोग के लिए एक और महत्वपूर्ण विचार है जब एक विश्लेषण में एकाधिक FCS फ़ाइलों को श्रेणीबद्ध (के रूप में इस पांडुलिपि में प्रदर्शित), वे सभी चैनलों में तुलनीय होना चाहिए । सबसे पहले, इसका मतलब है कि एक ही पैनल सभी नमूनों में इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है और सभी चैनलों में नमूनों के बीच कोई बहाव नहीं है कि. उदाहरण के लिए, यदि एक अलग दिन और FITC में दोनों दिनों पर cytometer की वोल्टेज पर दो नमूनों को पढ़ने के लिए थे, लेकिन अलग तरह से एक दिन एक थोड़ा स्थानांतरित सीडी 8 जनसंख्या में जिसके परिणामस्वरूप पर सेट किया गया था, एक अनुप्रवाह विश्लेषण में झूठी समूहों उत्पंन कर सकता है , के रूप में इस बदलाव साधन भिंनता के एक समारोह के रूप में उत्पंन किया गया था और जैविक महत्व के कारण नहीं है । जबकि ExCYT के भविष्य के संस्करणों को अपने एकल दाग के लिए नमूनों को सामान्य करने में सक्षम हो सकता है, इस बिंदु पर, सावधान विचार किया जाना चाहिए कि FCS फ़ाइलें ExCYT में आयात करने से पहले एक दूसरे से तुलना की जा सकती है ।

अंत में, clustering की प्रक्रिया है कि एक निरपेक्ष/ विभिन्न क्लस्टरिंग एल्गोरिथ्म और पैरामीटर्स भिन्न क्लस्टरिंग समाधान उत्पन्न कर सकते हैं । एल्गोरिथ्म के समाधान के लिए उपयुक्त है कि क्या उपयोगकर्ता के लिए क्लस्टरिंग समाधान के साथ जीव विज्ञान की उनकी समझ synthesizing द्वारा निर्धारित करने के लिए है । उदाहरण के लिए, जब ट्यूमर के प्रतिरक्षा वातावरण को समझने, एक macroscopic समूहों में रुचि हो सकती है (यानी, टी कोशिकाओं बनाम माइलॉयड कोशिकाओं बनाम बी कोशिकाओं) जबकि एक और macroscopic समूहों की उपआबादी में रुचि हो सकती है । क्लस्टर के संकल्प उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाता है और इसलिए, कोई एकल clustering समाधान ' सही है । यह उच्च आयामी प्रवाह ExCYT में उपलब्ध भूखंडों का उपयोग करने का मुख्य लाभ में से एक है । सभी चैनलों में दिए गए क्लस्टर के वितरण की कल्पना करने की क्षमता उपयोगकर्ता को यह निर्धारित करने में मदद कर सकती है कि क्या वे न केवल एक जैविक रूप से प्रासंगिक तरीके से हैं, लेकिन प्रयोग में पूछे जाने वाले वैज्ञानिक प्रश्न के लिए प्रासंगिक है । जबकि क्लस्टरिंग के अतिरिक्त तरीकों प्रदान करते हुए हमारे लक्ष्य के लिए साहित्य में प्रयोग किया जाता विधियों के ढेर सारे प्रदान करने के लिए cluster उच्च आयामी प्रवाह cytometry डेटा, हम अनुशंसा करते हैं जैसे k-means और DBSCAN के माध्यम से डेटा का पता लगाने के लिए तरीकों का उपयोग जल्दी से और अधिक मजबूत लेकिन अधिक समय लेने वाली दृष्टिकोण के लिए क्लस्टर संख्या और आकार और नेटवर्क ग्राफ और गाऊसी-मिश्रित मॉडल दृष्टिकोण की दिशा में कदम पर चलना ।

इन बातों को देखते हुए, ExCYT अभी भी उच्च आयामी cytometry डेटा की खोज के लिए एक अत्यंत लचीला और मूल्यवान उपकरण है, और अंय उपलब्ध संकुल के विश्लेषण के इस प्रकार के आचरण (2 तालिका) से अद्वितीय/ . सबसे पहले, ExCYT खुद को किसी भी पटकथा/प्रोग्रामिंग ज्ञान के बिना इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता से आयामी कमी और clustering एल्गोरिदम का उपयोग अधिकांश प्रवाह cytometry विश्लेषण दृष्टिकोण पर अंतर । इसके अतिरिक्त, पूरे साहित्य में उद्धृत कई clustering एल्गोरिदम को एकत्र करने से, हमें विश्वास है कि हम clustering डेटा के लिए सबसे विकल्प प्रदान करते हैं । अंत में, हमारे क्लस्टर निस्पंदन की अनूठी विशेषता और उपंयास उच्च आयामी प्रवाह भूखंडों के माध्यम से प्रदर्शन के साथ छंटाई, उपयोगकर्ताओं को अपने समूहों की विशेषताओं का पता लगाने के लिए जल्दी और कुशलता की अनुमति देता है, ' की खोज दुर्लभ प्रक्रिया बना उपलोकसंख्या सरल आणि कार्यक्षम आहे.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को कोई पावती नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desktop SuperMicro Custom Build Computer used to run analysis
MATLAB Mathworks N/A Software used to develop ExCYT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benoist, C., Hacohen, N. Flow cytometry, amped up. Science. 332 (6030), 677-678 (2011).
  2. Ornatsky, O., et al. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of immunological methods. 361 (1), 1-20 (2010).
  3. Tanner, S. D., et al. Flow cytometer with mass spectrometer detection for massively multiplexed single-cell biomarker assay. Pure and Applied Chemistry. 80 (12), 2627-2641 (2008).
  4. Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC immunology. 6 (1), 13 (2005).
  5. Brazma, A., Vilo, J. Gene expression data analysis. FEBS letters. 480 (1), 17-24 (2000).
  6. Pyne, S., et al. Automated high-dimensional flow cytometric data analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (21), 8519-8524 (2009).
  7. Ge, Y., Sealfon, S. C. flowPeaks: a fast unsupervised clustering for flow cytometry data via K-means and density peak finding. Bioinformatics. 28 (15), 2052-2058 (2012).
  8. Venkatesh, V. Determinants of perceived ease of use: Integrating control, intrinsic motivation, and emotion into the technology acceptance model. Information systems research. 11 (4), 342-365 (2000).
  9. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence spectral overlap compensation for any number of flow cytometry parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677 (1), 167-184 (1993).
  10. Lavin, Y., et al. Innate immune landscape in early lung adenocarcinoma by paired single-cell analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
  11. Chevrier, S., et al. An immune atlas of clear cell renal cell carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
  12. Hartigan, J. A., Wong, M. A. Algorithm AS 136: A k-means clustering algorithm. Journal of the Royal Statistical Society. Series C (Applied Statistics). 28 (1), 100-108 (1979).
  13. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Density-based spatial clustering of applications with noise. International Conference Knowledge Discovery and Data Mining. 240, (1996).
  14. Levine, J. H., et al. Data-driven phenotypic dissection of AML reveals progenitor-like cells that correlate with prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  15. Blondel, V. D., Guillaume, J. L., Lambiotte, R., Lefebvre, E. Fast unfolding of communities in large networks. Journal of statistical mechanics: theory and experiment. 2008 (10), P10008 (2008).
  16. Le Martelot, E., Hankin, C. Fast multi-scale detection of relevant communities in large-scale networks. The Computer Journal. 56 (9), 1136-1150 (2013).
  17. Newman, M. E. Fast algorithm for detecting community structure in networks. Physical review E. 69 (6), 066133 (2004).
  18. Hespanha, J. P. An efficient matlab algorithm for graph partitioning. , University of California. 1-8 (2004).
  19. Moon, T. K. The expectation-maximization algorithm. IEEE Signal processing. 13 (6), 47-60 (1996).
  20. Bishop, C. M. Pattern recognition and machine learning. , Springer. (2006).

Tags

कर्षण १४३ अंक प्रवाह Cytometry उच्च आयामी विश्लेषण टी SNE clustering हीट मैप्स आयामी कमी
ExCYT: उच्च आयामी Cytometry डेटा के विश्लेषण को व्यवस्थित करने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sidhom, J. W., Theodros, D., Murter, … More

Sidhom, J. W., Theodros, D., Murter, B., Zarif, J. C., Ganguly, S., Pardoll, D. M., Baras, A. ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data. J. Vis. Exp. (143), e57473, doi:10.3791/57473 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter