Summary
Kuga et al. ontdekt dat fosforylatie-status specifieke antilichamen tegen de actine bindende eiwit girdin phosphorylated op tyrosine 1798 (pY1798) kunnen worden gebruikt om het label tuft cellen (TCs). Dit protocol staat robuuste visualisatie van televisiecamerasystemen gebruik immunefluorescentie verkleuring van de vrij zwevende jejunum cryosecties met pY1798 antilichamen.
Abstract
De actine bindende eiwit girdin is een cytosolische eiwit dat is vereist voor actine remodelleren te activeren cel migratie in verschillende weefsels. Girdin is phosphorylated door zowel de receptor en de niet-receptor tyrosine kinases bij tyrosine 1798. Omori et al. ontwikkelde site- en fosforylering status-specifieke antilichamen tegen menselijke girdin op tyrosine-1798 (pY1798), dat specifiek aan gefosforyleerd tyrosine-1798, maar niet aan unphosphorylated tyrosine-1798 bindt. pY1798 antilichamen zijn gebruikt om een specifiek label tuft cellen (TCs) die in zoogdieren gastro-intestinale weefsels aanwezig zijn, maar de functie van deze cellen is onduidelijk. Dit protocol staat toe de robuuste visualisatie van televisiecamerasystemen in het jejunum met behulp van pY1798 antilichamen en immunofluorescentie. Om succesvol en eenvoudige TC visualisatie, dit protocol omvat twee histologische technieken: productie van vrij zwevende cryosecties van gelatine gevulde jejunum weefsel, en lage temperatuur antigeen ophalen bij 50 ° C gedurende 3 h. vullen het jejunum met gelatine handhaaft de vorm van vrij zwevende secties gedurende de hele procedure kleuring, overwegende dat de lage temperatuur antigeen ophalen zorgt voor een robuuste signalen van TCs. succesvol gebruik van dit protocol resulteert in pY1798 kleuring van televisiecamerasystemen gedistribueerd vanuit villosités tip om crypt. Gekleurd TCs hebben een spool-vormige soma en fluorescerende signalen condenseren op het puntje van lumenal, die overeenkomt met de uitstekende 'tuft.' Phalloidin kleuring colocalized met pY1798-positieve TCs aan de grens van de verdikte borstel, en komt overeen met een worteltje massa zich uitstrekt van de TC-tuft. Dit protocol kan worden gebruikt om de TCs onderzoeken in menselijke biopsie monsters die met gastro-intestinale endoscopen. Bovendien, TCs werden onlangs gemeld te accumuleren na parasiet infectie bij muizen, suggereren dat dit protocol toepassingen voor diagnose van parasitaire infecties in de menselijke darm zou kunnen hebben.
Introduction
Tuft cellen (TCs) zijn kleine verspreide onderdelen van gastro-intestinaal epitheel, die worden gekenmerkt door apicale bosjes en spool-vormige Soma1. Hoewel TCs voor het eerst in 19562 beschreven werden, blijft TC functie onduidelijk, deels te wijten aan een gebrek aan betrouwbare TC markeringen.
Enomoto et al. eerst gekenmerkt de actine-bindend-proteïne girdin3, die wordt uitgedrukt in het zenuwstelsel, maar ook in niet-zenuwweefsel zoals bloedvaten, hartkleppen, pezen en skeletspieren4. Muizen met genetische ablatie van girdin weergegeven groei retardatie en meerdere hersenen anomalieën4,5,6. Ondertussen is de verlies-of-function mutatie in menselijke girdin geassocieerd met progressieve encefalopathie, ernstige retardatie en vroege begin epileptische aanvallen7.
In 2011, Lin et al. geïdentificeerd dynamische fosforylering van de girdin op tyrosine 1798 gemedieerd door tyrosine kinases zoals EGFR en Src8. Ze toonde ook aan dat gefosforyleerd girdin vereist is voor het actine remodelleren te activeren cel migratie8. Omori et al. ontwikkelde site - en fosforylering status-specifieke antilichamen tegen menselijke girdin phosphorylated op tyrosine 1798 (pY1798 antilichamen) volgens de Goto protocol, en de antilichamen plaats-geleide mutagenese voor gebruik gevalideerd expressie vectoren vervoeren full-length girdin9,10. In 2017, Kuga et al. gemeld dat pY1798 etiketten TCs met hoge specificiteit en hoge gevoeligheid1. De pY1798-antistoffen bleken te zijn superieur aan vorige TC markeringen op basis van uitstekende kleuring eigenschappen waaruit bleek de hele cel-shape, inclusief het kenmerk 'tuft' op de lumenal tip, nog de biologische rol van girdin en phospho-girdin in TC functie bleef onduidelijk1.
Bij deze methode beschreven in deze studie wordt immunofluorescentie kleuring, een histologische techniek ter gelegenheid van een specifieke proteïne op weefsel met behulp van een primair antilichaam tegen een eiwit-doelstelling en een fluorescentie-geconjugeerde secundair antilichaam tegen de primaire antilichaam. Het doel van deze methode is dat onderzoekers met weinig histologische ervaring te verkrijgen van de TC-afbeeldingen van hoge kwaliteit. Dit protocol maakt gebruik van zwevende cryosecties die voorkomen naar de nood voor dia gemonteerde cryosecties of paraffine sectie. Echter vrij zwevende secties zijn kwetsbaar als gevolg van het ontbreken van steun van een glasplaatje en de dikte van de sectie antilichaam permeabiliteit kan verminderen. Dit protocol omvat twee benaderingen die overwinnen van deze problemen: 1) vullen de hele jejunum lumen met gelatine voor het behoud van de morfologie van de vrij zwevende secties gedurende de kleuring procedures, en 2) het gebruik van lage-temperatuur antigeen ophalen te pY1798 signalen te intensiveren.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door het Animal Care en gebruik Comité van het Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center (nummer van de aanvraag: M-03).
1. voorbereiding
- 10 L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bereiden: 32.27 g nb2HPO4·12H,2O, 4.5 g van NaH2PO4·2H2O, 80.0 g NaCl toegevoegd aan ultrazuiver water tot een eindvolume van 10 L. Store oplossing bij kamertemperatuur (RT).
- 200 mL PBS-T: 200 mL PBS uit stap 1.1 met 100 µL van polyoxyethylene(10) octylphenyl ether om een eindconcentratie van 0,05% (vol:vol) voor te bereiden. Winkel op RT.
- Terwijl het dragen van handschoenen en oogbescherming, bereiden 50 mL 15 gewichtspercenten sacharose in 10% gebufferd neutrale formaline-oplossing: 7,5 g van sacharose toegevoegd aan 10% gebufferd neutrale formaline-oplossing (Tabel of Materials) tot een eindvolume van 50 mL. Winkel op RT.
Let op: Inademing en/of huid/oog contact met formaldehyde in 10% gebufferd neutrale formaline oplossing gevaarlijk kan zijn. Met de nodige voorzichtigheid behandelen. - Bereiden van 1,5 mL van 200 eenheden/mL phalloidin-belichting fluorescerende kleurstof geconjugeerde stockoplossing: phalloidin-belichting fluorescerende kleurstof geconjugeerde (300 eenheden in 1 flacon, gelyofiliseerd vaste stoffen, excitatie en emissie golflengtes: 581 nm en 609 nm, respectievelijk) geschorst in 1,5 mL methanol. Winkel oplossing in het donker bij-20 ° C.
- Bereiden 5 mg / mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) stockoplossing: 10 mg DAPI in 2 mL zuiver N, N-dimethylformamide (DMF). Winkel oplossing in het donker bij-20 ° C.
- Bereiden van 5% bovien serumalbumine (BSA) in PBS: 0.5 g van BSA, 10 mL PBS. Bewaren bij 4 ° C.
- Verwijder de schuine tip van een 18-gauge rechte naald met behulp van een nipper en het nipped einde met een pincher knijpen in een in de lengte richting om vloeistof stroom door de naald lumen (figuur 1A-1).
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
2. dierlijke dissectie en isolatie van Jejunum
- Perfusie fixatie van een muis
- Draag handschoenen en werken in een goed geventileerde plaats.
- Bereiden van een bekerglas van 100 mL glas, 10% gebufferd neutrale formaline-oplossing, chirurgische instrumenten (schaar, pincet), een metalen dienblad, 6-0 nylon gesneden hechtingen, een rechte naald van 18-gauge bereid zoals in 1.7, een 22-gauge gevleugelde naald, een 20-mL spuit.
- Laden van 20 mL 10% gebufferd neutrale formaline-oplossing van het bekerglas glas in de 20 mL spuit, en de gevleugelde naald van 22-gauge hechten aan het stopcontact.
- Bereid vloeibare gelatine door toevoeging van 1 g gelatine poeder aan 20 mL PBS (laatste 5% gelatine) in een centrifugebuis van 50 mL. Na het inweken op RT gedurende 15 minuten, Incubeer bij 50 ° C in een bad van water gedurende 15 minuten zonder schudden.
- Kort vortex, en Incubeer bij 50 ° C voor een ander 15 min te ontbinden volledig de gelatine. Verlaat de buis bij RT tot gebruik.
- Een volwassen muis door cervicale dislocatie euthanaseren.
- Plaats de muis vanaf stap 2.1.6 op een metalen dienblad en zorg van een kleine incisie op de huid via de ensiform kraakbeen met behulp van chirurgische gereedschappen.
- Vouw de incisie met beide handen om de borst- en buikholte regio's bloot te stellen.
- Open het buikvlies blootstellen van het middenrif, en open vervolgens het middenrif aan beide zijden.
- Knippen van de thoracale kooi in de anterieure axillaire lijn aan beide zijden, en vervolgens de thoracale muur verwijderen door te snijden in een dwarsrichting op de positie van de thymus het hart bloot te stellen.
- Maak een kleine incisie op de oorschelp met het juiste atrium een gevleugelde naald van 22-gauge invoegen de apex van de linkerventrikel te afvoer van het bloed. Duw de zuiger om te perfuse van de weefsels met 10% gebufferd neutrale formaline-oplossing.
- Na bloot organen in het bekken, afgesneden van het einde van de endeldarm van de anus en de darmen scheiden van het lichaam door het snijden van het mesenterium.
- Snijd de darmen op 4 cm van de anale kant van de maag antrum isoleren het jejunum. Gooi de anale helft van de resterende dunne darm.
- Clip het jejunum doormidden te vergemakkelijken de afboekingsmethode procedure. Belasting 20 mL 10% gebufferd neutrale formaline-oplossing in de 20 mL spuit, en bevestig de 18-gauge rechte naald bereid in stap 1.7 aan de uitlaat.
- Injecteren van 10% gebufferd neutrale formaline-oplossing van het ene eind van de geknipte jejunum te spoelen van de intestinale inhoud en de darm lumen oppervlak (figuur 1A2) vast te stellen.
- Wassen het lumen van de darm door het injecteren van PBS, zoals beschreven in stap 2.1.15.
- Spoel vloeibare gelatine in het lumen van de darm zoals beschreven in stap 2.1.15 ter vervanging van PBS met vloeibare gelatine.
- Sluit één uiteinde van de geknipte jejunum door hechtdraad afbinding met behulp van een nylon 6-0 knippen hechtdraad, vul het jejunum met vloeibare gelatine en sluit het andere uiteinde door hechtdraad afbinding (figuur 1A-3).
- Voeg vier hechtdraad knopen te passen een worst-vormige jejunum sectie aan het depressief gedeelte van een cryomold (figuur 1A4).
Opmerking: Voor cryomolds met een 20 x 25 mm x 5 mm depressief sectie, een sectie van de worst-achtige jejunum ~ 20 mm is beter. - Geniet van de weefsels in 50 mL 15 gewichtspercenten sacharose in 10% gebufferd neutrale formaline oplossing 's nachts bij 4 ° C.
Opmerking: Deze stappen zorgen voor cryoprotection door sucrose en eiwit fixatie door formaline van gelatine en weefsel. Formaline-gelatinized gelatine doet niet smelt bij RT, overwegende dat niet-vaste gelatinized gelatine bij 4 ° C bij RT. smelt
3. Duw de bevriezing van gelatine gevulde Jejunum weefsels
- Door het snijden van het jejunum bij de knopen van de hechtdraad, worden drie worst-achtige jejunum stukken met beide uiteinden afgebonden verkregen (figuur 1A4). Hiermee lijnt u de worst-achtige stukken in een cryomold voor toevoeging van inbedding samengestelde voorbereiding van bevroren weefsel specimens.
- Module bevriezen de cryomold in tolueen gekoeld met vloeibare stikstof. Winkel cryomolds bij-80 ° C
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
4. immunofluorescentie van Tuft cellen met behulp van vrij zwevende cryosecties
- Cryosectioning
- Instellen van zowel de cryostaat kamer temperatuur (CT) als het object temperatuur (OT) tot-22 ° C. Plaats het bevroren weefsel blokkeren in een cryomold in de zaal van de cryostaat gedurende ten minste 15 minuten.
- Voeg 3 mL PBS aan een 35-mm cultuur schotel.
- Verwijder het bevroren weefsel blok uit de cryomold en snijd het blok doormidden met een scheermesje bloot het transversale gedeelte van het jejunum. Mount een helft van het blok op een chuck (een adapter van de cryostaat) deel van het knipvlak uit met het scheermesje.
- Sectie de gelatine gevulde jejunum in 30 µm dik secties. Gebruik bevroren pincet voorzichtig de overdracht van de secties in de cultuur van de 35-mm schotel bereid in stap 4.1.2 (figuur 2Brechts).
- Toepassing van primaire antilichamen
- Wassen van de vrij zwevende secties in de cultuur van de 35-mm schotel 3 keer voor 5 minuten, elk met 3 mL PBS-T met milde schudden op een wederzijdse shaker (ongeveer 36 keer / min).
- Bereiden van de oplossing van de gegevensherwinning van antigeen: 0.3 mL antigeen herwinning oplossing concentraat (Tabel van materialen) in 2,7 mL ultrazuiver water. Voeg 3 mL van de oplossing van de gegevensherwinning van antigeen aan de 35-mm cultuur schotel met zwevende secties.
- Sluit het deksel, verzegelen van de kloof tussen de schotel en het deksel met een strook van vinyl tape en Incubeer bij 50 ° C in een kruising incubator voor 3U zonder schudden.
- Verwijder de schotel uit de incubator en cool op RT voor 20 min. Wassen na het verwijderen van de vinyl tape, de secties 3 keer voor 5 minuten elk met 3 mL PBS-T en milde schudden.
- De PBS-T gecombineerd en 5 druppels van blokkerende oplossing (Tabel of Materials) op de secties toevoegen. Incubeer bij RT gedurende 5 min met milde schudden.
- Bereid de oplossing primair antilichaam: 495 µL van 5% BSA in PBS met 5 µL van phospho-Y1798 girdin (pY1798) antistoffen (Tabel van materialen). Voeg 500 µL van primair antilichaam oplossing op de secties (de blokkerende oplossing hoeft niet te worden verwijderd).
- Plaats de schotel in een bevochtigde incubatie kamer en na een nacht bebroeden bij 4 ° C, met milde schudden.
Opmerking: De overnachting incubatie kan worden uitgebreid tot maximaal drie nachten.
- Toepassing van secundaire antilichamen
- Wassen van de secties 3 keer gedurende 5 min. elk in 3 mL van PBS-T met milde schudden.
- Bereiden van verdunde DAPI stockoplossing: 2 µL van DAPI stockoplossing (stap 1.5), 998 µL van PBS.
- Secundair antilichaam oplossing: 476 µL van 5% BSA in PBS, 10.5 µL van verdunde oplossing van de DAPI, 12,5 µL van phalloidin-belichting fluorescerende kleurstof geconjugeerde stockoplossing, 1 µL van geit anti-konijn IgG-belichting fluorescerende kleurstof geconjugeerde (golflengte: excitatie 496 nm, emissie 520 nm).
- Na aspirating de PBS-T, breng de oplossing secundair antilichaam en broeden in een ruimte van de licht-afgeschermd incubatie bij RT voor 30 min met milde schudden.
- Wassen van de secties 3 keer voor 5 minuten elk met 3 mL PBS-T en milde schudden.
- Na de definitieve wash, verwijder de PBS-T en vervang door 3 mL PBS polyoxyethylene(10) octylphenyl ether ontbreekt. De schotel overbrengen in een stereoscopische Microscoop.
- Plaats 200 µL van PBS in een druppel in het midden van een sectie van de MAS-gecoate witglazen dia en overdracht de één jejunum uit de schotel in de druppel met behulp van een P200 Pipetteer tip.
- Na het aanpassen van de sectie Uitlijning onder de stereoscopische Microscoop, gecombineerd alle resterende PBS rond de sectie.
- Voeg 20 µL van waterige montage media en een 20 x 20 mm dekglaasje aan bovenop de media plaats.
- Onmiddellijk zegel het dekglaasje aan randen met montage xyleen gebaseerde media. Plaats van de dia op een houten mappe en laat de montage xyleen gebaseerde media om te stollen bij RT gedurende 2-3 uur.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Na de montage xyleen gebaseerde media stolt, kunnen de dia's 2-3 weken worden opgeslagen in een dia licht afgeschermd vak RT.
5. confocale microscopie
- Onderdompeling olie zetten de 63 X-doelstelling van een confocal microscoop. Het dekglaasje aan-dia zet en de dia in het werkgebied te plaatsen.
- Digitaliseren van de beelden van de TC verworven op laser golflengten 405, 488 en 555 nm, en de afbeeldingen opslaan in TIFF-indeling (.tiff).
Opmerking: Een detectie filter set kiezen die geschikt is voor de fluorescentie kleurstoffen (dat wil zeggen, excitatie/emissie maxima: 358/461 nm, 490/525 en 590/617).
Representative Results
Gelatine-vullen van het jejunum
Een typische procedure voor het invullen van muis jejunum met gelatine wordt getoond (figuur 1A), aangezien de voordelen zijn van gelatine-vulling (figuur 1B). Kortom, werd de schuine punt van een rechte naald 18-gauge verwijderd om te beschermen tegen de darmwand (figuur 1A1) piercing. Gelatine vullen tot stand gekomen met behulp van 10% gebufferd neutrale formaline oplossing geïnjecteerd van het ene einde van een sectie van de geknipte jejunum te spoelen van de darm en de darm lumen oppervlak (figuur 1A2) vast te stellen vóór vullen met vloeibare gelatine ( ) Figuur 1A3). De resulterende worst-achtige stukken (figuur 1A4) waren ingesloten, bevroren, en dwars gesegmenteerd in 30 µm-dikke plakjes in een cryostaat. Bij het ontbreken van gelatine vullen, meestal jejunal secties kink, waardoor de villi te zwaaien achteruit (figuur 1Blinks). Gelatine vullen behoudt de ronde schijf-vorm van de secties en onderhoudt rechtop positionering van de villi (figuur 1Brechts). De beelden duidelijk het voordeel geboden door gelatine in het behoud van de morfologie van de vrij zwevende jejunum secties te vullen.
Succesvolle beeldvorming van intestinale tuft cellen
pY1798 antilichamen kunnen worden toegepast voor de variabele immunokleuring technieken, met inbegrip van dot bevlekken, westelijke bevlekken, paraffine sectie kleuring, dooi gemonteerde cryosection vlekken of zwevende cryosection kleuring van1,9. In dit protocol, zijn we gericht op vrij-zwevende cryosecties voor fluorescentie kleuring van televisiecamerasystemen in muis jejunum met behulp van pY1798 antilichamen, phalloidin en DAPI kleuring om aan te tonen van de structurele kenmerken van TCs1. In het algemeen, zijn TCs verspreid met een snelheid van ongeveer één TC/100 epitheliale cellen van villosités tip aan crypt1. De representatieve resultaten tonen aan dat pY1798 reproducibly bakent hele TCs, met inbegrip van het membraan, het cytoplasma van de spool-vormige soma, en de sterk gekleurd lumenal tip, waarbij condensatie van robuuste signaal overeenkomt met de uitstekende 'plukje' een TC1 (Figuur 2A-2B). Ondertussen, phalloidin is een phallotoxin, een familie van giftige bicyclische heptapeptides van de paddestoel Amanita phalloides, en heeft hoge affiniteit voor filamenteuze actine (F-actine), die is aanwezig in de microvilli die vormen van de intestinale brush border 11. Phalloidin reproducibly en opvallend markeert de verdikte borstel rand die correspondeert met een massa van worteltjes zich uitstrekt van de tuft1. Aldus, de consistente co lokalisatie van pY1798 signalen (spool-vormige soma, signaal condensatie aan het lumenal uiteinde) met de opvallend verdikte phalloidin-positieve borstel rand toont dat dit protocol met succes TCs ongeacht identificeert of ze zijn gelegen op een villosités ()figuur 2A) of in een crypte ()figuur 2B).
Lage-temperatuur antigeen ophalen is effectief voor zwevende secties kleuring
Warmte gebaseerde antigeen ophalen bij 95-99 ° C wordt veel gebruikt voor analyse van paraffine secties en dia gemonteerde cryosecties. Toepassing van deze aanpak op de vrij zwevende afdelingen zonder schade is echter moeilijk omdat deze secties zijn over het algemeen kwetsbaarder dan dia gemonteerde secties die worden ondersteund door de dia12. Sinds de lage temperatuur antigeen ophalen (50 ° C gedurende 3 uur) met behulp van een waterbad beïnvloedde niet de morfologie van de vrij zwevende jejunum secties in voorbereidende experimenten, we geëvalueerd de objectieve effectiviteit van antigeen ophalen in een blinde test, die statistisch bevestigd dat de effectiviteit van lage-temperatuur antigeen ophalen ()Figuur 3).
Figuur 1: Vullen van de gelatine van jejunum secties voor morfologische behoud van cryosecties
(A) foto's van de procedures voor de intraluminale vullingsgraad muis jejunum met gelatine. (A1) De schuine punt van een rechte naald 18-gauge werd verwijderd om te voorkomen dat de darmwand piercing. (A2) Gebufferde neutrale formaline-oplossing (10%) werd geïnjecteerd in één uiteinde van de geknipte jejunum leegmaken van de intestinale inhoud en repareren van de darm lumen oppervlak. (A3) Geknipte jejunum gevuld met vloeibare gelatine en beide uiteinden afgebonden met behulp van een 6-0 nylon hechtdraad (zwarte pijlen). (A4) Vier meer hechtdraad knopen (witte pijlen) geplaatst tussen de reeds bestaande hechtdraad knopen (zwarte pijlen) leverde drie kortere stukken. Het weefsel wordt vervolgens gescheiden in drie worst-achtige stukken op de twee opgegeven posities (witte pijlpunten). (B) gunstige effecten van gelatine-vulling op vrij-zwevende cryosection morfologie. Zonder gelatine vullen neiging secties om kink, waardoor de villi te gemakkelijk zwaaien achteruit (links); met gelatine vulling, een 30 µm dik sectie onderhoudt de vorm van een schijf en de verticale positie van de villi is bewaard gebleven (rechts). Beelden werden gefotografeerd met behulp van Nomarski differentiële interferentie contrast. Bars, 1 mm. schaal Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Vertegenwoordiger fluorescentie beelden van muis intestinale tuft cellen
Confocale fluorescentie beelden van TCs op een villosités (A) of in een crypte (B), in vrij zwevende muis jejunum secties gekleurd met sitespecifiek en fosforylering-status-specifieke antistoffen tegen girdin phosphorylated op tyrosine 1798) pY1798, groen, optimale excitatie/emissie golflengten 490/525 nm), phalloidin (rood, 590/617 nm), 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blauw, 358/461 nm). Het gebied omsloten door de witte vakken in de lage vergroting beelden (schaal balken, 50 µm) wordt uitgebreid aan de rechterkant (schaal balken, 10 µm). pY1798 antilichamen vlek reproducibly TCs, ongeacht de locatie (op een villosités (A)of in een crypte (B)), met het bijwonen van de lumenal tip (pijlen), membraan, en het cytoplasma van het soma TC spool-vormige kleuring. Een opvallend verdikte borstel rand in phalloidin kleuring (pijlpunten) is een ander onderscheidend teken van TCs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Lage-temperatuur antigeen ophalen verbetert pY1798 immunofluorescentie
Twee groepen van experimentele procedures werden vergeleken om te bevestigen de effectiviteit van lage-temperatuur antigeen ophalen. Vrij zwevende jejunum secties (30 µm dik, n = 13) van een enkele diepgevroren blok werden verdeeld in twee groepen, en secties uit elke groep waren bevlekt het volledige protocol volgen of hetzelfde protocol ontbreekt lage temperatuur antigeen ophalen (stap 4.2.2). Na kleuring, secties waren gemonteerd op afzonderlijke dia's die voorzien zijn van een groep getallen en de etikettering op elke dia was bedekt met plakband. Alle dia's werden geschud, voorzien van nieuwe nummers op de tape en waargenomen onder fluorescentie microscopie door middel van een FITC-filter. Totale graven van zichtbare pY1798-positieve TCs werden gemiddeld in elke groep, en werden weergegeven in een staafdiagram (gemiddelde ± standaardafwijking). Een tweezijdige t-test werd uitgevoerd om te vergelijken van de gemiddelde graven tussen de twee groepen. P-waarden onder de 0,05 werden beschouwd als statistisch significant. Lage-temperatuur antigeen ophalen aanzienlijk verbeterd de effectiviteit van pY1798-immunofluorescentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit protocol werd ontworpen om onderzoekers zonder histologie ervaring om betrouwbare beelden van tuft cellen (TCs). Dit protocol heeft drie kritieke punten: 1) het gebruik van site- en fosforylering status-specifieke konijn polyclonal antilichamen tegen menselijke girdin phosphorylated op tyrosine 1798 (pY1798 antilichamen) die zijn verkregen van een bepaald bedrijf ( Immuno-Biological laboratoria = bedrijf X); 2) gelatine vullen van het jejunum; en 3) lage temperatuur antigeen ophalen. In de breedste zin, fosforylatie status-specifieke antilichamen kunnen worden gecategoriseerd als wijziging-specifieke antilichamen die herkennen van een specifiek type van posttranslationele wijziging (b.v. acetylation, methylering of fosforylatie) van een eiwit op een specifiek aminozuur residu. Omori et al. en bedrijf X gezamenlijk pY1798 antilichamen die worden gegenereerd door het immuniseren van konijnen met gefosforyleerd peptide en zuiveren van de resulterende antilichamen solid-phase chromatografie met een unphosphorylated peptide na de Goto methode9, 10. pY1798 antilichamen werden intensief gevalideerd met in vitro fosforylatie testen met behulp van full-length menselijke girdin expressievectoren met/zonder een punt mutatie bij tyrosine 17989. Kuga et al. vond vervolgens dat pY1798 antilichamen van bedrijf X een specifieke en gevoelige marker van intestinale TCs1 zijn. Opneming van pY1798 antilichamen van bedrijf X is dus een kritisch punt in dit protocol.
Gelatine bevat collageen geëxtraheerd uit dierlijke weefsels en heeft lange tijd gebruikt om het insluiten van weefsel monsters voor histochemische studies met cryosecties13. Low-smeltpunt gelatine, die is gelatinized bij 4 ° C, maar smelt bij kamertemperatuur, begon te worden toegepast om te voorkomen dat nadelige gevolgen van hitte nodig om te handhaven de gelatine in een vloeibare staat tijdens het insluiten van14. In dit protocol, werd lage-smeltpunt gelatine gemaakt van gelatine poeder dat gelatinizes bij 4 ° C en smelt bij RT gebruikt voor het behoud van de morfologie van transversale cryosecties van muis jejunum. Wanneer deze gelatine gewend was volledig vullen het jejunum, werden monsters vervolgens formaline-vaste tot onomkeerbare gelatinization. Warmte-geïnduceerde antigeen ophalen is een effectieve methode om antigenen die worden gemaskeerd door aldehyde-bevattende fixatives12bloot te stellen. Echter, de hoge temperaturen (95-99 ° C gedurende 30 minuten), meestal gebruikt voor analyse van paraffine secties kunnen schade aan de morfologie van de complexe weefsel/gelatine. Hier hebben we gebruikt lage temperatuur antigeen ophalen (50 ° C gedurende 3 uur), waarmee zowel de herwinning van het antigeen en de instandhouding van weefsel morfologie.
pY1798 antistoffen kunnen etiketteren TCs in muis jejunum, maar ook in meerdere organen (maag, ileum, dikke darm en galblaas) uit muizen en mensen1. Echter, omdat pY1798 signalen in nietgefixeerde weefsels van elk weefsel zal snel worden afgebroken, dit protocol omvat formaline injectie in het jejunum lumen (stap 2.1.15., figuur 1A2).
Er zijn beperkingen die zijn gekoppeld aan de dikte van de vrij zwevende cryosecties. Hoewel dunne cryosecties kan nuttig zijn in termen van translucentie voor microscopie, maakt de dunheid deze secties fysiek kwetsbaar. In tegenstelling, dikke cryosecties zijn fysiek stevig, maar hebben lagere antilichaam permeabiliteit in de sectie. In dit protocol, 30 µm dik secties werden gebruikt die waren zowel fysiek stabiel en luchtdoorlatend antilichamen. Hoewel deze methode was bedoeld voor onderzoekers zonder uitgebreide ervaring in de histologie, mocht het protocol uitvallen, afdelingen soortgelijk aan die gebruikt door Kuga et al. pY1798/villin/DAPI triple kleuring van paraffine uitgevoerd1zouden zijn. Paraffine secties werden niet hier gebruikt om te voorkomen dat de moeilijkheden in verband met phalloidin kleuring van F-actine in paraffine secties.
Als gevolg van de instandhouding van aminozuur sequenties grenzend aan de girdin van tyrosine-1798, kunnen pY1798 antilichamen worden toegepast om vlekken van TCs in andere soorten dan muis, rat en mens. Het vullen van de gelatine in dit protocol gebruikt kan ook worden toegepast voor andere holle organen. Inderdaad, afgezien van pY1798 of TC, de combinatie van gelatine vullen met lage temperatuur antigeen ophalen kan nuttig zijn voor het openbaren van notoir "moeilijke" epitopes in de darm van de muis, en dientengevolge van belang voor veel onderzoekers kan zijn.
De biologische rol van girdin en de betekenis van haar fosforylatie in TCs is onduidelijk. Echter, een studie van Lin et al. voorgesteld dat tyrosine fosforylering van de girdin is gekoppeld aan de mate van F-actine polymerisatie8. Ondertussen, Kuga et al. vond dat dodelijke doses van apoptosis inductoren (bv., cisplatine, Röntgen straling) veroorzaakt een grote toename in de relatieve frequentie van televisiecamerasystemen in de muis dunne darm, die zij veronderstelde kan worden geassocieerd met de mogelijke conversie van de enterocyten naar TCs, in synchronisatie met de fosforylering van de girdin in de microvilli1. Deze mogelijkheid vergt extra onderzoek in de toekomst. Drie groepen onlangs waargenomen snelle toename in frequentie van de TC na parasiet infectie15,16,17. Dus deze vrij zwevende kleuring kan worden gebruikt, niet alleen voor het analyseren van de menselijke darm endoscopically verzamelde weefsels, maar TC accumulatie zou ook helpen bij de diagnose van parasiet infectie in de menselijke darm.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Naoya Asai aan de Universiteit van Nagoya voor het verstrekken van nuttige suggesties voor de ontwikkeling van lage-temperatuur antigeen ophalen voor vrij zwevende jejunum secties. Dit werk werd gesteund door de Grants-in-Aid voor Scientific Research (KAKENHI) (C) in 2012 (JP25460493) en (B) in 2017 (JP17H04065) van de Japan Society voor de promotie van de wetenschap (JSPS), A-stap verleent in 2014 (AS251Z02522Q) en in 2015 (AS262Z00715Q) van de Japan wetenschap en technologie Agentschap (BJS), en een visionair Takeda onderzoek subsidie 2014 van de Takeda Science Foundation (te M.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slc:DDY 6-week-old female mice | Chubu Kagaku Shizai | Not applicable | |
| Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) | Wako | 196-02835 | |
| Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O | Wako | 199-02825 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
| Triton X-100, Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether | Katayama Chemical | Not applicable | |
| Sucrose | Wako | 190-00013 | |
| 10% buffered neutral formalin solution | Muto Chemical | 20215 | Step 1.3. |
| Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
| Methanol | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| N.N-dimethylformamide (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-10G | |
| 18-gauge stainless steel straight needle | Terumo | NN-1838R | |
| U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun | Kono Seisakusho | Not applicable | |
| 22-gauge winged needle | Terumo | SV-22DLK | |
| 20 mL TERUMO syringe | Terumo | SS-20ES | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 15 mL Iwaki centrifuge tubes | Iwaki | 2325-015 | |
| 1.5 mL micro test tube | Star | RSV-MTT1.5 | |
| Gelatin powder, Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
| Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece | Sakura FineTech | 4583 | |
| Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
| Isopentane | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
| Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
| Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2. |
| Protein Block | Dako | X0909 | Blocking solution in 4.2.5. |
| Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6. |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
| Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy | Merck Millipore | 107961 | |
| MAS-coated slide glass white | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
| Wooden Mappe KO-type | Shoei Work's | 99-40007 | |
| Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml | Zeiss | 444960 | |
| Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
| Ultrapure water production system | Advantec | GS-590 | |
| Plastic glove, Star Nitrile Glove | Star | RSU-NGVM | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1950 | |
| Deep freezer, SANYO Ultra Low | Sanyo | MDF-382 | |
| Showcase refrigerator | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
| Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) | Taitec | 0068750-000 | |
| Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) | Taitec | HB-100 | |
| Incubation chamber for immunostaining | Cosmo Bio | 10DO | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) | Taitec | NR-1 | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
| Stereoscopic microscope (for tissue handling) | Olympus | SZ61 | |
| Stereoscopic microscope (for Figure 1B) | Leica Microsystems | M165FC | |
| Fluorescence microscope (for Figure 3) | Nikon | E800 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Kuga, D., et al. Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut. J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).
- Jarvi, O., Keyrilainen, O. On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren. Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).
- Enomoto, A., et al. Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE. Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).
- Asai, M., et al. Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage. Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).
- Kitamura, T., et al. Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin. Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).
- Wang, Y., et al. Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain. J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).
- Nahorski, M. S., et al. CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse. Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).
- Lin, C., et al. Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration. Science signaling. 4 (192), ra64 (2011).
- Omori, K., et al. Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration. Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).
- Goto, H., Inagaki, M. Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody. Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue. J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).
- Ushida, K. Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections. Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
