Summary
Kuga et al. обнаружил, что фосфорилирования статус специфических антител против актина связывания белка girdin фосфорилированных в тирозин 1798 (pY1798) может использоваться для обозначения клок клетки (TCs). Этот протокол позволяет надежная визуализация TCs с помощью immunofluorescent окрашивание свободно плавающего тощей кишки cryosections с pY1798 антител.
Abstract
Актина связывания белка girdin — цитозольной белок, необходимый для актина реконструкции для запуска миграции клеток в различных тканях. Girdin фосфорилированных рецепторов и не рецепторов тирозин киназ в тирозин 1798. Омори et al. разработали сайт - и фосфорилирование статус-антитела против человека girdin в тирозин-1798 (pY1798), которые специально связывают фосфорилированных тирозин-1798, но не unphosphorylated тирозин-1798. pY1798 антитела были использованы для специально ярлык клок клетки (TCs), которые присутствуют в желудочно-кишечном тканей млекопитающих, но функция этих клеток является неясным. Этот протокол позволяет надежной визуализации TCs в тощей кишки, с помощью pY1798 антител и иммунофлюоресценции. Для обеспечения успешной и простой визуализации TC, этот протокол включает две Гистологические техники: производство свободно плавающего cryosections из ткани желатином заполнены тощей кишки и антиген низкотемпературного извлечения при 50 ° C для 3 h. Заполнение тощей кишки с желатин сохраняет форму свободно плавающего секции на протяжении всей процедуры окрашивания, тогда как антиген низкотемпературного извлечения обеспечивает надежные сигналы от TCs. Успешное использование этого протокола приводит к pY1798 окрашивание TCs, распространяется от ворсинок наконечник склеп. Окрашенных TCs имеют золотник образный сома и флуоресцентные сигналы конденсироваться на кончик lumenal, которая соответствует выступающих «Клок.» Фаллоидин окрашивание colocalized с pY1798-позитивных ПРДС на границе утолщенные кисти и соответствует массе корешок, простирающейся от TC пучок. Этот протокол может использоваться для изучения TCs в пробах человеческой биопсии с желудочно-кишечные эндоскопы. Кроме того TCs недавно сообщалось накапливать после инфекции дармоеда в мышей, предполагая, что этот протокол может иметь приложения для диагностики инфекций, паразитов в кишечнике человека.
Introduction
Клок клетки (TCs) являются мелкие разрозненные компоненты желудочно-кишечного эпителия, которые характеризуются апикальной Тафтса и золотник образный СОСМ1. Хотя TCs были впервые описаны в 1956 году2, ТК функция остается неясным, отчасти из-за отсутствия надежных TC маркеров.
Эномото и др. Первый характеризуется актина связывающий белок, girdin3, которая выражается в нервной системе, а также в не нервные ткани, такие как кровеносные сосуды, клапанов сердца, сухожилия и скелетных мышц4. Мышей с генетическим абляция girdin отображения замедления роста и несколько мозга аномалии4,5,6. Тем временем потеря функции мутации в человека girdin связан с прогрессивной энцефалопатии, тяжелой отсталости и раннего начала эпилептические припадки7.
В 2011 году Линь et al. определены динамические фосфорилирование girdin в тирозин 1798 опосредовано тирозин киназ например8EGFR и Src. Они также показали, что фосфорилированных girdin требуется для актина реконструкции для запуска миграции клеток8. Омори et al. разработали сайт - и фосфорилирование статус специфических антител против человека girdin фосфорилированных в тирозин 1798 (pY1798 антитела) после Goto в протокол и проверены антитела, с помощью сайта направленного мутагенеза в выражение векторы нося полнометражные girdin9,10. В 2017 году, Kuga и др. сообщили, что pY1798 этикетки TCs с высокой специфичности и высокая чувствительность1. PY1798 антитела были продемонстрированы превосходит предыдущие TC маркеры, основанные на окрашивание свойствами, которые показали всю ячейку фигуры, включая характеристику «клок» на кончик lumenal, пока Биологическая роль girdin и фосфо girdin в ТК функция остается неясным1.
Метод, описанный в настоящем исследовании включает иммунофлюоресценции, окрашивание, гистологические техники для обозначения определенных белков на ткани, используя основное антитело против целевого белка и флуоресценции конъюгированных вторичное антитело против основного антитело. Цель данного метода должна позволить исследователям с ограниченным опытом гистологические получить TC изображения высокого качества. Этот протокол использует свободно плавающего cryosections, избежать необходимости слайд установлен cryosections, или парафиновые секции. Однако свободно плавающего секции хрупкой ввиду отсутствия поддержки со стороны на стеклянное скольжение и толщина среза можно уменьшить проницаемость антитела. Этот протокол включает в себя два подхода, которые преодолеть эти проблемы: 1) заполнение всей тощую люмен с желатином для сохранения морфология свободно плавающего секций на всей процедуры окрашивания и 2) использование антигена низкотемпературного извлечения активизировать pY1798 сигналов.
Protocol
Все методы, описанные здесь были утверждены животное уход и использование комитета института развития исследований, Айти человека сервисный центр (номер заявки: M-03).
1. Подготовка
- Подготовка 10 Л-фосфатный буфер (PBS): 32.27 g Na2HPO4·12H2O, 4,5 g NaH2PO4·2H2O, 80,0 г NaCl добавляется ультрачистая вода окончательный объем раствора 10 л хранить при комнатной температуре (RT).
- Подготовка 200 мл PBS-T: 200 мл PBS из шага 1.1 с 100 мкл polyoxyethylene(10) octylphenyl эфира в конечной концентрации 0,05% (vol:vol). Магазин на RT.
- Во время носить перчатки и средства защиты глаз, подготовить 50 мл 15%-ая сахароза в растворе нейтрального формалина 10% буфер: 7,5 г сахарозы, добавляется 10% буферизуются раствор нейтрального формалина (Таблица материалов) в окончательный объем 50 мл. Магазин на RT.
Предупреждение: Ингаляции или кожи глаз контакт с формальдегидом в растворе нейтрального формалина 10% буфер может быть опасным. Обращаться с осторожностью. - Приготовить 1,5 мл раствора 200 единиц/мл Фаллоидин Люминесцентная краска конъюгата штока: Фаллоидин Люминесцентная краска конъюгата (300 единиц в 1 флакон, лиофилизированные тел, возбуждения и выбросов длин волн: 581 Нм и 609 Нм, соответственно) приостановлено в 1,5 мл метанола. Раствор хранить в темноте при температуре-20 ° C.
- Подготовить 5 мг / мл 4', 6-diamidino-2-phenylindole, дигидрохлорид (DAPI) сток решение: 10 мг DAPI в 2 мл n, N-Диметилформамид (DMF). Раствор хранить в темноте при температуре-20 ° C.
- Подготовить 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS: 0,5 г BSA, 10 мл ФСБ. Хранить при 4 ° C.
- Удаление скошенным кончиком 18-прямые иглы с использованием щипцы и щепотку Обжатое конце с пинчер в продольном направлении, чтобы позволить жидкости через просвет иглы (1рис. 1A).
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
2. животных диссекции и изоляции тощая кишка
- Перфузии фиксации мыши
- Надевайте перчатки и работать в хорошо проветриваемом помещении.
- Подготовка 100 мл стеклянный стакан, буфер 10% раствор нейтрального формалина, хирургические инструменты (ножницы, щипцы), металлический лоток, нейлона 6-0 вырезать швы, 18-прямые иглы подготовлен как в 1.7, 22-Крылатый иглы, 20 мл шприц.
- Загрузить 20 мл раствора нейтрального формалина 10% буферизуются из стекла стакан в 20-мл шприц и прикрепить 22-го калибра Крылатый иглы к электрической розетке.
- Приготовить жидкий желатин, добавив 1 г порошка желатина 20 мл PBS (окончательный 5% желатина) в 50-мл пластиковых пробирок. После замачивания в РТ за 15 мин, Инкубируйте на 50 ° C на водяной бане 15 мин без встряхивания.
- Кратко вихрь и Инкубируйте на 50 ° C для еще 15 мин до полного растворения желатина. Оставьте трубки на RT до использования.
- Усыпить взрослой мыши на шейки матки дислокации.
- Поместите курсор мыши из шага 2.1.6 на металлический лоток и сделать небольшой надрез на коже через мечевидный хряща с помощью хирургических инструментов.
- Разверните разрез с обеими руками подвергать грудной и брюшной области.
- Откройте брюшины подвергать диафрагмы и затем открыть диафрагму с обеих сторон.
- Вырезать грудной клетки вдоль передней подмышечной линии с обеих сторон, а затем удалите грудной стенки, резки в поперечном направлении с позиции тимуса подвергать сердце.
- Сделайте небольшой надрез на ушной раковины правого предсердия для слива крови и вставьте 22-го калибра Крылатый иглы в верхушки левого желудочка. Толкать поршень к perfuse ткани раствором нейтрального формалина 10% буферизации.
- После разоблачения органов малого таза, отрезать в конце прямой кишки из ануса и отделить от тела кишечника путем разрезания брыжейка.
- Чтобы изолировать тощей кишки, вырежьте кишечника на расстоянии 4 см от анального стороны желудка антрального. Выбросите анальный половину оставшихся тонкой кишки.
- Ролик тощей кишки в половину, чтобы облегчить процедуру промывки. Нагрузки 20 мл 10% буфер раствор нейтрального формалина в 20-мл шприц и прикрепить 18-прямые иглы подготовлен на шаге 1.7 к электрической розетке.
- Внедрять решения нейтрального формалина 10% буферизуются из одного конца обрезанный тощую избавиться кишечного содержимого и исправить поверхности просвета кишки (2рис. 1A).
- Мыть в просвет кишки путем инъекций PBS, как описано в шаге 2.1.15.
- Очистка жидких желатин в просвет кишки как описано в шаге 2.1.15 заменить PBS жидкий желатин.
- Закрыть один конец обрезанный тощей кишки путем перевязки швов с использованием нейлона 6-0 сократить шов, залейте жидкий желатин тощей кишки и закрыть противоположный конец перевязки швов (рис. 1A3).
- Добавьте четыре узла шовные подогнать колбасный тощую секции в пораженную часть cryomold (4рис. 1A).
Примечание: Для cryomolds с 20 мм x 25 мм x 5 мм депрессии секция, Секция колбасный тощую ~ 20 мм является предпочтительным. - Замочите тканей в 50 мл 15%-ая сахароза в растворе нейтрального формалина 10% буферизации на ночь при 4 ° C.
Примечание: Эти шаги обеспечить криозащиты, сахароза и белка фиксации с формалином желатина и ткани. Формалина gelatinized желатин не тает на RT, тогда как нефиксированное gelatinized желатина на 4 ° C плавит на RT.
3. Привязка замораживания тканей желатин заполнены тощей кишки
- Путем разрезания тощую шовные узлов, три части колбасный тощей кишки с обоих концов лигируют получаются (4рис. 1A). Совместите колбасный штук в cryomold для добавления вложения для подготовки образцов замороженные ткани.
- Оснастки заморозить cryomold в изопентан, охлаждается жидким азотом. Магазин cryomolds-80 ° c
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
4. иммунофлюоресценции клок клетки, с помощью свободного плавания Cryosections
- Cryosectioning
- Установите температуру камеры криостата (КТ) и температура объекта (OT) до-22 ° C. Место замороженные ткани блока в cryomold в зале криостат для по крайней мере 15 минут.
- Добавьте 3 мл PBS для 35-мм культуры блюдо.
- Удалите блок замороженные ткани из cryomold и пополам блок с лезвием бритвы подвергать поперечного сечения тощей кишки. Смонтировать одной половины блока на Чак (криостата адаптер) к разделу секущей плоскости с лезвием бритвы.
- Раздел желатин заполнены тощую 30 мкм толстые разделов. Использование замороженных щипцами осторожно перевести разделы в 35-мм культуры блюдо, приготовленное в шаге 4.1.2 (Рисунок 2Бсправа).
- Применение основного антитела
- Мыть свободно плавающего разделы в 35-мм культуры блюдо 3 раза за 5 мин с 3 мл PBS-T с мягкий встряхивания на взаимные шейкер (примерно 36 раз / мин).
- Приготовляют раствор антигена поиска: 0,3 мл концентрата антигена поиска решения (Таблица материалов) в 2,7 мл ультрачистая вода. Добавьте 3 мл раствора антигена поиска для 35-мм культуры блюдо, содержащих свободно плавающего секций.
- Закройте крышку, печать разрыв между блюдо и крышку с полосы виниловые ленты и инкубировать на 50 ° C в гибридизации инкубатор для 3 h без встряхивания.
- Выньте блюдо из инкубатора и прохладно в РТ за 20 мин. После удаления Bиниловой лентой, мыть секции 3 раза за 5 мин с 3 мл PBS-T и мягкий встряхивания.
- Аспирационная PBS-T и добавьте 5 капель раствора (Таблица материалов) блокировки на разделы. Инкубируйте на RT на 5 мин с мягкий встряхивания.
- Приготовляют раствор основного антитела: 495 мкл 5% BSA в PBS с 5 мкл антител фосфо Y1798 girdin (pY1798) (Таблица материалов). 500 мкл раствора первичного антитела на разделы (блокирования решения не должны быть удалены).
- Поместите блюдо в камере увлажненные инкубации и инкубировать на ночь при 4 ° C с мягкий встряхивания.
Примечание: Ночь инкубации может быть продлен до трех ночи.
- Применение вторичных антител
- Вымойте секции 3 раза за 5 мин в 3 мл PBS-t с мягкий встряхивания.
- Подготовить разреженных DAPI Стоковый раствор: 2 мкл раствора DAPI штока (шаг 1.5), 998 мкл PBS.
- Вторичное антитело решения: 476 мкл 5% BSA в PBS, 10.5 мкл разбавленного раствора DAPI, 12,5 мкл концентрированного препарата конъюгата Стоковый раствор Фаллоидин Люминесцентная краска, 1 мкл коза анти кролик IgG Люминесцентная краска конъюгата (длина волны: возбуждения 496 Нм, выбросов 520 Нм).
- После аспирационных PBS-T, применять раствор вторичных антител и инкубировать в камере свет экранированный инкубации на RT 30 мин с мягкий встряхивания.
- Вымойте секции 3 раза за 5 мин с 3 мл PBS-T и мягкий встряхивания.
- После окончательного вымыть удалить PBS-T и замените 3 мл хватает polyoxyethylene(10) octylphenyl эфир PBS. Передать стереоскопические блюдо.
- Место 200 мкл PBS в капли в центре мас покрытием белого стекла слайд и передачи одной тощей кишки раздел блюдо в капли, с помощью кончика пипетки P200.
- После настройки выравнивания раздела под стереоскопическим микроскопом, аспирационная все оставшиеся PBS, окружающих секции.
- 20 мкл водный монтажа СМИ и место 20 x 20 мм coverslip на вершине средств массовой информации.
- Сразу же уплотнение края coverslip со средствами массовой информации на основе ксилол монтажа. Место слайда на деревянные Маппе и позволяют средства массовой информации на основе ксилол монтажа закрепить на RT для 2-3 ч.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. После того, как средства массовой информации на основе ксилол монтажа затвердевает, слайды могут храниться на 2-3 недели в поле света экранированный слайд в рт.
5. конфокальная микроскопия
- Положите Масло иммерсионное на 63 X цели конфокального микроскопа. Поверните coverslip слайд и место слайда на сцене.
- Оцифровать TC изображения, полученные на лазерных длин волн 405, 488 и 555 Нм и сохранять изображения в формате tiff (.tiff).
Примечание: Выберите набор фильтров обнаружения, которая подходит для флуоресценции красители (то есть, возбуждения/выбросов Максима: 358/461 Нм, 490/525 и 590/617).
Representative Results
Желатин заполнение тощая кишка
Типичная процедура для заполнения мыши тощей кишки с желатином показано (рис. 1а), как преимущества желатин заполнения (рис. 1B). Короче говоря скошенным кончиком иглы прямо, 18 был удален для защиты от пирсинга стенку кишок (1рис. 1A). Желатин наполнения была достигнута с помощью буферизации, 10% раствор нейтрального формалина, вводят от одного конца раздела обрезанный тощей кишки очистить кишечник и исправить поверхности просвета кишки (2рис. 1A) до наполнения с жидкий желатин ( ) Рисунок 1A3). Результате колбасный штук (4рис. 1A) были встроенные, заморожены и поперечно секционного 30 мкм толщиной ломтиками в криостата. В отсутствие желатин наполнения тощей кишки разделы склонны излом, позволяя Вилли махом назад (рис. 1Bслева). Желатин заполнения сохраняет круглой формы диска разделов и поддерживает вертикальное позиционирование Вилли (рис. 1Bсправа). Изображения ясно указывают на пользу, обеспечиваемой желатина, заполнение в сохранении морфология свободно плавающего тощую секций.
Успешное изображений клеток кишечника Тафт
pY1798 антитела могут применяться для переменной иммуноокрашивания методы, в том числе точка промокательной, Западный blotting, парафин раздел пятнать, оттепель смонтирован cryosection окрашивание или свободно плавающего cryosection окрашивания1,9. В этом протоколе мы сосредоточились на свободно плавающего cryosections для флуоресценции окрашивание TCs в тощую мыши, используя pY1798 антител, Фаллоидин и DAPI пятнать продемонстрировать структурных характеристик TCs1. В общем TCs разбросаны в размере приблизительно одной TC/100 эпителиальных клеток от кончика ворсинок склеп1. Представитель результаты показывают, что pY1798 можно воспроизвести очерчивает весь TCs, включая мембраны, цитоплазма золотник образный сома, и кончик сильно окрашенных lumenal, где конденсации надежный сигнал соответствует выступающие «клок» ТК1 (Рисунок 2A-2B). Тем временем Фаллоидин является phallotoxin, семейство ядовитых бициклических heptapeptides из мухомора бледная поганкаи имеет высокое сродство для нитчатые актина (F-миозина), который присутствует в микроворсинки, которые формируют кишечника кисть границы 11. Фаллоидин можно воспроизвести и заметно знаменует утолщенные кисть границы, которая соответствует массе корешков, простирающейся от клок1. Таким образом последовательного совместного локализация сигналов (золотник образный сома, сигнал конденсации на кончик lumenal) pY1798 с заметно утолщенные Фаллоидин позитивных кисть границы показывает, что этот протокол успешно определяет ПРДС независимо от являются ли они расположены на ворсинок ()рисунок 2A) или в склепе ()Рисунок 2B).
Антиген низкотемпературного извлечения является эффективным для окрашивания свободно плавающего секций
Поиск на основе тепла антигена на 95-99 ° C широко используется для анализа парафиновых срезах и слайд установлен cryosections. Однако применяя этот подход к свободно плавающего разделы без повреждения трудно, потому что такие разделы, как правило, более хрупкие, чем слайд установлен секций, которые поддерживаются слайд12. С момента извлечения низкотемпературных антигена (50 ° C 3 h) использование на водяной бане не влияет на морфологию свободно плавающего тощую секций в предварительные эксперименты, мы оценивали объективный эффективность извлечения антигена в слепой тест, который статистически подтвердил эффективность антигена низкотемпературного извлеченияРисунок 3) ().
Рисунок 1: Желатин заполнение тощую секций для морфологического сохранения cryosections
(A) фотографии процедуры для заполнения внутрипросветная мыши тощей кишки с желатином. (А1) Скошенным кончиком иглы прямо, 18 был удален во избежание пирсинг стенки кишечника. (А2) Решение буферизации нейтрального формалина (10%) был введен в один конец обрезанный тощей кишки очистить кишечного содержимого и исправить поверхности просвета кишки. (A3) Обрезанный тощую заполнены жидкий желатин и обоих концах лигируют нейлона 6-0 шовные (черные стрелки). (A4) Четыре больше шовные knots (белые стрелки) между ранее существовавших knots шовные (черные стрелки) принесли три коротких штук. Затем ткань будут разделены на три куска колбасы как в двух указанных позиций (белые стрелки). (B) благотворное влияние желатина-заполнение на свободно плавающего cryosection морфология. Без заполнения желатина, разделы склонны Кинк, позволяя Вилли легко качать обратной (слева); с начинкой желатина, 30 мкм толщиной секция имеет форму диска и вертикальном положении Вилли является сохранившийся (справа). Изображения были сфотографированы с помощью Номарски дифференциальной помехи контраст. Масштаб баров, 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель флуоресценции изображения клетки кишечного клок мыши
Конфокальный флуоресценции изображения TCs ворсинок (A) или в склепе (B), в разделах тощую свободно плавающего мыши окрашивали участкам и фосфорилирования статус специфических антител против girdin фосфорилированных на тирозина 1798 ( pY1798, зеленые, оптимального возбуждения/выбросов волн 490/525 Нм), Фаллоидин (красный, 590/617 Нм), 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, синий, 358/461 Нм). Площадь, окруженная белые коробки в малое увеличение изображения (шкала баров, 50 мкм) расширяется на право (шкала баров, 10 мкм). pY1798 антитела можно воспроизвести пятно TCs, независимо от их местоположения (на ворсинок (A), или в склепе (B)), с окрашивания на lumenal Совет (стрелки), мембраны и цитоплазме золотник образный TC сома. Заметно утолщенные кисть границы в Фаллоидин окрашивание (стрелок) является еще одним отличительным признаком TCs. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Низкотемпературного извлечения антигена усиливает pY1798 иммунофлюоресценции
Две группы экспериментальных процедур были по сравнению с подтверждения эффективности извлечения низкотемпературных антигена. Свободно плавающего тощую секции (30 мкм толщиной, n = 13) от одного замороженного блока были разделены на две группы и разделы из каждой группы были окрашенных после полный протокол или же протокол не хватает антигена низкотемпературного извлечения (шаг 4.2.2). После окрашивания, разделы были смонтированы на отдельные слайды, помечены группы номера и маркировки на каждом слайде был покрыт клейкой ленты. Все слайды были перемешаны, помечены с новыми номерами на ленте и наблюдается при микроскопии флуоресцирования через фильтр FITC. Общее количество видимых pY1798-положительных TCs были в среднем в каждой группе и были показаны в гистограмму (среднее ± стандартное отклонение). Двустороннее t тест был проведен для сравнения средний графов между двумя группами. P-значения ниже 0,05 считались статистически значимой. Антиген низкотемпературного извлечения значительно повысила эффективность pY1798-иммунофлюоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Этот протокол был разработан чтобы позволить исследователям без опыта гистология получить надежные образы клок клеток (TCs). Этот протокол имеет три критических точек: 1) использование сайта - и фосфорилирование статус конкретных кролик поликлональных антител против человека girdin фосфорилированных в тирозин 1798 (pY1798 антитела) которые были получены от определенной компании ( Immuno-Biological лаборатории = компании X); 2) желатина заполнение тощей кишки; и 3) низкотемпературного извлечения антигена. В самом широком смысле, фосфорилирование статус специфические антитела могут быть классифицированы как модификация специфические антитела, которые признают определенный тип столб-поступательные изменения (например ацетилирования, метилирование или фосфорилирование) белка в определенных аминокислотных остатков. Омори и др. Компания X совместно порожденных и антитела pY1798 вакцинации кроликов с фосфорилированных пептид и очистки полученный антитела используя твердофазный хроматографии с unphosphorylated пептид, после Гото метод9, 10. pY1798 антитела интенсивно были проверены с в vitro фосфорилирование анализов с использованием полнометражного человека girdin векторы выражения с/без Точечная мутация в тирозин 17989. Впоследствии Kuga et al. обнаружил, что pY1798 антитела от компании X являются конкретные и чувствительной маркер кишечных TCs1. Таким образом включение pY1798 антител от компании X является критической точкой в этом протоколе.
Желатин содержит коллаген извлеченные из животных тканей и уже давно используется для внедрения образцов ткани для гистохимических исследований с использованием cryosections13. Температура плавления желатина, который gelatinized на 4 ° C, но тает при комнатной температуре, начал применяться для избежания негативных последствий тепла, необходимого для поддержания желатин в жидкое состояние во время внедрения14. В настоящем Протоколе температура плавления желатина из порошка желатина, что gelatinizes в 4 ° C и расплавов на RT был использован для сохранения морфология поперечной cryosections мыши тощей кишки. Когда этот желатин был использован для полностью заполнить тощей кишки, образцы были затем формалин Исправлена добиться необратимого желатинизации. Тепло индуцированной антигена поиска является эффективным методом подвергать антигены, которые маскируются альдегид содержащих фиксативов12. Однако высоких температур (95-99 ° C за 30 мин) обычно используется для анализа парафиновых срезах может повредить морфология комплекс желатином ткани. Здесь мы использовали антигена низкотемпературного извлечения (50 ° C 3 h), позволяет антигена извлечения и сохранения тканей морфологии.
pY1798 антитела можно пометить TCs, не только в мыши тощей кишки, но и в несколько органов (желудка, подвздошной кишки, толстой кишки и желчного пузыря) от мышей и людей1. Однако, поскольку pY1798 сигналов в незаписанных тканей из любой ткани будет быстро деградируют, этот протокол включает инъекции формалина в тощую люмен (шаг 2.1.15., Рисунок 1A2).
Существуют ограничения, связанные с толщиной свободно плавающего cryosections. Хотя тонкой cryosections может быть выгодным с точки зрения прозрачности для микроскопии, худоба делает эти разделы физически уязвимых. В отличие от этого толстые cryosections физически крепкий, но имеют меньше проницаемости антитела в раздел. В этом протоколе, были использованы 30 мкм толстые разделов которые были физически стабильной и проницаемой для антител. Хотя этот метод был разработан для исследователей без обширный опыт в гистологии, если протокол не, pY1798/Виллин/DAPI тройной окрашивание парафиновых разделы аналогична используемой Kuga et al. может быть выполняться1. Парафиновых срезах не использовались здесь, чтобы избежать трудностей, связанных с Фаллоидин окрашивание F-актина в парафиновых срезах.
Благодаря сохранению аминокислотных последовательностей, прилегающих к girdin тирозин-1798 pY1798 антитела могут применяться к пятно TCs видов помимо мыши, включая крыс и человека. Заполнение желатина, используемые в настоящем Протоколе также может применяться для других полых органов. Действительно помимо pY1798 или TC, сочетание желатина, заполнение с низкой температуры антигена поиска могут быть полезны для выявления заведомо «трудных» epitopes в кишечнике мыши и как следствие, могут представлять интерес для многих исследователей.
Биологическая роль girdin и значение его фосфорилирования в ТКС является неясным. Однако исследование, Линь и др. предложил что тирозин фосфорилирование girdin связан с той степенью полимеризации F-актина8. Тем временем Kuga et al. нашли что смертельной дозы индукторов апоптоза (например., цисплатин, рентгеновского излучения) вызвало большое увеличение в относительную частоту TCs в тонкой кишке мыши, что они предположили, что может быть связано с возможно преобразование enterocytes в ТК, в синхронизации с фосфорилирование girdin в микроворсинки1. Эта возможность требует дополнительного изучения в будущем. Три группы, недавно наблюдается быстрое увеличение частоты TC, после возбудителя инфекции15,16,17. Таким образом это свободно плавающего пятнать может использоваться не только для анализа тканей эндоскопически собранные кишечнике человека, но ТК накопления также может помочь в диагностике возбудителя инфекции в кишечнике человека.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Naoya асаи в Нагойском университете за предоставление полезных предложений для развития низкотемпературных антигена поиска для свободного плавания тощую секций. Эта работа была поддержана дотаций для Scientific Research (KAKENHI) (C) в 2012 году (JP25460493) и (B) в 2017 году (JP17H04065) из японского общества для поощрения науки (JSP), A-шаг грантов в 2014 году (AS251Z02522Q) и в 2015 году (AS262Z00715Q) Япония науки и технологии агентства (JST) и дальновидный Takeda исследования грант 2014 от Takeda научного фонда (м.а.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slc:DDY 6-week-old female mice | Chubu Kagaku Shizai | Not applicable | |
| Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) | Wako | 196-02835 | |
| Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O | Wako | 199-02825 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
| Triton X-100, Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether | Katayama Chemical | Not applicable | |
| Sucrose | Wako | 190-00013 | |
| 10% buffered neutral formalin solution | Muto Chemical | 20215 | Step 1.3. |
| Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
| Methanol | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| N.N-dimethylformamide (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-10G | |
| 18-gauge stainless steel straight needle | Terumo | NN-1838R | |
| U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun | Kono Seisakusho | Not applicable | |
| 22-gauge winged needle | Terumo | SV-22DLK | |
| 20 mL TERUMO syringe | Terumo | SS-20ES | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 15 mL Iwaki centrifuge tubes | Iwaki | 2325-015 | |
| 1.5 mL micro test tube | Star | RSV-MTT1.5 | |
| Gelatin powder, Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
| Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece | Sakura FineTech | 4583 | |
| Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
| Isopentane | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
| Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
| Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2. |
| Protein Block | Dako | X0909 | Blocking solution in 4.2.5. |
| Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6. |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
| Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy | Merck Millipore | 107961 | |
| MAS-coated slide glass white | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
| Wooden Mappe KO-type | Shoei Work's | 99-40007 | |
| Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml | Zeiss | 444960 | |
| Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
| Ultrapure water production system | Advantec | GS-590 | |
| Plastic glove, Star Nitrile Glove | Star | RSU-NGVM | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1950 | |
| Deep freezer, SANYO Ultra Low | Sanyo | MDF-382 | |
| Showcase refrigerator | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
| Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) | Taitec | 0068750-000 | |
| Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) | Taitec | HB-100 | |
| Incubation chamber for immunostaining | Cosmo Bio | 10DO | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) | Taitec | NR-1 | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
| Stereoscopic microscope (for tissue handling) | Olympus | SZ61 | |
| Stereoscopic microscope (for Figure 1B) | Leica Microsystems | M165FC | |
| Fluorescence microscope (for Figure 3) | Nikon | E800 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Kuga, D., et al. Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut. J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).
- Jarvi, O., Keyrilainen, O. On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren. Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).
- Enomoto, A., et al. Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE. Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).
- Asai, M., et al. Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage. Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).
- Kitamura, T., et al. Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin. Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).
- Wang, Y., et al. Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain. J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).
- Nahorski, M. S., et al. CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse. Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).
- Lin, C., et al. Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration. Science signaling. 4 (192), ra64 (2011).
- Omori, K., et al. Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration. Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).
- Goto, H., Inagaki, M. Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody. Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue. J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).
- Ushida, K. Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections. Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
