Summary
Kuga et al. scoperto che stato di fosforilazione anticorpi specifici contro l'actina associazione proteina girdin fosforilata in tirosina 1798 (pY1798) possa essere usato per marcare le cellule ciuffo (TCs). Questo protocollo permette la visualizzazione robusto di TCs usando la macchiatura immunofluorescente del digiuno digalleggiante cryosections con gli anticorpi pY1798.
Abstract
Il girdin di actina associazione proteina è una proteina citosolica che è richiesta per l'actina ritocca per innescare la migrazione delle cellule in vari tessuti. Girdin viene fosforilato da recettore sia non-recettore tirosina chinasi a tirosina 1798. Omori et al sviluppato sito - e fosforilazione stato anticorpi specifici contro girdin umano a tirosina-1798 (pY1798), che si legano specificamente a tirosina fosforilata-1798, ma non a unphosphorylated tirosina-1798. gli anticorpi pY1798 sono stati usati per marcare specificamente le cellule di ciuffo (TCs) che sono presenti in tessuti di mammiferi gastrointestinale, ma la funzione di queste cellule è chiara. Questo protocollo permette la visualizzazione robusta di TCs nel digiuno mediante immunofluorescenza e gli anticorpi pY1798. Per assicurare una visualizzazione TC semplice e di successo, questo protocollo comprende due tecniche istologiche: produzione di cryosections digalleggiante dal tessuto riempito di gelatina digiuno e ricupero dell'antigene a bassa temperatura a 50 ° C per 3 h. riempimento digiuno con gelatina mantiene la forma del digalleggiante sezioni durante la procedura di colorazione, considerando che ricupero dell'antigene a bassa temperatura assicura robusti segnali da riuscito uso di questo protocollo si traduce in pY1798 colorazione di TCs distribuiti dalla punta del villo di TCs. Cripta. Macchiato TCs hanno un soma a forma di bobina e segnali fluorescenti condensano sulla punta di lumenal, che corrisponde a 'ciuffo' sporgente. Falloidina colorazione colocalized con TCs pY1798-positiva al bordo di spazzola ispessita e corrisponde ad una massa di radichetta che si estende dal ciuffo di TC. Questo protocollo potrebbe essere usato per esaminare TCs in campioni bioptici umani raccolti con endoscopi gastrointestinali. Inoltre, TCs recentemente sono stati segnalati ad accumularsi a seguito di infezione del parassita in topi, suggerendo che questo protocollo potrebbe avere applicazioni per la diagnosi delle infezioni parassita nell'intestino umano.
Introduction
Cellule di ciuffo (TCs) sono componenti minori sparse di epitelio gastrointestinale che è caratterizzati da ciuffi apicali e a forma di spool somas1. Sebbene TCs furono descritti per la prima volta nel 19562, funzione TC rimane poco chiaro, in parte a causa della mancanza di indicatori certi di TC.
Enomoto et al. in primo luogo caratterizzato la proteina legante l'actina girdin3, che si esprime nel sistema nervoso, così come in tessuti non neurali, come vasi sanguigni, valvole cardiache, tendini e muscoli scheletrici4. Topi con ablazione genetica di girdin visualizzano il ritardo di sviluppo e più cervello anomalie4,5,6. Nel frattempo, mutazione di perdita-de-funzione nel girdin umano è associato con l'encefalopatia progressiva, ritardo severo e precoce insorgenza crisi epilettiche7.
Nel 2011, Lin et al. identificato dinamica fosforilazione di girdin a tirosina 1798 mediata dalla chinasi della tirosina quali EGFR e Src8. Hanno anche mostrato che girdin fosforilato è necessaria per l'actina che ritocca per attivare cella migrazione8. Sviluppato Omori et al sito - e fosforilazione stato specifici anticorpi contro umano girdin fosforilata in tirosina 1798 (anticorpi pY1798) seguendo il protocollo di Goto e convalidati gli anticorpi mediante mutagenesi sito-diretta di vettori di espressione trasporto full-length girdin9,10. Nel 2017, Kuga et al. segnalato che pY1798 etichette TCs con elevata specificità e sensibilità alta1. Gli anticorpi pY1798 sono stati indicati per essere superiore ai marcatori di TC precedenti basati su proprietà di macchiatura eccellente che ha rivelato la forma intera cellula, tra cui la caratteristica 'ciuffo' sulla punta lumenal, ancora il ruolo biologico di girdin e fosfo-girdin in TC funzione è rimasto poco chiaro1.
Il metodo descritto in questo studio coinvolge l'immunofluorescenza che macchia, una tecnica istologica per contrassegnare una proteina specifica sul tessuto usando un anticorpo contro una proteina dell'obiettivo primario e un anticorpo secondario coniugato fluorescenza contro il primario dell'anticorpo. Lo scopo di questo metodo è quello di permettere ai ricercatori con esperienza limitata istologico ottenere immagini di alta qualità TC. Questo protocollo utilizza cryosections digalleggiamento che evitano la necessità di cryosections montata, o sezione di paraffina. Tuttavia, sezioni digalleggiante sono fragili a causa della mancanza di sostegno da una lastra di vetro e lo spessore di sezione può diminuire la permeabilità dell'anticorpo. Questo protocollo comprende due approcci che superare questi problemi: 1) riempire il lume di intero digiuno con gelatina per preservare la morfologia delle sezioni digalleggiante durante le procedure di colorazione e 2) l'uso di ricupero dell'antigene a bassa temperatura per intensificare i segnali pY1798.
Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso dell'Istituto per la ricerca inerente allo sviluppo, centro di servizio di Aichi umani e cura degli animali (numero domanda: M-03).
1. preparati
- Preparare 10 L di tampone fosfato salino (PBS): 32,27 g di Na2HPO4·12H2O, 4,5 g di NaH2PO4·2H2O, 80,0 g di NaCl aggiunto all'acqua ultrapura ad un volume finale di 10 soluzione L. negozio a temperatura ambiente (TA).
- Preparare 200 mL di PBS-t: 200 mL di PBS dal punto 1.1 con 100 µ l di polyoxyethylene(10) octylphenyl etere a una concentrazione finale di 0,05% (soluzioni). Conservare a RT.
- Indossando guanti e protezione per gli occhi, preparare 50 mL di 15% di saccarosio in soluzione neutra Formalina 10% tamponata: 7,5 g di saccarosio aggiunto al 10% il formalina neutra tamponata (Tabella materiali) ad un volume finale di 50 mL. Conservare a RT.
Attenzione: Inalazione e/o pelle/occhio contatto con formaldeide in soluzione neutra Formalina 10% tamponata possa essere pericoloso. Maneggiare con cautela. - Preparare 1,5 mL di soluzione madre coniugato del falloidina fluorescente tintura 200 unità/mL: coniugato falloidina fluorescente tintura (300 unità in 1 fiala liofilizzati solidi, lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione: 581 nm e 609 nm, rispettivamente) sospeso in 1,5 mL di metanolo. Conservare la soluzione al buio a-20 ° C.
- Preparare 5 mg / mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI) stock soluzione: 10 mg di DAPI in 2 mL di N, N-dimetilformammide (DMF). Conservare la soluzione al buio a-20 ° C.
- Preparare il 5% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS: 0,5 g di BSA, 10 mL di PBS. Conservare a 4 ° C.
- Rimuovere la punta smussata di un ago di calibro 18 dritto utilizzando un taglierino e un pizzico alla fine nipped con un pincher in senso longitudinale per consentire liquido di fluire attraverso il lume dell'ago (Figura 1A1).
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. animale dissezione e isolamento del digiuno
- Fissazione di aspersione di un mouse
- Indossare guanti e lavorare in un'area ben ventilata.
- Preparare un bicchiere di vetro 100ml, tamponata 10% soluzione di formalina neutra, strumenti chirurgici (forbici, pinze), un vassoio metallico, nylon 6-0 tagliare suture, un ago di calibro 18 diritto preparato come 1.7, un ago di calibro 22 alato, una siringa da 20 mL.
- Caricare la siringa 20 mL 20 mL di soluzione di formalina 10% tamponata neutra dal bicchiere di vetro e collegare l'ago 22-alato all'uscita.
- Preparare la gelatina liquida con l'aggiunta di 1 g di gelatina in polvere a 20 mL di PBS (finale 5% gelatina) in una provetta da centrifuga da 50 mL. Dopo l'immersione a temperatura ambiente per 15 min, incubare a 50 ° C a bagnomaria per 15 min senza agitare.
- Brevemente vortice e incubare a 50 ° C per altri 15 min sciogliere completamente la gelatina. Lasciare il tubo a RT fino all'utilizzo.
- Eutanasia di un topo adulto di dislocazione cervicale.
- Posizionare il mouse dal punto 2.1.6 su un vassoio metallico e praticare una piccola incisione sulla pelle attraverso la cartilagine ensiformi utilizzando strumenti chirurgici.
- Espandere l'incisione con entrambe le mani per esporre le regioni toraciche e addominali.
- Aprire il peritoneo per esporre il diaframma e quindi aprire il diaframma su entrambi i lati.
- Tagliare la gabbia toracica lungo le linee ascellari anteriore su entrambi i lati, quindi rimuovere la parete toracica per talea in una direzione trasversale dalla posizione del timo per esporre il cuore.
- Praticare una piccola incisione sul padiglione auricolare dell'atrio destro a drenare il sangue e inserire un ago di calibro 22 alato all'apice del ventricolo sinistro. Spingere lo stantuffo per irrorare i tessuti con 10% di soluzione di formalina neutra tamponata.
- Dopo aver esposto organi del bacino, tagliare l'estremità del retto dall'ano e separare l'intestino dal corpo tagliando il mesentere.
- Per isolare il digiuno, tagliare l'intestino a 4 cm dal lato anale del antrum gastrico. Scartare la metà anale dell'intestino tenue rimanente.
- Clip di digiuno a metà per facilitare la procedura di lavaggio. Carico 20 mL di 10% soluzione di formalina neutra tamponata nella siringa 20 mL e inserire l'ago dritto 18g preparata al punto 1.7 alla presa.
- Iniettare la soluzione neutra Formalina 10% tamponata da un'estremità del digiuno ritagliato per scovare il contenuto intestinale e fissare la superficie del lume intestinale (Figura 1A2).
- Lavare il lume intestinale iniettando PBS, come descritto nel passaggio 2.1.15.
- Lavare liquido gelatina nel lume dell'intestino, come descritto nel passaggio 2.1.15 per sostituire PBS con gelatina liquida.
- Nelle vicinanze un'estremità del digiuno ritagliato tramite la legatura di sutura utilizzando un nylon 6-0 tagliare sutura, riempire il digiuno con gelatina liquida e chiudere l'estremità opposta tramite la legatura di sutura (Figura 1A3).
- Aggiungere quattro nodi di suturazione per adattare una sezione a forma di salsiccia digiuno alla parte depressa di un cryomold (Figura 1A4).
Nota: Per cryomolds con un 20 mm x 25 mm x 5 mm depresso sezione, una sezione di tipo salsiccia digiuno ~ 20 mm è preferibile. - Immergere i tessuti in 50 mL di saccarosio al 15% in soluzione neutra Formalina 10% tamponata durante la notte a 4 ° C.
Nota: Questi passaggi garantiscono crioprotezione tramite la fissazione di saccarosio e proteina di formalina di gelatina e tessuto. Formalina-gelatinizzato gelatina non si scioglie a temperatura ambiente, considerando che non fissa gelatinizzato gelatina a 4 ° C si scioglie a TA.
3. Inserire il congelamento dei tessuti di digiuno pieno di gelatina
- Tagliando il digiuno presso i nodi di suturazione, tre pezzi di salsiccia-come digiuno con entrambe le estremità legate sono ottenuti (Figura 1A4). Allineare i pezzi di salsiccia-come in un cryomold per aggiunta di incorporamento composto per la preparazione di campioni di tessuto congelato.
- Snap congelare il cryomold in isopentano raffreddato con azoto liquido. Negozio cryomolds a-80 ° C
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
4. immunofluorescenza di ciuffo cellule utilizzando digalleggiante Cryosections
- Criosezionamento
- Impostare la temperatura della camera criostato (CT) e la temperatura dell'oggetto (OT)-22 ° C. Blocco di luogo il tessuto congelato in un cryomold in camera del criostato per almeno 15 min.
- Aggiungere 3 mL di PBS a una piastra di coltura di 35 mm.
- Rimuovere il blocco di tessuto congelato dal cryomold e tagliare il blocco a metà con una lama di rasoio per esporre la sezione trasversa del digiuno. Montare uno metà del blocco su un mandrino (un adattatore criostato) alla sezione il piano di taglio con la lama di rasoio.
- Sezione il digiuno in 30 µm di spessore sezioni piene di gelatina. Uso congelati forcipe trasferire delicatamente le sezioni nella piastra di coltura 35mm preparata al punto 4.1.2 (Figura 2Bdestra).
- Applicazione di anticorpi primari
- Lavare le sezioni digalleggiamento nella piastra di coltura di 35 mm 3 volte per 5 minuti ciascuno con 3 mL di PBS-T con lieve agitazione su un agitatore reciproco (circa 36 volte / min).
- Preparare la soluzione di smascheramento dell'antigene: 0,3 mL di concentrato di soluzione di recupero dell'antigene (Tabella materiali) in 2,7 mL di acqua ultrapura. Aggiungere 3 mL di soluzione di smascheramento dell'antigene al piatto 35mm cultura contenente sezioni digalleggiante.
- Chiudere il coperchio, sigillante tra il piatto e il coperchio con una striscia di nastro in vinile e incubare a 50 ° C in un incubatore di ibridazione per 3 h senza agitare.
- Rimuovere il piatto dall'incubatore e raffreddare a temperatura ambiente per 20 min. Dopo aver rimosso il nastro in vinile, lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuno con 3 mL di PBS-T e lieve agitazione.
- Aspirare il PBS-T e aggiungere 5 gocce di soluzione bloccante (Tabella materiali) su sezioni. Incubare per 5 minuti con agitazione lieve a RT.
- Preparare la soluzione di anticorpo primario: 495 µ l di 5% BSA in PBS con 5 µ l di fosfo-Y1798 girdin (pY1798) anticorpi (Tabella materiali). Aggiungere 500 µ l di soluzione di anticorpo primario su sezioni (la soluzione bloccante non deve necessariamente essere rimosso).
- Mettere il recipiente in una camera di incubazione umidificata e incubare per una notte a 4 ° C con agitazione delicata.
Nota: L'incubazione durante la notte può essere esteso per fino a tre notti.
- Applicazione di anticorpi secondari
- Lavare le sezioni 3 volte per 5 min in 3 mL di PBS-T con lieve agitazione.
- Preparare soluzione stock DAPI diluita: 2 µ l di soluzione madre di DAPI (passo 1,5), 998 µ l di PBS.
- Rendere la soluzione di anticorpo secondario: 476 µ l di 5% BSA in PBS, 10,5 µ l della soluzione diluita di DAPI, 12,5 µ l della soluzione di riserva coniugato falloidina fluorescente tintura, 1 µ l di coniugato di tintura di capra anti-coniglio IgG-fluorescente (lunghezza d'onda: eccitazione 496 nm, emissione 520 nm).
- Dopo avere aspirato il PBS-T, applicare la soluzione di anticorpo secondario e incubare in una camera di incubazione luce-schermato a RT per 30 min con lieve agitazione.
- Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuno con 3 mL di PBS-T e lieve agitazione.
- Dopo il lavaggio finale, il PBS-T di rimuovere e sostituire con 3 mL di PBS privo polyoxyethylene(10) octylphenyl etere. Trasferire il piatto ad un microscopio stereoscopico.
- Posto 200 µ l di PBS in una goccia al centro di una sezione di digiuno uno scivolo e trasferimento del MAS-rivestito vetro bianco dal piatto nella gocciolina utilizzando una punta di pipetta P200.
- Dopo aver regolato l'allineamento della sezione al microscopio stereoscopico, aspirare tutti i rimanenti PBS che circonda la sezione.
- Aggiungere 20 µ l di supporti di montaggio acquoso e porre un coprivetrino 20x20 mm sopra il media.
- Immediatamente sigillare i bordi del coprioggetto con supporto di montaggio a base di xilene. Porre il vetrino su una mappa in legno e lasciare che i supporti di montaggio a base di xilene solidificare a temperatura ambiente per 2-3 h.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Dopo il supporto di montaggio a base di xilene si solidifica, le diapositive possono essere conservate per 2-3 settimane in una scatola di luce-schermato diapositiva a TA.
5. microscopio confocale
- Mettere olio da immersione sull'obiettivo X 63 di un microscopio confocale. Abbassare il vetrino coprioggetto-diapositiva e porre il vetrino sul palco.
- Digitalizzare le immagini TC acquisite a laser lunghezza d'onda 405, 488 e 555 nm e salvare le immagini in formato tiff (TIFF).
Nota: Scegliere un set di filtro di rilevamento appropriato per le tinture di fluorescenza (cioè, maxima di eccitazione/emissione: 358/461 nm, 490/525 e 590/617).
Representative Results
Gelatina-riempimento del digiuno
Una procedura tipica per il riempimento del mouse digiuno con gelatina è mostrata (Figura 1A), come sono i vantaggi della gelatina-riempimento (Figura 1B). In breve, la punta smussata di un ago di calibro 18 diritto è stato rimosso per proteggere contro la parete intestinale (Figura 1A1) di piercing. Riempimento di gelatina è stata ottenuta utilizzando 10% soluzione di formalina neutra iniettato da una estremità di una sezione di digiuno ritagliato per svuotare l'intestino e fissare la superficie del lume intestinale (Figura 1A2) tamponata prima del riempimento con liquido gelatina ( Figura 1A3). I pezzi di salsiccia-come risultanti (Figura 1A4) sono stati incorporati, congelati e sezionati trasversalmente a 30 µm di spessore fette in un criostato. In assenza di gelatina di riempimento, scarso sezioni tendono a kink, permettendo i villi di oscillare all'indietro (Figura 1Ba sinistra). Ripieno di gelatina conserva il disco-forma rotonda delle sezioni e mantiene il posizionamento verticale dei villi (Figura 1Ba destra). Le immagini indicano chiaramente del beneficio di gelatina di riempimento nel preservare la morfologia delle sezioni di digiuno digalleggiante.
Formazione immagine di successo delle cellule intestinali ciuffo
pY1798 anticorpi possono essere applicati per tecniche di variabile immunostaining, compreso macchiare del puntino, macchiarsi occidentale, paraffina sezione colorazione, disgelo-montato donatrici macchiatura o digalleggiante donatrici macchiatura1,9. In questo protocollo, ci siamo concentrati sulla cryosections digalleggiante per fluorescenza macchiatura del TCs nel digiuno del mouse utilizzando anticorpi pY1798, falloidina e DAPI macchiatura per illustrare le caratteristiche strutturali del TCs1. In generale, TCs sono sparsi al ritmo di circa una TC/100 cellule epiteliali dalla punta del villo cripta1. I risultati rappresentativi mostrano che pY1798 riproducibile delinea tutta TCs, tra cui la membrana, citoplasma di soma a forma di bobina e la punta di lumenal fortemente macchiata, dove condensa robusto segnale corrisponde al sporgente 'ciuffo' di una TC1 (Figura 2A-2B). Nel frattempo, falloidina è una phallotoxin, una famiglia di velenoso biciclico heptapeptides dal fungo Amanita phalloidesed ha alta affinità per l'actina filamentosa (F-actina), che è presente nei microvilli che formano il bordo di spazzola intestinale 11. falloidina riproducibile e prominente segna il confine di spazzola ispessita che corrisponde ad una massa di radichette che si estende dal ciuffo1. Quindi, la co-localizzazione coerenza di segnali pY1798 (a forma di spool soma, condensazione di segnale all'estremità lumenal) con il bordo prominente ispessita falloidina-positivi pennello dimostra che questo protocollo identifica correttamente TCs indipendentemente sia che si trova su un campione di villo (Figura 2A) o in una cripta (Figura 2B).
Ricupero dell'antigene a bassa temperatura è efficace per la macchiatura digalleggiante sezioni
Ricupero dell'antigene di basati sul calore a 95-99 ° C è ampiamente usato per l'analisi delle sezioni di paraffina e cryosections montata. Tuttavia, l'applicazione di questo approccio alle sezioni digalleggiante senza causare danni è difficile perché tali sezioni sono generalmente più fragili di sezioni montata che sono supportati dalla diapositiva12. Dal ricupero dell'antigene a bassa temperatura (50 ° C per 3 h) utilizzando un bagno d'acqua non ha influenzato la morfologia delle sezioni digalleggiante digiuno in esperimenti preliminari, abbiamo valutato l'efficacia obiettiva di ricupero dell'antigene in un blind test, che statisticamente, ha confermato l'efficacia di ricupero dell'antigene bassa temperatura (Figura 3).
Figura 1: Riempimento di gelatina di sezioni di digiuno per conservazione morfologica di cryosections
(A) fotografie delle procedure per materiale da otturazione intraluminal del digiuno del mouse con gelatina. (A1) La punta smussata di un ago di calibro 18 diritto è stato rimosso per evitare piercing delle pareti intestinali. (A2) Soluzione di formalina neutra tamponata (10%) è stato iniettato in una delle estremità del digiuno ritagliato per svuotare il contenuto intestinale e fissare la superficie del lume intestinale. (A3) Ritagliato digiuno pieni di gelatina liquida ed entrambe le estremità legate utilizzando una sutura in nylon di 6-0 (frecce nere). (A4) Quattro ulteriori sutura nodi (frecce bianche) collocati tra le pre-esistenti di nodi di sutura (frecce nere) ha prodotto tre pezzi più brevi. Il tessuto quindi sarà divisi in tre pezzi di salsiccia-come presso i due punti indicati (frecce bianche). (B) gli effetti benefici di gelatina-riempimento sulla morfologia di donatrici digalleggiante. Senza riempimento di gelatina, sezioni tendono ad attorcigliare, permettendo i villi facilmente swing indietro (sinistra); con ripieno di gelatina, una sezione di µm di spessore 30 mantiene una forma di disco e la posizione verticale dei villi è conservato (a destra). Immagini sono stati fotografati usando il contrasto differenziale di interferenza di Nomarski. Scala bar, 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini di fluorescenza rappresentativo delle cellule intestinali ciuffo del topo
Immagini di fluorescenza confocale di TCs su un campione di villo (A) o in una cripta (B), in sezioni di digiuno di topo digalleggiante macchiato con site-specific e fosforilazione-stato-specifici anticorpi contro girdin fosforilata in tirosina (1798 pY1798, verde, ottimale di eccitazione/emissione lunghezze d'onda 490/525 nm), falloidina (rosso, 590/617 nm), 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blu, 358/461 nm). La zona delimitata dalle scatole bianche nelle immagini ingrandimento basso (barre della scala, 50 µm) viene espansa a destra (barre della scala, 10 µm). gli anticorpi pY1798 macchiano riproducibile TCs, indipendentemente dalla posizione (su un campione di villo (A), o in una cripta (B)), con la macchiatura presenti presso la punta lumenal (frecce), membrana e citoplasma del soma TC a forma di bobina. Un bordo di spazzola prominente ispessita in falloidina macchiatura (frecce) è un altro segno distintivo di TCs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ricupero dell'antigene bassa temperatura migliora pY1798 immunofluorescenza
Due gruppi di procedure sperimentali sono stati confrontati per confermare l'efficacia di ricupero dell'antigene a bassa temperatura. Sezioni di digiuno digalleggiante (30 µm spessore, n = 13) da un unico blocco congelato sono stati divisi in due gruppi e sezioni di ogni gruppo sono state macchiate seguendo il protocollo completo o lo stesso protocollo di ricupero di difettare dell'antigene a bassa temperatura (punto 4.2.2). Dopo la colorazione, sezioni erano montate su singole diapositive etichettati con i numeri di gruppo e l'etichettatura su ogni diapositiva è stato coperto con del nastro adesivo. Tutte le diapositive sono state mescolate, etichettate con nuovi numeri sul nastro e osservate in microscopia a fluorescenza attraverso un filtro FITC. Totali conti di TCs pY1798-positivi visibili erano in media in ogni gruppo e sono stati visualizzati in un grafico a barre (media ± deviazione standard). Un t-test a due code è stato effettuato per confrontare i conteggi medio tra i due gruppi. P-valori inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Ricupero dell'antigene a bassa temperatura ha migliorato significativamente l'efficacia di pY1798-immunofluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo è stato progettato per permettere ai ricercatori, senza esperienza di istologia ottenere immagini affidabili delle cellule ciuffo (TCs). Questo protocollo ha tre punti critici: 1) l'uso del sito - e fosforilazione coniglio di stato specifici anticorpi policlonali contro umano girdin fosforilata in tirosina 1798 (anticorpi pY1798) che sono stati ottenuti da una società specifica ( Laboratori Immuno-Biological = società X); 2) riempimento gelatina del digiuno; e 3) ricupero dell'antigene a bassa temperatura. In senso più ampio, gli anticorpi specifici per lo stato di fosforilazione possono essere classificati come modifica specifici anticorpi che riconoscono uno specifico tipo di modificazione post-traduzionale (ad es. acetilazione, metilazione o fosforilazione) di un proteina ad un residuo di amminoacido specifico. Omori et al. e società X generati congiuntamente gli anticorpi pY1798 da immunizzare i conigli con peptide fosforilato e purificare gli anticorpi risultanti mediante cromatografia su fase solida con un peptide unphosphorylated seguito metodo9, di Goto 10. gli anticorpi pY1798 sono stati convalidati intensivamente con in vitro test di fosforilazione utilizzando vettori di espressione girdin umano a tutta lunghezza con/senza una mutazione di punto alla tirosina 17989. Successivamente, Kuga et al trovato che gli anticorpi di pY1798 dalla società X sono un marker sensibile e specifico di intestinale TCs1. Così, l'inclusione degli anticorpi di pY1798 dalla società X è un punto critico in questo protocollo.
Gelatina contiene collagene Estratto da tessuti animali e stato a lungo utilizzato per incorporare i campioni di tessuto per gli studi istochimici usando cryosections13. Punto di fusione basso gelatina, che è gelatinizzato a 4 ° C, ma si scioglie a temperatura ambiente, iniziò ad essere applicato per evitare gli effetti negativi del calore necessario per mantenere la gelatina in uno stato liquido durante l'incorporamento di14. In questo protocollo, punto di fusione basso gelatina prodotta con polvere di gelatina che gelatinizes a 4 ° C e fonde a RT è stato utilizzato per preservare la morfologia di cryosections trasversale del digiuno del mouse. Quando questa gelatina è stata utilizzata per riempire completamente digiuno, campioni sono stati poi formalina per raggiungere gelatinizzazione irreversibile. Ricupero dell'antigene indotta da calore è un metodo efficace per esporre gli antigeni che sono mascherati da aldeide-contenenti fissativi12. Tuttavia, le alte temperature (95-99 ° C per 30 min) comunemente utilizzate per l'analisi delle sezioni di paraffina possono danneggiare la morfologia del complessa tessuto/gelatina. Qui abbiamo usato il ricupero dell'antigene a bassa temperatura (50 ° C per 3 h) che permette il ricupero dell'antigene e la conservazione della morfologia del tessuto.
pY1798 anticorpi possono etichettare TCs non solo nel digiuno del mouse, ma anche in diversi organi (stomaco, ileo, colon e cistifellea) da topi e nell'uomo1. Tuttavia, poiché i segnali di pY1798 nei tessuti non fissati da tutto il tessuto si degradano rapidamente, questo protocollo include iniezione di formalina nel lume del digiuno (passo 2.1.15., 1A Figura2).
Non ci sono limitazioni connesse con lo spessore di cryosections digalleggiante. Anche se cryosections sottile può essere vantaggioso in termini di traslucenza per microscopia, la magrezza rende queste sezioni fisicamente vulnerabili. Al contrario, spesso cryosections sono fisicamente robusto, ma hanno bassa permeabilità dell'anticorpo nella sezione. In questo protocollo, sono stati usati 30 µm di spessore sezioni che erano entrambi fisicamente stabile e permeabile agli anticorpi. Anche se questo metodo è stato progettato per i ricercatori senza una vasta esperienza in istologia, se dovesse fallire il protocollo, pY1798/villina/DAPI tripla colorazione di paraffina sezioni simile a quello utilizzato da Kuga et al. potrebbe essere eseguita1. Sezioni della paraffina non sono state utilizzate qui per evitare le difficoltà connesse con la falloidina macchiatura di F-actina nelle sezioni della paraffina.
Dovuto la conservazione delle sequenze dell'amminoacido adiacente al girdin tirosina-1798, pY1798 anticorpi possono essere applicati per macchiare TCs in specie diverse dal mouse, fra cui ratto e umani. Il ripieno di gelatina utilizzato nel presente protocollo può essere applicato anche per altri organi cavi. Infatti, oltre a pY1798 o TC, la combinazione di gelatina di riempimento con ricupero dell'antigene bassa temperatura può essere utile per epitopi notoriamente "difficile" nell'intestino del mouse e di conseguenza, può essere di interesse per molti ricercatori.
Il ruolo biologico di girdin ed il significato della sua fosforilazione in TCs è poco chiari. Tuttavia, uno studio di Lin et al. ha suggerito quel tirosina fosforilazione di girdin è associata con il grado di F-actina polimerizzazione8. Nel frattempo, trovato che letale Kuga et al. dosi di induttori dell'apoptosi (ad es., cisplatino, radiazione a raggi x) ha provocato un grande aumento nella frequenza relativa di TCs nell'intestino tenue del mouse che hanno supposto può essere associato con la possibile conversione da enterociti a TCs, in sincronizzazione con la fosforilazione di girdin in microvilli1. Questa possibilità richiederà ulteriori indagini in futuro. Tre gruppi recentemente osservati il rapidi aumentano della frequenza di TC seguendo parassita infezione15,16,17. Così, questa colorazione digalleggiante potrebbe essere utilizzata non solo per analizzare tessuti raccolti endoscopicamente intestino umano, ma accumulo TC potrebbe anche aiutare nella diagnosi di infezione del parassita nell'intestino umano.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Naoya Asai all'Università di Nagoya per fornire suggerimenti utili per lo sviluppo di ricupero dell'antigene a bassa temperatura per sezioni di digiuno digalleggiante. Questo lavoro è stato supportato da localizzativi per Scientific Research (KAKENHI) (C) nel 2012 (JP25460493) e (B) nel 2017 (JP17H04065) della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS), un-passo concede nel 2014 (AS251Z02522Q) e nel 2015 (AS262Z00715Q) dalla Japan Science e Technology Agency (JST) e un visionario di Takeda ricerca Grant 2014 della Takeda Science Foundation (a M.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slc:DDY 6-week-old female mice | Chubu Kagaku Shizai | Not applicable | |
| Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) | Wako | 196-02835 | |
| Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O | Wako | 199-02825 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
| Triton X-100, Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether | Katayama Chemical | Not applicable | |
| Sucrose | Wako | 190-00013 | |
| 10% buffered neutral formalin solution | Muto Chemical | 20215 | Step 1.3. |
| Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
| Methanol | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| N.N-dimethylformamide (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-10G | |
| 18-gauge stainless steel straight needle | Terumo | NN-1838R | |
| U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun | Kono Seisakusho | Not applicable | |
| 22-gauge winged needle | Terumo | SV-22DLK | |
| 20 mL TERUMO syringe | Terumo | SS-20ES | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 15 mL Iwaki centrifuge tubes | Iwaki | 2325-015 | |
| 1.5 mL micro test tube | Star | RSV-MTT1.5 | |
| Gelatin powder, Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
| Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece | Sakura FineTech | 4583 | |
| Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
| Isopentane | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
| Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
| Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2. |
| Protein Block | Dako | X0909 | Blocking solution in 4.2.5. |
| Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6. |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
| Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy | Merck Millipore | 107961 | |
| MAS-coated slide glass white | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
| Wooden Mappe KO-type | Shoei Work's | 99-40007 | |
| Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml | Zeiss | 444960 | |
| Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
| Ultrapure water production system | Advantec | GS-590 | |
| Plastic glove, Star Nitrile Glove | Star | RSU-NGVM | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1950 | |
| Deep freezer, SANYO Ultra Low | Sanyo | MDF-382 | |
| Showcase refrigerator | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
| Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) | Taitec | 0068750-000 | |
| Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) | Taitec | HB-100 | |
| Incubation chamber for immunostaining | Cosmo Bio | 10DO | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) | Taitec | NR-1 | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
| Stereoscopic microscope (for tissue handling) | Olympus | SZ61 | |
| Stereoscopic microscope (for Figure 1B) | Leica Microsystems | M165FC | |
| Fluorescence microscope (for Figure 3) | Nikon | E800 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Zeiss | LSM700 |
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