Summary
Расширение аммиачного волокна (AFEX) является термохимической технологией предварительной обработки, которая может преобразовать лигноцеллюлезную биомассу (например, кукурузный оперез, рисовую солому и багассиз) в высокоусвояемое сырье как для биотоплива, так и для кормов для животных. Здесь мы описываем лабораторный метод проведения предоперыний AFEX на лигноцеллюлозной биомассе.
Abstract
Lignocellulosic материалы растительного происхождения сырья, таких, как остатки сельскохозяйственных культур (например, кукурузный опорожня, рисовая солома, и сахарный тростник bagasse) и целевых энергетических культур (например, мискантус, и switchgrass), которые доступны в больших количествах для производства биотоплива, биохимических веществ и кормов для животных. Растительные полисахариды (т.е. целлюлоза, гемицеллюлоза и пектин), встроенные в клеточные стенки, очень непокорны в отношении преобразования в полезные продукты. Расширение аммиачного волокна (AFEX) является термохимической предварительной обработки, которая повышает доступность полисахаридов для ферментов для гидролизов в ферментируемых сахаров. Эти высвобожденный сахар могут быть преобразованы в топливо и химические вещества в биоперерабатывающем заводе. Здесь мы описываем лабораторный серийный процесс AFEX для производства предварительно обработанной биомассы на грамматике без переработки аммиака. Лабораторный процесс может использоваться для определения оптимальных условий предварительной обработки (например, загрузка аммиака, загрузка воды, загрузка биомассы, температура, давление, время проживания и т.д.) и генерирует достаточное количество предварительно обработанных образцов для детальной физико-химической характеристики и ферментативного/микробного анализа. Выход ферментируемых сахаров из ферментативного гидролизов кукурузного оперения, предварительно обработанного лабораторным процессом AFEX, сопоставим с экспериментальным процессом AFEX в аналогичных условиях предварительной обработки. Данная статья предназначена для обеспечения подробной стандартной процедуры эксплуатации для безопасной и последовательной работы лабораторных реакторов для выполнения AFEX предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы.
Introduction
Расширение аммиачного волокна (AFEX) является термохимической предварительной обработки, которая использует летучий аммиак в качестве основного реактива для клеточной биомассы предварительной обработки. Этот процесс был первоначально изобретен Брюс Дейл экономически эффективно уменьшить непокорность лигноцеллюлезной биомассы и повышения биологически-катализированной предварительно обработанной биомассы деконструкции в ферментируемые сахара1,2. В отличие от большинства других водных основе термохимических предварительной обработки3, AFEX является сухой-сухой процесс, который не вызывает существенных изменений в составе биомассы и не требует шага мытья с его связанных отходов и расходов. Восстановление избыточного летучего аммиака было продемонстрировано в экспериментальном масштабе, что привело к снижению затрат на производство и переработку отходов. Пилотный масштаб упакованы кровать AFEX реакторной системы, разработанной MBI(Рисунок 1) восстанавливает остаточный аммиак с помощью пара зачистки и передает горячий, концентрированный аммиак в новую упакованную кровать4,5. После предобработки AFEX, незначительное количество азота, включенного в биомассу, может быть использоваться в качестве небелкового азота жвачных животных и микроорганизмов. Кроме того, путем изменения ультраструктуры биомассы с помощью различных физико-химических механизмов6,,7,,8, AFEX повышает доступность биомассы к углеводоактивным ферментам (КАЗИмы) и увеличивает скорость гидролизиса полисахаридов в несколько раз8,9, что также увеличивает его усвояемость рычание животных через их целлюлозно-активных микробиомов4,10,,11 .1011 Фермеры уже давно используют более простую версию этого метода для повышения усвояемости жвачных форах путем инкубации биомассы в течение нескольких дней или недель под пластиковым брезентом в присутствии низких ангидозных аммиачных нагрузок (злт;4% ж/ч основе сухой биомассы) и атмосферного давления и температуры10,11.
Anhydrous аммиак был впервые исследован за его потенциал для delignify древесины в 1950-х годах и в качестве целлюлозного химического вещества в начале 1970-хгодов 13,14,15,16,17,18. В начале 1980-х годов, под давлением, высокой температуры, концентрированный аммиак (Зgt;30% NH4OH) в субкритических условиях был впервые использован в лаборатории Дейл для повышения ферментатической усвояемости и микробной ферментируемости лигноцеллюлезной биомассы19. Этот процесс претерпел несколько изменений названия на протяжении многих лет, начиная с взрыва замораживания аммиака, а затем взрыва аммиачного волокна, и, наконец, расширение аммиачного волокна, или просто AFEX. Примерно в это же время (середина-конец 1980-х годов), DuPont (в настоящее время Dow-DuPont) также исследовали с помощью суперкритических и почти критических ангидры аммиака на основе процессов предварительной обработки для повышения усвояемости биомассы20,21,22. В последние десятилетия, было повышенное внимание на использование разбавленных aqueous аммиак решений в качестве реагента предварительной обработки, включая аммиак рециркуляции / проколации23 (ARP), замачивания в ваквого аммиака (SAA), или процесс Dow-DuPont без аммиака рециркуляции24. Несколько дополнительных методов рассмотрели использование ангидроусового аммиака (низковластный ангидроуса аммиака (LMAA) и низкожидкого аммиака25 (LAA). Недавно были разработаны две новые передовые технологии предочистной обработки органосольваина с использованием жидкого ангидроусового аммиака26,,27 и аммиако-соли на основе решений28 при высоких жидкостных и твердых нагрузках, которые позволяют селективное фракционирование лигнина и высокую эффективность ферментатической гидролизи предварительно обработанной клеточной биомассы при сверхнизких ферментных нагрузках. Недавняя статья обзора подчеркнул аналогии и явные различия между различными формами аммиака основе предварительной обработки29. Тем не менее, до недавнего времени4, не было экспериментального масштаба демонстрации аммиака на основе процессов предварительной обработки (например, AFEX), которые были эффективно в сочетании с замкнутым циклом химической переработки концентрированного аммиака, используемого в этом процессе.
В этой статье мы подробно описываем наиболее часто используемый протокол AFEX для предварительного лечения целлюлозной биомассы в лабораторных масштабах для производства граммовых весов предварительно обработанной биомассы (например, от 1 до нескольких 100 г). Как правило, биомасса смешивается с водой (0,1-2,0 г H2O/g сухой биомассы) и загружается в специально построенные реакторы из нержавеющей стали трубчатых или Парр типа. Затем в реактор добавляется аммиак ангидроус (0,3-2,0 г NH3/гсухой биомассы), и смесь нагревается до желаемой температуры реакции (60–180 градусов по Цельсию). Более ранние публикации о процессе AFEX 1980-1990-х годов начали предварительное лечение времени проживания (например, 5-60 мин) сразу после температуры рампы. Однако, как реакции происходят, как только аммиак добавляется в реактор, текущая процедура AFEX заключается в том, чтобы начать мониторинг времени проживания сразу после аммиака дополнение к реактору. При температуре 90 градусов Цельсия или больше, часто необходимо разогреть биомассу перед загрузкой аммиака, чтобы сохранить начальную температуру наращивает до минимального периода времени (т.е. lt;5 мин). По завершении времени проживания, клапан открыт для быстрого освобождения давления, и газ-фазы содержимого в подходящий химический дым капот. Быстрое преобразование аммиака из жидкой в газовую фазу также приводит к охлаждению реактора. Небольшие реакторы (объем реактора 100 мл) часто могут быть немедленно выгружены в капот дыма, в то время как более крупным реакторам (объем реактора 100 мл) может потребоваться дополнительное время для охлаждения. Для безопасности пользователей в более широком масштабе (100 г аммиака на реакторный пробег) очистка с помощью азота рекомендуется удалить из судна как можно больше остаточного аммиака и помочь в охлаждении содержимого реактора перед выгрузкой. Как правило, в лабораторных масштабах не предпринимается никаких попыток перерабатывать и/или восстанавливать аммиак. Одной из ключевых задач проектирования для масштабирования процесса предварительной обработки AFEX является переработка аммиака с минимальными капитальными и эксплуатационными расходами. Кроме того, добавление жидкого аммиака в биомассу обычно приводит к частичному миганию жидкости, которая охлаждает биомассу, требуя нагрева биомассы-аммиачной смеси до начала процедуры AFEX. Вместо добавления аммиака в качестве жидкости, добавление пара аммиака в биомассу предлагает два преимущества: во-первых, высокая пористость навалообразной биомассы позволяет быстро транспортировать пары аммиака, что приводит даже к распределению аммиака по всей биомассе. Во-вторых, пара аммиака легко и экзотермически растворяется в воде, увлажненной во влажной биомассе, что приводит к выработке тепла, которая быстро и равномерно нагревает биомассу. Чтобы воспользоваться этими преимуществами, как лаборатория МГУ Дейл, так и MBI разработали методы лечения AFEX с использованием пара аммиака. Дейл лаборатория разработала Газоемкое аммиак Pretreatment (GAP) процесс30, и MBI разработала упакованные кровать AFEX реактора процесса(Рисунок 1)4, который был продемонстрирован в экспериментальном масштабе. Упакованная кровать AFEX реакторная система способна полупакетный режим работы с полной переработкой аммиака с использованием метода зачистки пара4,5. Этот новый экспериментальный процесс MBI использует химические и физические характеристики аммиака для эффективного предварительного лечения биомассы при эффективной переработке аммиака.
Здесь мы представляем подробный план для проведения AFEX предварительной обработки кукурузы stover в лабораторных масштабах с использованием специально построенных 200 мл объем трубчатых реакторов (Рисунок 2). Предобработанные образцы AFEX были переварены в ферментируемые сахара с использованием коммерчески доступных целлюлолитных ферментных коктейлей, чтобы продемонстрировать эффективность процессов предварительной обработки. Результаты ферментативного гидролизного изо. для реактора AFEX в лабораторном масштабе сравнивались с более крупными пилотными образцами реактора AFEX. Наша цель заключается в обеспечении стандартной операционной процедуры для безопасной и последовательной работы лабораторных реакторов под давлением для выполнения AFEX предварительной обработки на целлюлозной биомассы, как кукурузный stover. Дополнительная вспомогательная информация о вариациях этого лабораторного процесса предварительной обработки AFEX (например, пилотный процесс упакованной кровати AFEX) также выделена в сопроводительном дополнительном файле PDF. Подробный отчет о шагах в процессе работы упакованной кровати AFEX будет выделен в отдельной публикации и доступен по запросу МБИ-МГУ.
Protocol
1. Корректировка содержания влаги в биомассе
- Смотрите Таблица материалов с изложением всех основных оборудования и материалов, необходимых для выполнения скамейки или лабораторной шкалы AFEX предварительной обработки с помощью специально построенных трубчатых реакторaf(Рисунок 2).
- Определить общее содержание влаги в биомассе с помощью анализатора влаги, или печь, установленную при температуре 105 градусов по Цельсию на 8 ч. Для метода печи, перенесите образцы к жаростойкому сушилке для охлаждения, чтобы предотвратить адсорбцию воды до сушки. Выполните процесс в дублировать или тройной и рассчитать среднее содержание влаги.
- Для данной сухой нагрузки на биомассу в реакторе (здесь он держит 25 г) используйте содержание влаги, определяемые в шаге 1.2, чтобы рассчитать, сколько влажной биомассы необходимо загрузить.
[1]
Где мвлажный - общая масса биомассы (основа влажного веса); мсухая масса биомассы на основе сухого веса; MCTWB - содержание биомассы влаги на основе общего веса - Взвесьте это количество биомассы (ммокрой)в пластиковом контейнере.
- Рассчитайте, сколько воды необходимо смешивать с влажной биомассой для достижения желаемого содержания влаги. Для кукурузы stover, это, как правило, 0,6 г H2O на г сухой биомассы.
[2]
Где мводы и массы воды, добавленной в реактор (в дополнение к воде в биомассе); xзагрузка воды AFEX (g:g сухая биомасса) - Используя баллончик, медленно добавить это количество воды (мводы)в биомассу, которая ранее была взвешена и хорошо перемешать вручную.
[1]
[2]2. Загрузить и собрать реактор
- Соберите корпус реактора, поместив крышку и тефлоновый прокладку на дно реакторной трубки. Болт зажим на месте, затягивая оба ореха равномерно с помощью раше.
- Перенесите влажную биомассу на собранную основу реактора и поместите вилку из стеклянной шерсти в верхней части биомассы.
- Поместите тефлоновый прокладку на верхней части реактора. Убедитесь, что регион свободен от биомассы и стеклянной шерсти, которая может предотвратить эффективное уплотнение, и поместите голову реактора на вершине, маневрируя термопарой через стеклянную шерсть и биомассу.
- Заткнись к верхней части реактора, используя храповик равномерно с обеих сторон.
- Взвесьте реактор (мреактор)и запишите вес.
3. Настройка реакторной системы и заполнение цилиндра переноса аммиака
- Подтвердите, что все оборудование подключено и работает (температурный контроллер, температурный монитор, шприц насос, таймеры).
- Установите таймеры к желаемому времени проживания для каждого реактора и образца для запуска.
- Включите и, при использовании программного шприца насоса, настроить метод доставки аммиака на шприц насоса.
Шаг 1: Вывод средств.
Шаг 2: Подождите 15 секунд (чтобы время открывалось и закрывалось клапанами).
Шаг 3: Настоять (для переноса аммиака в реактор).- Сохранить как метод AFEX, чтобы обеспечить легкое повторное использование.
- Убедитесь, что все клапаны в и из небольшого аммиака цилиндр закрыты.
- Если цилиндр был использован ранее и содержит остаточный аммиак / азот, медленно открыть клапан а на верхней части небольшого аммиака цилиндркрово-кровь от любого азота и закрыть клапан, как только жидкий аммиак начинает распыляться.
- Для заполнения небольшого аммиачного цилиндра откройте большой ангидроусовый аммиакцилиндри и все клапаны на линии аммиака. Медленно открывайте клапан (B) в верхней части небольшого аммиачного цилиндра до стабилизации давления. Подождите 5 минут, прежде чем продолжить следующий шаг. Приблизительно 120 мл аммиака заряжается от основного цилиндра к перевалочному цилиндру в течение этого времени.
- Закройте все клапаны между баком аммиака и небольшим цилиндром аммиака, работая слева направо, начиная с небольшого цилиндра (клапан А) и заканчивая главным клапаном в верхней части бака.
- Установите регулятор азота до 350 пси. Откройте клапан на азотном цилиндре и клапан на прикрепленном регуляторе. Откройте клапан C на небольшом цилиндре аммиака, чтобы медленно добавить азот, перенажив систему. Отрегулируйте давление небольшого цилиндра до 350 пси, по мере необходимости, регулируя установленную точку на регуляторе. Держите азотные линии открытыми при раздаче аммиака.
4. Разогреть реактор (для температуры реакции от 100 градусов по Цельсию)
- Подключите температурный монитор к термопаре и нагревательную ленту к регулятору температуры.
- Вручную отрегулируйте температурный контроллер, чтобы довести реактор до 60 градусов по Цельсию.
5. Загрузить реактор аммиаком
- Включите шприц насос, если не уже на.
- Рассчитать объем аммиака, необходимого на основе желаемой нагрузки аммиака (g:g сухой биомассы) и ранее определенной калибровки аммиака.
[3]
ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что насос аммиака загружается на объемной основе, при первом использовании его, калибровать для преобразования из необходимой массы в объем. Следуйте той же процедуре, используемой для AFEX, но конец запуска (вентиляция реактора) сразу после загрузки аммиака и взвешивания реактора. Следуйте той же процедуре для разгрузки реактора. - Настройка метода для загрузки правильного количества аммиака:
- Выберите метод AFEX из раздела 3.3.
- Определение шага прессы (ru) Шаг: 1 Установите целевой объем или время.
- Ключ в объеме, требуемом в mL, используя номер площадку и нажмите зеленую галочку.
- Если требуется более 85 мл, введите целевой объем в качестве половины суммы, указанной в таблице, и заполните реактор дважды, используя тот же объем шприца.
- Повторите шаги 5.3.2 до 5.3.4 для "Шаг: 3".
- Нажмите кнопку "Назад".
- Откройте клапан (D) на дне небольшого цилиндра аммиака к выхлопным газам, а затем закройте его, как только любой остаточный аммиак вышел.
- Откройте клапан (E) на конце шприца насоса к передней части дыма капот, а затем открыть клапан (F) для освобождения любого остаточного аммиака. Закрыть клапаны (E) и (F).
- Отключите реактор от монитора температуры и контроллера температуры. Прикрепите реактор к быстрому подключению.
- Откройте клапан (D) к небольшому цилиндру аммиака и открытому клапану (E) к небольшому аммиаку.
- Нажмите зеленую стрелку на насос, чтобы начать последовательность и привлечь аммиака в шприц.
- Когда шприц автоматически останавливается на период ожидания, поверните шприц клапан (E) к реактору, и входе клапана реактора, чтобы он указал на быстрый стебель подключения.
После задержки шприц начнет вливаться, автоматически останавливаясь в заданной точке. - Если требуется более 85 мл аммиака, повторите шаги 5,7 - 5,9.
- Закройте клапан реактора и клапан (D). Открытый клапан (F) для высвобождения остаточного аммиака из шприца, а затем закрыть клапан (F) и закрыть клапан (E).
- Откройте клапан (D) к выхлопным газам, а затем закройте его после того, как остаточный аммиак ушел.
- Надев криогенные перчатки, снимите реактор с быстрого подключения. Будьте осторожны с потенциальным аммиак спрей. Используйте линию вентиляции ствола слона, чтобы при необходимости выпустить высвобождение аммиака.
- Запустите таймер для соответствующего реактора.
- Взвесьте блок реактора, чтобы убедиться, что соответствующий вес аммиака был добавлен на основе расчетов таблицы.
[3]6. Начать нагревание и контролировать реакцию
- Подключите температурный монитор к термопаре и нагревательную ленту к регулятору температуры.
- Запись начальной температуры и давления реактора после добавления аммиака (начало времени пребывания).
- Вручную отрегулируйте температурный контроллер, чтобы довести реактор до установленной температуры. Цель состоит в том, чтобы достичь установленной точки в Злт;5 мин.
- Запишите давление и температуру реактора каждые 3 мин до конца времени проживания.
- В конце времени проживания отключите реактор от температурного контроллера и термопары, снимите реактор со стойки и медленно откройте клапан для выпуска шара внутри капота дыма.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда носите щит лица во время этого шага.
7. Выключить систему
- После того, как реактор остынет в течение нескольких минут, используйте гаечный ключ, чтобы открыть зажимы на реакторе.
- Выгрузите биомассу и стеклянную шерсть из реактора внутри капота дыма. Для предотвращения загрязнения биомассы в воздухе, как остаточный аммиак испаряется, лучше высохнуть внутри закрытой сушильной коробки внутри вентилируемого пространства.
- Очистите реактор дистиллированной водой до тех пор, пока вода не прольется и не позволит реакторам высохнуть.
- Если все еще открыты, закройте все клапаны и подключитесь к аммиаку цилиндра.
- Закройте все клапаны на азотной линии.
- Выключите температурный контроллер, температурный монитор, баланс, шприц насос и таймер.
ВНИМАНИЕ: Если планируете запустить больше реакций, нет необходимости, чтобы вентиляционные небольшой цилиндр аммиака. Однако, если нет плана для запуска дополнительных экспериментов, для безопасности лучше всего, чтобы вентиляционные небольшой цилиндр в капот в конце эксперимента. При этом важно оставить клапаны открытыми, так как выброс аммиака может привести к образованию льда, которое может блокировать некоторые линии. По мере оттепели линий можно выпустить дополнительный аммиак. Всегда убедитесь, что вентиляция функционирует, позволяя системе вентиляции. Любая обработанная аммиаком биомасса, даже если она не предназначена для использования, должна быть высушена в капоте дыма на ночь, чтобы остаток аммиака испарялся. Его нельзя немедленно утилизировать в мусоре.
Representative Results
После предобработки AFEX, биомасса темнее по цвету, но в остальном визуально неизменна(рисунок 3). Процесс AFEX генерирует высокоусвояемый материал в различных масштабах, помимо того, который описан в этом протоколе. Здесь мы предварительно отработали тот же образец кукурузного остера в нашей маленькой 200 мл, упакованной кровати, скамейке масштаба системы; больше 5 галлонов, перемешивают Парр реактора; и пилотный реактор MBI. Условия, используемые для двух небольших реакторов (т.е. 200 мл и 5 галлонов шкалы) составляли 1,0 г NH3:gсухая биомасса, 0,6 г H2O:g сухой биомассы, для 30 мин при 100 и 5 градусов по Цельсию. Пилотная AFEX4 была проведена на том же материале на 0,6 г NH3:gсухая биомасса, 0,6 г H2O: g сухая биомасса, для 30 мин при 100 и 5 градусов по Цельсию. Подробная информация о протоколах, используемых для проведения предобработки AFEX в больших масштабах, содержится в подтверждающей информации (см. Дополнительный файл 1). Следующие "Критерии контроля качества" были установлены на основе целевой температуры для предобработки AFEX. Если после достижения установленной точки температура реактора выходит за пределы 10 градусов по Цельсию от установленной точки, эксперимент должен быть прерван. Если целевая температура (в пределах 5 градусов по Цельсию) не достигается в течение 5 минут после перекачки аммиака, прервать эксперимент. Кроме того, эффективность предварительной обработки для процесса AFEX может быть проверена с помощью целлюлолитных ферментных коктейлей для гидролизения доступных полисахаридов в ферментируемые сахара. Образцы были ферментативно гидролизовались в течение 72 часов при 6% глюканной нагрузке, рН 5,0, 50 кв/д и 250 об/мин в тряся инкубаторе. Коммерческий коктейль ферментов, состоящий из 60% целлюлазы (CTec3): 40% гемицеллюлазы (HTec3 или NS22246) на фиксированной общей основе загрузки белка загружены на 15 мг фермента / г глюкан был использован для всех анализов сахаризации. Результаты(рисунок 4) показывают, что предобработка AFEX значительно повышает урожайность ферментируемых сахаров во всех случаях. Кроме того, целлюлоза / ксилан гидролиз дает для биомассы предварительно обработанных с помощью лабораторного процесса AFEX сопоставима с большим 5-галлон Парр реактора и MBI в экспериментальном масштабе упакованы кровать AFEX процесса.
Рисунок 1. Схематический план шагов, связанных с экспериментальной масштабной эксплуатацией реактора AFEX мБИ для предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы, полностью интегрированной с эффективной переработкой аммиака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Схемы лабораторного масштаба системы доставки аммиака A) и малого 200 мл реактора AFEX, используемых для выполнения процесса AFEX, изложенного в видеопротоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. AFEX предварительно обработанной биомассы имеет очень похожую валовую морфологию по сравнению с необработанной биомассой, кроме того, что немного темнее по цвету. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Глюкоза и ксилоза дает, полученные после 72 ч ферментативный гидролиз 6% глюкан загрузки AFEX обработанных кукурузный опере показано здесь. Все анализы сахаризации проводились в дубликате со средними значениями (м), о которых сообщалось здесь. Стандартные отклонения (1s) регистрируются здесь как бары ошибок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Дополнительные протоколы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Система доставки аммиака и распорка кадр Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Протокол AFEX описывает, как обрабатывать растительные материалы в присутствии ангидроусового аммиака и воды при повышенных температурах, чтобы повысить усвояемость предварительного лечебного материала целлюлолитическими ферментами и/или микробами. AFEX является весьма эффективным на грамминоидных монокотных видов (например, кукурузный ступор, switchgrass, мискантус, рисовая солома, пшеничная солома, и сахарный тростник bagasse) из-за эффективности процесса расщепления эфирных связей, которые естественно обильные в этих материалах31. AFEX является гораздо менее эффективным на биомассе, полученных из dicots и gymnosperms (твёрдые древесины, хвойные породы, и родной forbs)32,33 из-за меньшей доли лигнина-углеводов на основе эфира связей. Однако, когда эти связи вводятся в древесные стенки клеток с использованием биотехнологии растений, процесс предварительной обработки AFEX становится гораздо более эффективным34.
Расщепление эстеровых связей позволяет удалять из материала определенные компоненты биомассы, но пересаживалось в качестве экстрактивных на поверхностях стенки наружных клеток, что приводит к образованию наноразмерных отверстий, которые облегчают проникновение и действие целлюлолитных ферментов6. AFEX предварительно обработанных кукурузы stover показал примерно 3-кратное увеличение глюкозы и ксилозы скорость выпуска после ферментативного гидролизиса в условиях высоких твердых веществ по сравнению с необработанным материалом. Предобработка аммиака также производит меньше и гораздо меньше ингибирующих продуктов деградации по сравнению с разбавленной кислотой предварительной обработки35. Предыдущее сравнение AFEX и разбавленной кислотой обработанной кукурузной оповестительной показали, что разбавленная кислота предварительной обработки производит 316% больше кислот, 142% больше ароматических веществ, и 3,555% больше муран-альдегидов, чем AFEX36, все из которых могут быть ингибирующими для микроорганизмов35,37. Поскольку AFEX является сухим и сухим процессом, нет также потери сахара в качестве разбавленного жидкого потока, который не может быть экономически использован во время ферментативного гидролизов. Тем не менее, это приводит к осложнениям, как ферменты с целлюлозно-унизительных и гемицеллюлоза-унизительных возможностей необходимы, чтобы полностью сломать полисахариды клеточной стенки во время ферментативного гидролизиса в смешанные ферментируемые сахара, как глюкоза и ксилоза. Hemicellulosic олигомеры, как сообщается, ингибировать активность целлюлазы38, что может потребовать более высокой нагрузки фермента для поддержания высокой конечной урожайности сахара. Тем не менее, оптимизация подходящих ферментных коктейлей может снизить общее использование ферментов при сахаризации предварительно обработанной биомассы AFEX39,,40,,41,,42,43,,44,,45. Во время предопробурения AFEX гидролиз и аммонолиз эстерсвязей приводит к образованию кислотных и амидных продуктов в предварительно обработанной биомассе (например, уксусной кислоты/ ацетамида, феруловой кислоты/феруламид, кумариновой кислоты/кумариламид)36. Хотя образование амидов было показано, чтобы помочь процессброжения, их присутствие в очень высоких концентрациях в предварительно обработанных сырья может быть проблемой, если кормление животных предварительно обработанных биомасс. Прегидролиз эфирных связей с щелочными, такими как NaOH или Ca (OH)2 до предобработки AFEX, может быть использован для решения этой проблемы.
Есть ряд соображений безопасности, чтобы иметь в виду при работе с ангидроусом аммиака во время процесса AFEX. Ангидроуса аммиака реагирует с медью, латунью, алюминием, углеродной сталью и общими полимерами фтореластомера, используемыми в уплотнениях (например, Viton и т.д.). Любые компоненты труб или реактора, которые могут соприкасаться с аммиаком, должны быть изготовлены из нержавеющей стали, а прокладки, клапанные сиденья и быстрое подключение уплотнения должны быть сделаны из Тефлона или Калреза, когда это возможно. Аммиак не считается токсичным химическим веществом, но он по-прежнему опасен из-за его гигроскопических и криогенных свойств. Он легко цели и может серьезно повредить слизистые оболочки в глазах и дыхательной системе. Аммиак является криогенной жидкостью, и утечки аммиака могут вызвать сильное обморожение из-за прямого контакта с потоком газа или охлажденным оборудованием. Аммиак немедленно опасен для жизни и здоровья (IDLH) при концентрациях выше 300 промилле. Рабочие должны немедленно эвакуироваться в случае, если концентрация превышает 50 промилле. Рекомендуется, чтобы операторы носили калиброванный аммиакный монитор для предупреждения опасных концентраций в их окрестностях. Также рекомендуется устанавливать датчики с сигнализацией в основной рабочей зоне. Работники, которые занимаются аммиаком, должны быть должным образом обучены и носить защитные средства, такие как респираторы, оснащенные картриджами метиламина, криогенными и теплозащитными перчатками, и быть готовыми к чрезвычайным ситуациям. В случае воздействия ангидрациата аммиак, оператор должен двигаться в безопасное место и немедленно промыть пораженный участок водой в течение не менее 15 минут. Процесс предварительной обработки аммиака должен проводиться внутри капота дыма, а цилиндр аммиака должен храниться в капоте дыма или вентилируемом шкафу. После эксперимента, предварительно обработанная биомасса будет иметь некоторые остаточные свободный аммиак и должны быть либо высушены в капоте на ночь или в пользовательских вентилируемых сушилка перед хранением в полиэтиленовых пакетах при комнатной температуре для последующих экспериментов. Некоторые другие ключевые соображения безопасности включают установку системы доставки аммиака с измеритель потока, который поможет точно доставки аммиака в реактор и реактор, предназначенный для обработки по крайней мере в 1,5 раза давление, что процесс предварительной обработки будет проходить (например, для обработки процесса AFEX на 2 х 106 Pa давления, минимальный рейтинг давления реактора должно быть 3 х 106 Па).
Предобработка AFEX является перспективным методом производства высокоусвояемой растительной биомассы, которая может быть использована непосредственно в качестве корма для животных или в качестве сырья для производства топлива и химических веществ. Помимо этих двух отраслей, AFEX может найти применение в других областях, таких как биовозобновляемые запасы для производства биоматериалов, или в качестве сырья для производства биогаза. Лабораторный процесс может быть проведен в лаборатории, оснащенной надлежащим вентиляционным пространством и мерами предосторожности, и наша текущая работа подтверждает, что этот уменьшенный процесс AFEX показывает аналогичные результаты с материалом, генерируемым в масштабируемом и/или экспериментальном реакторе AFEX. Процесс AFEX в лабораторных масштабах может использоваться для тестирования сырья, условий обработки и приложений на более высокой пропускной форме, обеспечивая при этом разумные ожидания того, как этот процесс будет работать на пилотных или промышленных масштабах.
Disclosures
Несколько авторов (а именно Шишир P S Chundawat, Тим Кэмпбелл, Farzaneh Teymouri, Леонардо Соуза, Брюс E Дейл, Venkatesh Балан) являются изобретателями / со-изобретателей на несколько патентов, поданных на аммиак предварительной обработки и реактора дизайн в МГУ / MBI.
Acknowledgments
Этот материал основан на работе, частично поддерживаемой Исследовательским центром биоэнергии Великих озер, Министерством энергетики США, Управлением по науке, Управлением биологических и экологических исследований под номерами DE-SC0018409 и DE-FC02-07ER64494. Ребекка Онг признает частичную поддержку со стороны Мичиганского технологического университета (финансирование стартапов). Шишир Чундават признает частичную поддержку со стороны Национального научного фонда США CBET (1604421), премии ORAU Ralph E. Powe и Rutgers School of Engineering (Финансирование стартапов). Брюс Дейл признает частичную поддержку со стороны Мичиганского государственного университета AgBioResearch офиса, а также USDA Национальный институт продовольствия и сельского хозяйства. Венкатеш Балан признает частичную поддержку со стороны штата Техас и Университета Хьюстона (Startup Funding). Сотрудники MBI признают частичную поддержку со стороны Министерства энергетики США и фонда Мичиганского государственного университета. Наконец, мы хотели бы посвятить эту работу нашему наставнику и соавтору профессору Брюсу Дейлу за то, что он вдохновил нас на совместную мечту о создании устойчивого целлюлозного биотоплива.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety Equipment/PPE | |||
| Ammonia Monitor | CanarySense | BW GAXT-A-DL | Single gas detector, Ammonia (NH3), 0 to 100 ppm |
| Cryogenic gloves | Amazon | B01L8WA238/B01L8WA1H0/B01L8WA1O8 | Keep hands protected when handling liquid ammonia |
| Ear muffs | 3M | H7A | Ear muffs to protect hearing when releasing ammonia at end of pretreatment |
| Face shield | - | - | Wear while handling ammonia |
| Heat protective gloves | Grainger | 2EWX1/2EWX2/2EWX3 | Showa heat resistant gloves, max temperature 500°F |
| Nitrile gloves | - | - | Wear while mixing biomass to prevent contamination |
| Reagents | |||
| Anhydrous Ammonia Compressed Gas Cylinder | - | - | An anhydrous ammonia compressed gas cylinder with a dip tube is required for this process. The dip tube is essential in order to withdraw liquid ammonia from the cylinder. |
| Distilled water | - | - | Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading |
| Milled or Chopped Corn Stover | - | - | Corn stover is not readily commercially available. Contact local farmers or agricultural extension if you wish to locate some. |
| Nitrogen Compressed Gas Cylinder | - | - | |
| Equipment | |||
| Ammonia Cylinder Adapter | - | - | CGA fitting that depends on the gas cylinder. Matheson is a good source. Some require teflon gaskets. This connects the cylinder to the ammonia delivery system. A regulator is not necessary as the system uses liquid ammonia. |
| Ammonia Delivery System (Figure 4) | Swagelok | Misc. | Stainless steel pressure cylinder and components, valves, check valves, and gauges were used for all lines potentially in contact with ammonia. |
| Analytical Balance | Sartorius | CPA4202S | Balance used for preparing biomass and weighing the reactors. Toploading balance, 4200g x 0.01g |
| Chemraz O-rings | Harvard Apparatus | 5013091 | Ammonia-resistant o-rings for the SS syringe |
| Custom Tubular Reactors (Figure 3) | Parts were purchased from McMaster-Carr, Swagelok, Omega, and Motion Industries (Dixon Fittings) | Misc. | To be compatible with ammonia, the custom reactor was constructed from stainless steel components (sanitary tube and fittings, compression fittings, quick connect, pressure gauge, thermocouple), and teflon gaskets. The maximum pressure rating of the vessel is 1500 psig, which is the maximum pressure rating of the bolted sanitary clamps. |
| Drying Box | - | - | Optional: an enclosed system for drying is necessary if planning to do microbial experiments to avoid contamination. Avoid drying at elevated temperatures. |
| High Pressure Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3311 | Infuse/Withrdraw PHD ULTRA HPSI Programmable Syringe Pump for transferring liquid ammonia |
| Moisture Analyzer | Sartorius | MA35 | Moisture analyzer for determining moisture content of biomass prior to pretreatment. |
| Nitrogen Delivery | Misc. | Misc. | Nitrogen compressed gas cylinder, inert gas regulator (at least 1000 psig max pressure rating), lines, and valves. |
| Ratchet wrench and 7/8" socket | - | - | Ratchet and socket to quickly tighten and open bolts on the sanitary clamp. Can be purchased anywhere. |
| Retractable Thermocouple Cables | Omega | RSC-K-3-4-5 | Retractable thermocouple cable. You need one for each reactor. |
| Stainless Steel Syringe | Harvard Apparatus | 702261 | Stainless steel syringe for tranferring ammonia to the reactors. |
| Temperature Monitor | Omega | HH12B | Dual input temperature monitor. You need one for every two reactors. |
| Voltage Controller | McMaster-Carr | 6994K11 | Variable-Voltage Transformer for controlling heating to the reactors. You need one for each reactor. |
| Supplies | |||
| Metal Scoops, Spoons and/or Spatulas | - | - | For transferring biomass for weighing, mixing, transferring into the reactor and removing from the reactor at the end of the run |
| Plastic Bowls or Tubs | - | - | Used for mixing the biomass with the water. Any bowl or tub could be used. |
| Spray Bottle | - | - | Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading |
| Wide-Mouth Funnel | - | - | Any funnel that has a bottom opening 0.5-1.0 inches diameter. |
| Wooden Dowel | - | - | 1-1.5" diameter wooden dowel to assist with loading/unloading the reactor |
| Consumables | |||
| Glass Wool | Sigma-Aldrich | CLS3950-454G | For packing the top of the reactor to prevent biomass escape and clogging the tubing |
| Plastic Press-to-Close Bags | McMaster-Carr | 1959T24 | Bags for storing processed samples and for transferring to drying box |
| Plastic Tote | - | - | Used to transfer pretreated biomass to an alternate location for drying |
| Plastic Weighboats or Metal Trays | - | - | Used to catch the biomass when removing from the reactors, and for storing the samples while drying |
References
- Dale, B. E., Henk, L. L. Response of Lignocellulosic Materials to Ammonia Freeze Explosion. Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 190, 78 (1985).
- Dale, B. E., Henk, L. L., Shiang, M. Fermentation of Lignocellulosic Materials Treated by Ammonia Freeze-Explosion. Symposium: Bioconversion of Waste Materials to Useful Industrial Products. , 223-233 (1985).
- Mosier, N. S., et al. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology. 96 (6), 673-686 (2005).
- Campbell, T. J., et al. A packed bed Ammonia Fiber Expansion reactor system for pretreatment of agricultural residues at regional depots. Biofuels. 4 (1), 23-34 (2013).
- Bals, B., Teymouri, F., Campbell, T., Jin, M., Dale, B. E. Low temperature and long residence time AFEX pretreatment of corn stover. BioEnergy Research. 5 (2), 373-379 (2012).
- Chundawat, S. P. S., et al. Multi-scale visualization and characterization of plant cell wall deconstruction during thermochemical pretreatment. Energy & Environmental Science. 4 (3), 973-984 (2011).
- Chundawat, S. P. S., Beckham, G. T., Himmel, M., Dale, B. E. Deconstruction of Lignocellulosic Biomass to Fuels and Chemicals. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 2, 121-145 (2011).
- Chundawat, S. P. S., et al. Primer on Ammonia Fiber Expansion Pretreatment. Aqueous Pretreatment of Plant Biomass for Biological and Chemical Conversion to Fuels and Chemicals. , 169-200 (2013).
- da Costa Sousa, L., Chundawat, S. P. S., Balan, V., Dale, B. E. "Cradle-to-grave" assessment of existing lignocellulose pretreatment technologies. Current Opinion in Biotechnology. 20 (3), 339-347 (2009).
- Solaiman, S. G., Horn, G. W., Owens, F. N. Ammonium Hydroxide Treatment on Wheat Straw. Journal of Animal Science. 49 (3), 802-808 (1979).
- Harbers, L. H., Kreitner, G. L., Davis, G. V., Rasmussen, M. A., Corah, L. R. Ruminal Digestion of Ammonium Hydroxide-Treated Wheat Straw Observed by Scanning Electron Microscopy. Journal of Animal Science. 54 (6), 1309-1319 (1982).
- Dale, B. E., Bals, B. D., Kim, S., Eranki, P. Biofuels Done Right: Land Efficient Animal Feeds Enable Large Environmental and Energy Benefits. Environmental Science & Technology. 44, 8385-8389 (2010).
- Schuerch, C., Burdick, M. P., Mahdalik, M. Liquid Ammonia-Solvent Combinations in Wood Plasticization: Chemical Treatments. Industrial & Engineering Chemistry Product Research and Development. 5 (2), 101-105 (1966).
- O'Connor, J. J. Ammonia explosion pulping: A new fiber separation process. Tappi. 55 (3), 353-358 (1972).
- Yan, M. M., Purves, C. B. Extraction of a Lignin Fraction from Maple Wood by Liquid Ammonia. Canadian Journal of Chemistry-Revue Canadienne De Chimie. 34 (12), 1747-1755 (1956).
- Yan, M. M., Purves, C. B. Attempted Delignifications with Sodium Bicarbonate - Carbon Dioxide, and with Anhydrous Liquid Ammonia, Under Pressure. Canadian Journal of Chemistry. 34 (11), 1582-1590 (1956).
- Tarkow, H., Feist, W. C. A Mechanism for Improving the Digestibility of Lignocellulosic Materials with Dilute Alkali and Liquid Ammonia. Cellulases and Their Applications. (95), 197-217 (1969).
- Peterson, R. C., Strauss, R. W. Chemi-mechanical pulping of hardwoods using ammonia vapor. Journal of Polymer Science Part C: Polymer Symposia. 36 (1), 241-250 (2007).
- Dale, B. E., Moreira, M. J. A Freeze-Explosion Technique for Increasing Cellulose Hydrolysis. Biotechnology and Bioengineering. , 31-43 (1982).
- Weimer, P. J., Chou, Y. -C. T. Anaerobic Fermentation of Woody Biomass Pretreated with Supercritical Ammonia. Applied and Environmental Microbiology. 52 (4), 733-736 (1986).
- Weimer, P. J., Chou, Y. C. T., Weston, W. M., Chase, D. B. Effect of supercritical ammonia on the physical and chemical structure of ground wood. Biotechnol Bioeng Symp. 17, 5-18 (1986).
- Chou, Y. C. T. Supercritical ammonia pretreatment of lignocellulosic materials. Biotechnol Bioeng Symp. 17, 19-32 (1986).
- Iyer, P. V., Wu, Z. -W., Kim, S. B., Lee, Y. Y. Ammonia recycled percolation process for pretreatment of herbaceous biomass. Applied Biochemistry and Biotechnology. 57, 121-132 (1996).
- Dunson, J. R., Elander, R. T., Tucker, M., Hennessey, S. M. Treatment of biomass to obtain fermentable sugars. U.S. Patent. , 0031918 US 2007/00 (2007).
- Kim, T. H., Lee, Y. Y., Sunwoo, C., Kim, J. S. Pretreatment of corn stover by low-liquid ammonia recycle percolation process. Applied Biochemistry and Biotechnology. 133 (1), 41-57 (2006).
- da Costa Sousa, L., et al. Next-generation ammonia pretreatment enhances cellulosic biofuel production. Energy & Environmental Science. 9, 1215-1223 (2016).
- da Costa Sousa, L., Foston, M., et al. Isolation and characterization of new lignin streams derived from extractive-ammonia (EA) pretreatment. Green Chemistry. 18 (15), 4205-4215 (2016).
- Chundawat, S. P. S., et al. Ammonia-salt solvent promotes cellulosic biomass deconstruction under ambient pretreatment conditions to enable rapid soluble sugar production at ultra-low enzyme loadings. Green Chemistry. 22, 204-218 (2020).
- Zhao, C., Shao, Q., Chundawat, S. P. S. Recent Advances on Ammonia-based Pretreatments of Lignocellulosic Biomass. Bioresource Technology. , 122446 (2019).
- Balan, V., Dale, B. E., Chundawat, S., Sousa, L. Methods for pretreating biomass. U.S. Patent. , US9644222 B2 (2011).
- Garlock, R. J., Chundawat, S. P. S., Hodge, D. B., Keskar, S., Dale, B. E. Linking Plant Biology and Pretreatment: Understanding the Structure and Organization of the Plant Cell Wall and Interactions with Cellulosic Biofuel Production. Plants and BioEnergy (Advances in Plant Biology). 4, 231-253 (2014).
- Balan, V., et al. Enzymatic digestibility and pretreatment degradation products of AFEX-treated hardwoods (Populus nigra). Biotechnology Progress. 25 (2), 365-375 (2009).
- Garlock, R. J., Bals, B., Jasrotia, P., Balan, V., Dale, B. E. Influence of variable species composition on the saccharification of AFEX pretreated biomass from unmanaged fields in comparison to corn stover. Biomass and Bioenergy. 37, 49-59 (2012).
- Wilkerson, C. G., et al. Monolignol Ferulate Transferase Introduces Chemically Labile Linkages into the Lignin Backbone. Science. 344 (6179), 90-93 (2014).
- Tang, X., et al. Designer synthetic media for studying microbial-catalyzed biofuel production. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 1 (2015).
- Chundawat, S. P. S., et al. Multifaceted characterization of cell wall decomposition products formed during ammonia fiber expansion (AFEX) and dilute-acid based pretreatments. Bioresource Technology. 101, 8429-8438 (2010).
- Lau, M. W., Dale, B. E. Cellulosic ethanol production from AFEX-treated corn stover using Saccharomyces cerevisiae 424A(LNH-ST). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (5), 1368-1373 (2009).
- Baumann, M., Borch, K., Westh, P. Xylan oligosaccharides and cellobiohydrolase I (TrCel7A) interaction and effect on activity. Biotechnology for Biofuels. 4 (1), 45 (2011).
- Chundawat, S., et al. Shotgun approach to increasing enzymatic saccharification yields of Ammonia Fiber Expansion (AFEX) pretreated cellulosic biomass. Frontiers in Energy Research. 5, 9 (2017).
- Gao, D., Chundawat, S. P. S., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. Binding Characteristics of Trichoderma reesei Cellulases on Untreated, Ammonia Fiber Expansion and Dilute-acid Pretreated Lignocellulosic Biomass. Biotechnology and Bioengineering. 108 (8), 1788-1800 (2011).
- Gao, D., Chundawat, S. P. S., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover. Bioresource Technology. 101 (8), 2770-2781 (2010).
- Gao, D., et al. Strategy for identification of novel fungal and bacterial glycosyl hydrolase hybrid mixtures that can efficiently saccharify pretreated lignocellulosic biomass. BioEnergy Research. 3, 67-81 (2010).
- Banerjee, G., et al. Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology. 101 (23), 9097-9105 (2010).
- Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: Production and optimization of a core set. Biotechnology and Bioengineering. 106 (5), 707-720 (2010).
- Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J., Borrusch, M., Walton, J. Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations. Biotechnology for Biofuels. 3 (1), 22 (2010).
