Summary
ここでは、テブフェノジド処理による pEUI(+) 特異遺伝子スイッチを用いた遺伝子発現の調節のためのプロトコルを提案する.
Abstract
遺伝子発現の精密制御が望ましい生物学的および臨床的研究です。ただし、現在失業遺伝子スイッチのバイナリの機能は、単一のセルに同時に 2 つの治療式単位の転送を必要とするため、遺伝子治療のためのシステムの実用的なアプリケーションが制限されます。遺伝子組み換え式システムを簡素化し、1 つのベクトルで遺伝子発現モジュールの完全なセットを包括的な pEUI(+) として示される遺伝子スイッチを生成されます。新開発の特異遺伝子のスイッチは非常に GAL4 DNA 結合ドメインの構成と変更された EcR (GvEcR)、変更されたショウジョウバエ脱皮ホルモン受容体 (EcR) と同様、GAL4 DNA 結合ドメインと融合した最小限 VP16 活性化ドメイン時間と用量依存的に化学インデューサの管理に対応。PEUI(+) ベクターは、生物学的研究と前臨床研究遺伝子発現の制御を改善するための強力なツールです。ここでは、変調テブフェノジド (Teb) 処理による pEUI(+) ベクトルを用いた非定常かつ安定的な発現のための詳しいプロトコルを提案する.また、Teb の化学誘導としての使用に関する重要なガイドラインを紹介します。
Introduction
いくつかの異なる遺伝子のスイッチは、正確に遺伝子発現細胞培養および動物モデル、成功1,2,3の度合いを調節する能力について検討しています。潜在的な遺伝子のスイッチ システムを含む、いくつかの厳格な条件を満たす必要があります: 遺伝子、誘導、プロモーターのごくわずかな水漏れしたため、transgene の可逆性の用量と時間依存応答性の正確な方向式インデューサの除去や細胞および研究室動物1,2,3に許容インデューサ毒性レベルを介して活性化。テトラサイクリン4、5ラパマイシン6,7、8ミフェプリストン9,10を含むいくつかの小分子誘導を悪用されています。エクダイソン11,12,13,14。一般に、これらのシステムは、2 つまたは 3 つの離散式ユニットを含む、少なくとも 2 つのプラスミドを必要とする、1 つまたは 2 つの構成; 転写活性を得るために小分子インデューサをバインド規制要素 (インデューサ プラスミッド)別プラスミド (エフェクター プラスミッド) インデューサ バインド規制要素へのアクセスを可能にする規制 DNA 領域の制御の下で遺伝子を含みます。バイナリ システムの主な欠点は、ターゲット セル (インデューサとエフェクター) 2 つのベクトルの併用導入を必要とすることです。一時的な遺伝子発現実験の 2 種のプラスミドの同時トランスフェクション必然的を生成する単独でインデューサか、エフェクターをトランスフェクトしたまたは co transfected ない均等にするセルの人口。さらに、バイナリ システムでは、時間がかかり、骨の折れるである安定したセルラインを確立する抗生物質選択の少なくとも 2 つのラウンドが必要です。したがって、遺伝子発現に必要なすべてのコンポーネントを組み合わせることと 1 つのベクトルに規制が単一のセルにすべての必要な要素の随伴表現を保証し、遺伝子発現の調節を可能にする理想的だろう小分子誘導と治療を通じて
バイナリの遺伝子スイッチの欠点を克服するためには、キイロショウジョウバエEcR 遺伝子誘導システム15を使用して特異遺伝子スイッチ我々 最近開発。エクジソンは、順番 DNA 規制要素3,11EcR のバインディングを誘導する EcR/ウルトラスピラクル (USP) ヘテロダイマーにバインドするときに遺伝子発現を仲介します。脊椎動物のレチノイド X 受容体 (RXR)、昆虫、USP のオーソログがアクティブな転写活性化因子16を形成する EcR を募集します。したがって、脊椎動物の細胞または組織の遺伝子発現のターゲット、EcR と RXR 必要があります共発現同時に脱皮ホルモンまたはそのアゴニストによって刺激されて前に。以来、EcR 遺伝子スイッチのヘテロ二量体の機能は、内因性の RXR レベル、Padidamらによって影響があります。異種 GAL4 DNA 結合、単純ヘルペス ウイルス蛋白質 vmw65 置き換え EcR DNA 結合と活性化ドメイン (VP16) 活性化ドメイン融合内因性 RXR に応答しなくなったし、ホモを形成した EcR リガンド結合ドメイン転写活性17を得よう。EcR ベース遺伝子のスイッチは、ホモを形成し、エクジソン アゴニスト、Teb16のない状態で細胞質に局在 GvEcR と組み合わせて最小限 VP16 活性化ドメインから成るキメラ蛋白質を構築することでさらに改善されました。 18。Teb にバインディングによって、GvEcR、内局細胞質からに変更ゼブラフィッシュ E1b 10 タンデム併用最小プロモーターから成るハイブリッド プロモーターの反復上流活性化配列 (UASs) を開始するを認識する核、16ターゲット遺伝子のトランスクリプション。
以前に報告した EcR 遺伝子を簡素化するスイッチ16,18、刺激的な発現のためすべての必要な要素を装備し、指定の単一ベクトルにシステムのバイナリの機能を結合我々新しく生成されたベクトル pEUI(+) (GenBank 受入番号: KP123436、図 1 a)15。EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI、および AflII の認識シーケンスが (図 1 b) UAS を繰り返す多重クローニング サイト (MCS) 続いて E1b 最小プロモーターの横にある 10 のタンデムのエフェクター GvEcR ドライバー (ドライバー以下) への応答で構成されます。選択を容易にするためにさらに、トランスフェクション細胞の SV40 プロモーターに駆動されるピューロマイシンN-アセチルのトランスフェラーゼ (PAC) 遺伝子は安定したセルライン (図 1) を維持するためにドライバーとエフェクターの間置かれました。
PEUI(+) を用いた遺伝子発現の非定常かつ安定的な変調のための詳しいプロトコルについて述べる。また、脱皮ホルモンのアゴニストとして Teb の正しく使用するための詳細な手順を提供します。
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Protocol
1. 遺伝子 Subcloning
- PEUI(+) の MCS の認識、適切な制限の酵素のサイト (またはサイト) を選択し、目的の方向 (図 1) の興味の遺伝子を subclone します。
注: EGFPまたはフラグ エピトープ タグ アンキリンリピート ドメイン 13A (ANKRD13A) 遺伝子のシーケンスや結紮-独立したクローニング法19T4 DNA ポリメラーゼを用いた pEUI(+) ベクターの EcoRI サイトだった subcloned。 - EcoRI で 37 ° C で 1 時間の pEUI(+) をリニア化します。ミックス 50 ng/μ L の 40 ng/μ L の PCR 増幅EGFPまたはANKRD13Aと pEUI(+) を線形し、T4 DNA ポリメラーゼ (1 U) (RT) 前に室温で 10 分間氷の上潜伏 1 分と追加 10 μ L の 100 μ L に直接反応混合物の反応次の変換の DH10B 有能なセルを実験します。
注: pEUI(+) (図 1 b) の MCS に追加されましたいくつかの制限酵素認識部位が、お勧めします EcoRI サイトにターゲット遺伝子を subcloning 結紮独立クローン技術19,20を使用しています。 - シーケンスによる挿入を確認し、トランスフェクションに適した DNA 精製キットを使用して DNA を浄化します。
2. トランスフェクションと Teb の治療
- 5-10% ウシ胎児血清 (FBS) と抗生物質 (100 U/mL ペニシリン, 100 μ g/mL ストレプトマイシン) 補われるダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) の 5 mL の新鮮な継代の HEK293 細胞を含む 4 細胞培養皿 (直径 60 mm) を準備します。以下、「培」または単に「培」は、FBS と抗生物質 DMEM を表します。37 ° C で HEK293 細胞を維持します。
- 1 μ g の精製 DNA をトランスフェクション試薬の 3 μ L を使用して 50-60% の密度を HEK293 細胞に transfect します。トランスフェクション試薬を加える (FBS、抗生物質なし DMEM) の希釈液 200 μ L の DNA を含んでいます。室温で 30 分間反応混合物の培養後 HEK 293 細胞培養皿上に混合物を追加します。、Transfection のため 2 つの料理を使用し、他の 2 つのコントロールとして放置のまま。
- トランスフェクションの 12-24 時間後に、トランスフェクションのサンプルの 1 つと非 transfected コントロールの 1 つに Teb (最終濃度 0.2 - 10 µmol) を追加します。未処理の実験的コントロールとその他の 2 つのサンプルをまま。
注: Teb 原液 (ジメチルスルホキシドに溶解し 50 mM) は、細胞培養液、DMEM、またはリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 培養細胞実験的パラメーターに応じて追加する前に適切な濃度で希釈できます。しかし、水溶液中における溶解 Teb の低度のため媒体の Teb の高濃度マスター ミックスの準備を避ける代わりに、完全な細胞培養液を必要な濃度で新鮮な培 Teb に置き換えます。 - 37 ° C で 12 48 h の Teb 処理と未処理細胞を養う
- 挿入EGFPを使用して蛍光顕微鏡 (図 2) の EGFP 発現を分析します。そうでなければ、免疫ブロット分析法のための細胞を収穫します。
- 免疫ブロット分析法の氷冷 PBS で 2 回細胞を洗い、それから細胞スクレーパーを使用してそれらをこすり。
- セルを重ね、18-25 ° C (RT) で 2 分間 21,000 × g で 15 mL の円錐管に収穫を回転させます。
- PBS を完全に破棄した後の冷えた哺乳類タンパク質抽出試薬 0.5 mL を追加 (M-ごと)、プロテアーゼ阻害剤 (プロテアーゼ阻害剤のカクテル 100 の 5 μ L) 場合は、60 mm ディッシュに培養される細胞ペレットと一緒に。
- 再ピペッティングのいくつかのラウンドでセルを中断し、18-25 ° C (RT) で 15 分の浮遊細胞をインキュベーションしています。
- 細胞の 4 ° C で 10 分間 21,000 x g でライセートをスピンします。
- 新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに水溶液上澄みを転送します。
- イムノブロット、次の標準的なプロトコルに適切な抗体培養上清を分析します。
3. pEUI(+) 遺伝子スイッチのゲノムの統合と安定した HEK293 細胞ラインの生成
- トランスフェクション試薬の 15-30 μ L を使用して 90 mm 直径細胞培養皿の 50-60% の合流は、HEK293 細胞に遺伝子の精製 pEUI(+) の 5-10 μ g を transfect します。トランスフェクション試薬を加える (FBS、抗生物質なし DMEM) の希釈液 500 μ L の DNA を含んでいます。室温で 30 分間反応混合物の培養後 HEK 293 細胞培養皿上に混合物を追加します。
- 後、成長し、37 ° C で 24-48 時間 (ピューロマイシン) なし非選択性培下ピューロマイシン耐性遺伝子産物を表現する形質転換細胞を許可します。
- 新鮮で培養皿からセルを切り離して考えます。培養液を破棄した後に予め温めておいた PBS (37 ° C) の形質転換細胞をすすぎ、0.25% トリプシン/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 1 つの mL を追加、37 ° C で 1 分間インキュベート予め温めておいた培 (10 mL、37 ° C) を追加することによってトリプシン/EDTA を焼入れ後 18-25 ° C で 2 分間 21,000 × g で 15 mL の円錐管に遠心分離によって続いて細胞スクレーパーを使用してセルを収穫します。
- 予め温めておいた培 (37 ° C) および 90 mm 新鮮な細胞培養皿に転送セルの 10 mL の 50 mL で、形質転換細胞は再中止します。ピューロマイシン治療前に、の 50-60% の confluency まで 37 ° C で細胞の培養 (一般に、これは約 24-48 時間かかる)。
- 37 ° c、3-4 週間 3 μ G/ml ピューロマイシンを添加した細胞培養液で形質転換細胞を養います。選考期間中、選択圧を維持するために 2 〜 3 日ごとピューロマイシン (3 μ g/mL) を含む培養液を変更します。セルになると完全に合流、ピューロマイシンを含む培養液中で、3.3 3.4 の手順を次に、それらを分割します。必要でない場合は、培養液の残りのセルを破棄します。
注: ピューロマイシン選択条件は、特定の細胞型の実験確立する必要があります。細胞培養; ピューロマイシンの 3 μ g/mL を使いました。これは非 transfected HEK293 細胞死を誘発するのに十分だった。 - クローニング シリンダーを使用して個々 のコロニーから細胞を収穫し、製造元の指示に従ってください。
- 細胞培養液を破棄します。予め温めておいた (37 ° C) 浮遊細胞を削除する PBS で 2 回プレートをすすいでください。
- 滅菌鉗子を使用すると、個々 のコロニーにクローニング シリンダーを設定します。
- 各シリンダーに 0.35% トリプシン/EDTA の 0.2 mL を追加します。
- セルがデタッチされると、シリンダーに予め温めておいた (37 ° C) 培養液を数滴を追加するまでは、1 分の 37 ° C で皿を孵化させなさい。
- それぞれのシリンダーから培養液 2 mL と 1 μ G/ml の各ウェルにピューロマイシン 6 ウェル プレートの個々 の井戸にセルを転送します。
注: 細胞がコンフルエントになると、文化をスケール アップ。クローンが設けることができるようになりました。
- ピューロマイシンの 1 μ G/ml を添加した細胞培養液中の個々 のクローンを維持します。
- イムノブロットと遺伝子の発現レベルを分析することによって 24 時間テストの Teb 治療 (最終濃度、10 μ M) への感度、Teb にクローンの応答をテストすることによって、個々 のコロニーを検証します。目的のクローン (またはその複製) を選択します。遺伝子の誘導レベルを分析する前に Teb 扱われ、37 ° C で 12-48 時間培養培地で未処理のサンプルを栽培してください。2.5.1 - 2.5.7 の手順」の手順に従って、免疫ブロットを遺伝子の発現レベルを測定できます。
4. Teb の枯渇
- Teb 自由な媒体 Teb 含む細胞培養液に置き換えて Teb 刺激を癒します。
注: 最初新しい培養皿上に細胞を再シードすることがなく成長媒体を交換することをお勧めします。残留 Teb はプラスチックの皿に固執する表示され、遺伝子の強力な背景表現を引き出すでしょう。新しい培養プレート上のセルを再シード、前に数回培地または PBS で収穫された細胞をすすいでください。- 新鮮で培養皿からセルを切り離して考えます。培地を含む Teb を破棄した後リンスの Teb 刺激細胞に予め温めておいた PBS (37 ° C) で 2 回、0.25% トリプシン/EDTA の 1 つの mL を追加、37 ° C で 1 分間インキュベート予め温めておいた Teb 無料培養液 (10 mL、37 ° C) を追加することによってトリプシン/EDTA を焼入れ後 18-25 ° C で 2 分間 21,000 × g で 15 mL の円錐管に遠心分離によって続いて細胞スクレーパーを使用してセルを収穫します。
- 予め温めておいた Teb 無料培 (37 ° C) と 3 つの 60 mm 新鮮な細胞培養皿に転送セルの 5 mL の 50 mL のセルを再停止します。それぞれ 24、48、および 72 h の 37 ° C での細胞を培養します。
- 異なる時点で細胞を収穫し、免疫ブロットを使用して遺伝子の発現レベルを測定します。
注意: これらの実験条件下での遺伝子発現の検出不可能な Teb 自由な文化媒体 (図 3) のセルの約 3 日後文化なりました。イムノブロット 2.5.7 2.5.1 - の手順に従って導入遺伝子の発現レベルを測定できます。
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Representative Results
GvEcR ベースの特異遺伝子のスイッチは、図 1 aに描かれています。PEUI(+) ベクトルは、Teb で処理による遺伝子発現の調節用に最適化されました。PEUI(+) のエフェクター地域、10xUAS と最小プロモーターに続いて EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI、および AflII の制限酵素認識部位を含む MCS、E1b で構成します。SV40 多信号は、MCS (図 1 b) 後ろに追加されました。PAC遺伝子は、ピューロマイシン耐性を付与する pEUI(+) のドライバーとエフェクターの間に挿入されました。
PEUI(+) の水漏れしたため、活動を評価する私たち subcloned EGFP MCS の EcoRI サイトに (pEUI(+)-EGFP)、一過性プラスミド構築を HEK293 細胞にトランスフェクション、Teb で管理 24 h (の濃度の異なる図 2)。一方、形質転換細胞を蛍光示さなかったモックのベクトル信号 Teb 治療 (図 2 a、 B) に関係なく pEUI (+)-EGFP 形質転換細胞徐々 に Teb (図 2-F の量の増大に敏感だった).もっと重要なは、pEUI (+)-Teb の治療せず EGFP を形質転換細胞が蛍光顕微鏡 (図 2) 任意の検出可能な EGFP 信号を引き出さなかった。
Teb に pEUI(+) の応答性をさらに検証するため、我々 は pEUI(+) の EcoRI サイトにフラグ エピトープ タグANKRD13A遺伝子を subcloned、コンストラクトを HEK293 細胞に移るし、ピューロマイシンを選択を確立する 3 週間のためにそれらを受ける遺伝子のANKRD13A目的のセルの行。Teb 投与 24 時間後ANKRD13A遺伝子の発現解析を行ったし、確立されたセルラインがよく反応 (図 3)。さらに、文化的なメディアから Teb を枯渇させることによって pEUI(+) の遺伝子スイッチの可逆性を示しました。図 3に示すとおり、ANKRD13A 式検出しなくなった Teb 自由な媒体の細胞培養を行ったとき。
図 1.PEUI(+) の模式図.PEUI(+) のベクトル地図 (A) が建設されました。CMV プロモーターは、GvEcR の発現をドライブします。Teb バインド GvEcR を核に若し、10xUAS cisをバインド-MCS に挿入された遺伝子の表現を刺激するために規制シーケンスを演技します。シーケンス (B) についてには、(A) の角かっこの間には、pEUI(+) の全体のエフェクターのシーケンスが含まれています。矢印は、MCS に含まれている個々 の制限酵素認識部位を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.GvEcR ベースの特異遺伝子スイッチの Teb の治療に応答します。指定された DNA を導入させた HEK293 細胞を構築します。トランスフェクションの 24 時間後のセルが指定された濃度で Teb で 24 時間刺激された.EGFP遺伝子活動は、蛍光顕微鏡下で観察しました。PEUI(+) のモック形質転換細胞は (A) と任意の検出可能な蛍光を示さなかったまたは (B) Teb 治療なし。(C-E)PEUI (+) の蛍光強度-EGFP-transfected セルが Teb 用量依存的に増加します。スケール バー、10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.HEK293 細胞安定的遺伝子 pEUI (+)/フラグ ANKRD13A が Teb の管理に可逆応答します。フラグ エピトープ タグ ANKRD13A 式は、Teb (1.5 μ M) 処理によって引き起こされました。Teb と治療の 24 時間後セルは時間の指定された量の Teb ドロップ アウト メディアに切り替えていた。ANKRD13A の相対的な量は、反フラグ抗体を用いたウエスタンブロット法により測定しました。Α-チューブリンの内因性の発現レベルは、コントロールとして抗 α-チューブリン抗体で測定しました。白の印は、正体不明の交差反応性種です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
バイナリの遺伝子発現のスイッチを使用しての主な欠点は同時に目的セルに 2 つの独立したプラスミド (ドライバーとエフェクター) を提供する必要があります。これはプラスミドと誘導1,2,3スイッチの矛盾した応答の結果の不平等な配分につながることができます。2 ベクター システムの別の欠点は、抗生物質の選択の 2 つのラウンドの最小が有望な細胞を識別するために必要なことです。したがって、生物学の研究で使用する 1 つのユニットを構成する遺伝子誘導カセットが求められてきました。PEUI(+) 特異遺伝子発現のスイッチは、transgene 刺激に必要なすべての規制ユニット装備 1 つのベクトルに含まれます。したがって、遺伝子、pEUI(+) で subcloned 誘導レベルはトランスフェクション実験と化学インデューサの投与量でトランスフェクションする DNA 量に依存しています。さらに、我々 はさらにANKRD13A遺伝子15の単一コピーを含む安定したセルラインを生成することによって pEUI(+) ベクトルの使用をテスト.確立されたセルラインの Teb 治療 (図 3) に高感受性を示した。まとめて高感度、可逆性、および低水漏れしたため15、発現レベルのばらつきと pEUI(+) にもターゲット遺伝子発現を操作するための貴重な分子ツールを作る。
誘引可能な遺伝子の様々 なシステム間で我々 は GvEcR 依存性遺伝子誘導カセットを選択します。GvEcR は他のシステムに比べていくつかの利点: まず、化学誘導 (Teb を含む) として使用されるいくつかの脱皮ホルモン類縁体の脂溶性の性質が細胞膜21; の効率的な浸透のために有利な第二に、脊椎動物における EcR 嗅覚がないの関数が核内受容体21,22; を内生表現エクジステロイド アゴニストには影響しませんので第三に、エクジステロイドは脊椎動物に無害と循環システム体内21,23; から急速にクリアそして第四に、多数ホルモンアゴニスト小さい分子の最適なサイズを選択することによって、これまでに開発されているので研究者は望ましくない合併症13,22,24を避けることができます。Teb に高い感度を示していますが、pEUI(+)、その他エクジステロイド アゴニストに pEUI(+) の応答のテスト貴重な証明するかもしれない。Methoxyfenozide などの非ステロイド系の EcR アゴニストの存在 Teb24 pEUI(+) の適用範囲を広げる可能性がありますよりも水に溶けやすいことをであります。PEUI(+) の発現はテトにシステム15よりも比較的弱いが、遺伝子の誘導のレベルは VP16 の転写活性化ドメイン (データは示されていない) の複数のコピーの付加によって増強される可能性が。最近の遺伝子治療の応用が細胞や遺伝病25,26,27によりそれぞれの機能遺伝子産物を持たない組織にターゲット遺伝子の安全な配達に焦点を当てた。ただし、構成組織固有またはウイルスのプロモーターの制御下で規制のない遺伝子はローカル組織損傷28,29の可能性を高めるターゲット遺伝子のハイパー表現を引き出すことができます。したがって、遺伝子療法のための信頼性の高い遺伝子スイッチのアプリケーションでは、不要な合併症を避けることができます。PEUI(+) ベクターは、生物学的および臨床的研究で遺伝子発現を制御するための便利で強力なツールを提供します。現在、我々 のシステムの適用範囲を高めるため GvEcR に基づく特異レンチウイルスベクターを進めています。
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Disclosures
我々 は本レポートに関する利害の対立があります。
Acknowledgments
著者は、貴重なコメントや原稿の徹底的な読み込みのため S Y チェ (大学校) をありがとうございます。この作品は、忠南大学校の研究基金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
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