Summary
이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.
Abstract
대상 유전자의 무작위 mutagenesis 원하는 표현 형을 생성 하는 돌연변이 식별 하기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 무작위 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다 방법의 오류가 PCR는 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 편리 하 고 효율적인 전략 이다 (즉., 돌연변이 도서관). 연구원은 다른 게놈 영역을 영향을 받지 떠나는 동안 유전자의 코딩 지구 같은 미리 정의 된 영역을 변형 하고자 하는 경우 오류가 PCR 방법의 선택입니다. 돌연변이 라이브러리 오류가 PCR에 의해 증폭 되어, 후 적당 한 플라스 미드로 복제 해야 합니다. 오류가 PCR에 의해 생성 된 라이브러리의 크기는 복제 단계의 효율에 의해 제한 됩니다. 그러나, 분열 효 모, Schizosaccharomyces pombe, 복제 단계는 매우 효율적인 원스텝 퓨전 변환에 대 한 구문을 생성 하는 PCR의 사용으로 대체할 수 있습니다. 원하는 고기의 돌연변이 다음 적절 한 기자를 사용 하 여 선택할 수 있습니다. 여기,이 전략 자세하게, 예를 들어, centromeric 섬으로에 삽입 기자 복용 설명 합니다.
Introduction
앞으로 유전학 연구원 추구 특정 표현 형을 표시 하는 자연적 사건 돌연변이 및 유전 분석을 수행 고전적인 방법입니다. 반전 유전학에서 관심사의 유전자에 돌연변이 소개 하 고 표현 형 검사. 후자의 경우 대상 유전자의 무작위 mutagenesis 이후에 온도 감도 등 원하는 고기에 대 한 선택 또는 효소 활동을 변경 하는 돌연변이의 풀을 생성 하 자주 사용 됩니다. 다양 한 방법은 오류가 PCR1;를 포함 하 여 임의의 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다. UV 방사선 조사2. 화학 mutagens, 에틸 methanesulfonate (EMS) 등 질소 산3; - mutD5 4; 표현 등 임시 mutator 긴장의 사용 그리고 DNA5를 걸어 갔다입니다.
여기, 우리는 우리 분열 효 모에 대상 유전자 돌연변이 풀을 생성 하는 오류가 PCR을 이용 하는 반전 유전학 전략을 설명 합니다. 로 한의 이름에서이 메서드는 PCR 동안 일부러 오류를 도입 하 여 돌연변이 생성 합니다. 다른 mutagenesis 방법과 달리 오류가 PCR mutagenized 될 영역을 정의 하는 사용자 수 있습니다. 이것은 관심사의 단백질/도메인의 기능을 연구 하는 노력에 특히 유용 하다.
이 무작위 mutagenesis 절차를 보여, 우리 여기 사용 rpt4 +, 19S 프로테아좀 소 단위를 인코딩하는 예를 들어. Rpt4 분열 효 모6,7,,89, 다른 유기 체에 있는 베이스-독립적인 기능을가지고 표시 되었습니다 및 베이스 결함 단백질을 변경 하 여 간접 효과 일으킬 수 있습니다. 수준입니다. 우리는, 그러므로, 섬으로에 프로테아좀의 기능을 조사 하는 목적으로 베이스-독립적인 변화를 유발 하는 돌연변이 대 한 검사.
오류가 PCR 뇌관을 바인딩할 위치를 조정 하 여 어떤 유전자 영역에 적용할 수 있습니다. 적절 한 기자와 원하는 phenotypic 변화 하는 돌연변이 확인할 수 있습니다. 여기, 우리는 ade6 + 기자 삽입 활용는 centromere 1 외부 반복 (otr) 지역10. Ade6 + 기자 야생-타입 상태;에서 침묵은 그래서 제정 섬으로이 지역11에 형성 된다 이 빨간 식민지10으로 표시 됩니다. Centromere는에 제정 섬으로 destabilizes 하는 돌연변이 ade6 + 기자, 백색 식민지로 시각 이다는 식으로 이어질 것입니다.
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Protocol
1입니다. 미디어 준비
- 준비 효 모 추출 보충 교재 (예), 네 아데닌 (예 로우 에이드), Pombe 조미료 매체 (PMG12), 그리고 PMG 없이 아데닌 (PMG-Ade) 없이 표 1에 설명 된 대로 구성 요소를 혼합 하 여. 예-에이드 (Ade 낮은)와 PMG-에이드 접시 같은 구성 요소를 모두 하지만 아데닌 후자에서 생략 됩니다.
- 다음 소금 (50 x) 주식을 사용: 52.5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L 나24 에 증류수 그래서. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장
- 다음과 같은 비타민을 사용 하 여 (1, 000 x) 주식: 1 g/L pantothenate, 10 g/L 니코틴산 산, 이노 시 톨 10 g/L, 증류수 비오 틴 10 mg/L. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장
- 다음 미네랄을 사용 하 여 (10, 000 x) 주식: 붕 5 g/L, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0.4 g/L MoO3, 1 g/L 0.4 g/L CuSO4·5H2O 기 증류수에 연산 10 g/L. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장
참고: 네 액체 매체는 agar를 생략 하 여 만들 수 있습니다.
- 압력솥 매체 200 rpm의 속도로 저 어 바 교 반 하면서 60 ° C 아래에 그것을 냉각 하 고.
- 예 + G418 (geneticin) 판 예 매체 1 mL/L G418 재고 솔루션을 추가 합니다.
- 다음 G418 사용 (1, 000 x) 주식: 100 mg/mL 증류수에 G418. 필터-20 ° c.에 0.22 μ m 기 공 크기 필터, 1.5 mL 원심 분리기 튜브 및 저장소에 aliquot를 사용 하 여 소독
- 또 다른 5-10 분, 약 수에 대 한 미디어 90 mm 페 트리 접시 (대략 40 접시를 중간 aliquots의 1 L에 저. 4 ° c.에 접시를 저장
2. 복제 rpt4 + 와 그것의 5' / 3' Utr의
- PCR 뇌관 p1와 p2 수행 (그림 1A) 분열을 사용 하 여 50 µ L (~ 1 µ g DNA, 20 U 효소 반응 버퍼 x 1)의 총 볼륨에 템플릿으로 genomic DNA (gDNA)를 효 모 그리고 3,315 베이스 증폭 반응 사이클을 표 2 에 설명 된 적용 쌍 (bp) 조각 rpt4 + 및 그것의 5' / 3' Utr. (그림 1A) 제조업체 지시에 따라 정화 키트13 를 사용 하 여 PCR 제품을 정화.
- PBlueScript KS(-) 벡터14 16 18 물 목욕에서 37 ° C에서 rpt4 + 와 그것의 5' / 3' Utr BamH1 와 Xho1 (~ 1 µ g의 DNA, 효소, U-20-1 x 소화 버퍼) 20 µ L의 전체 볼륨에 포함 된 증폭된 한 DNA 파편을 소화 h (그림 1B)입니다.
- 젤 소화 벡터 (1.2 %agarose 젤)를 정화 하 고 태 기반 agarose 젤 전기 이동 법 (100 V, 1 시간)을 수행, 원하는 크기의 DNA 밴드를 절 개 하 고 젤 추출 키트15DNA를 분리 하 여 DNA 삽입.
- 벡터 및 벡터 DNA의 50-100 ng를 포함 20 µ L 결 찰 반응을 수행 하 여 T4 DNA 리가 사용 하 여 DNA 삽입을 위하여는 ~ 삽입 DNA, 400 U T4 DNA 리가 고 결 찰 버퍼 x 1의 3 어 금 니 과잉. 16-18 h 18 ° C에이 혼합물을 품 어.
- 열 충격 70을 적용 하 여 합자 DNA를 대장균 DH5α의 100 µ L에 변환 42 ° c.에 s 파운드의 1 mL을 추가 하 고 복구에 대 한 37 ° C에서 1 시간에 품 어. 원심 (13,800 x g)를 변형된 대장균 의 모든 파운드-암 피 실린 (라) 접시에 셀 16 h 37 ° C에서 품 어, 표면에 뜨는 접시를 삭제 합니다.
- 이쑤시개와 4-8 식민지를 선택 하 고 하룻밤 3 mL 라 중간에서 37 ° C에서 성장.
- 한 플라스 미드 정화 키트16 제조업체의 프로토콜에 따라 사용 되는 플라스 미드를 분리 하 고 고립 된 플라스 미드, 각 제한 효소 (BamH1 및 의 U 5의 5 µ L로 분석 금지 효소 소화를 수행 Xho1) 제한 버퍼 1. 3 헤 시퀀싱 후보 플라스 미드로 복제 하는 확인에 대 한 물 목욕에서 37 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
3. 침묵 돌연변이 (Xho1 제한 사이트) 소개
- 한 쌍의 33-bp 뇌관 (p3 및 p4) 그렇지 않으면 보완 순서로 원하는 돌연변이 포함 하는 디자인.
- 25 µ L의 전체 볼륨에 높은 중 합 효소17 (그림 1C) PCR을 수행 (10 복제 플라스 미드, 10 pmol 뇌관 믹스, 2 U 효소, 1 x 반응 버퍼 2 µ L의 ng) 자전거 매개 변수를 사용 하 여 표 3에 나열 된.
- DpnI 20 µ L (20 U 효소, 1 x 소화 버퍼) 37 ° c 물에서의 전체 볼륨에 h 1에 대 한 목욕으로 템플릿 플라스 미드를 소화.
- 변환 하 고, 전파 하 고 분리, 한 시퀀싱 단계 2.5-2.7에서에서 설명한 대로 자동 돌연변이 포함 하는 플라스 미드.
참고: 또한 단일 반응18여러 DNA 파편의 합류에 대 한 허용 하는 복제 메서드를 사용 하 여 자동 돌연변이 도입 수 있습니다.
4. 무작위 Mutagenesis의 rpt4 + 오류가 PCR에 의해
- 서식 파일, 뇌관 p5 및 p6, 50 µ L (단계 4.1.1, 10 pmol 뇌관 믹스, 2.5 U 효소, 1 x 반응 버퍼 2 µ L에서에서 정의 하는 서식 파일의 금액)의 총 볼륨으로 침묵 돌연변이 (Xho1 사이트)와 플라스 미드를 사용 하 여 오류가 PCR을 수행 그리고 높은 오류를 생성 하도록 설계 된 특별 한 중 합 효소 평가19 (그림 1D). 표 2에 설명 된 대로 PCR을 수행 합니다.
- 서식 파일 플라스 미드의 4-5 µ g를 사용 하 여 1 bp/kb (kilobase) 돌연변이 주파수를 제어.
참고: 고 농도 (> 500 ng / µ L) 소형 예비 키트20를 사용 하 여 얻을 수 있습니다, 플라스 미드의 필수입니다.
- 서식 파일 플라스 미드의 4-5 µ g를 사용 하 여 1 bp/kb (kilobase) 돌연변이 주파수를 제어.
- 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 확인 (1.2 %agarose 젤) 2670 bp의 PCR 제품. 2.5 단계에서 설명한 대로 젤이 PCR 제품을 정화.
5. 퓨전 PCR 파편 (칸, 3' UTR)의 준비
- 서식 파일, 프라이 머 p 7과 p8,으로 pFA6a KANMX621 을 사용 하 여 PCR을 수행 하 고 마커 (칸) 조각을 표 4에 나열 된 조건. 젤 단계 2.5 (그림 1E)에 설명 된 대로 결과 1480-bp 조각 정화.
- 정지 codon 돌연변이 그것의 인접 한 유전자의 코딩 지구에 대 한 타겟 유전자의 500 이상의 구분 됩니다 경우 확인 혈압. 이 지구는 500 미만 때 생 터미네이터 사용할 수 없습니다 혈압; 오히려, ADH 터미네이터 생 터미네이터 대신 사용 되어야 한다. ADH 터미네이터를 사용 하는 데 필요한 프로토콜 변경 표 5에 표시 됩니다.
참고: 이러한 변경 내용은 ADH 터미네이터 pFA6a-3HA-KANMX6 플라스 미드에서 사용할 수 있는 내 생 터미네이터 대신 사용 하는 경우에 적용 됩니다.
- 정지 codon 돌연변이 그것의 인접 한 유전자의 코딩 지구에 대 한 타겟 유전자의 500 이상의 구분 됩니다 경우 확인 혈압. 이 지구는 500 미만 때 생 터미네이터 사용할 수 없습니다 혈압; 오히려, ADH 터미네이터 생 터미네이터 대신 사용 되어야 한다. ADH 터미네이터를 사용 하는 데 필요한 프로토콜 변경 표 5에 표시 됩니다.
- PCR를 수행 하는 복제 rpt4 +-템플릿과 뇌관 p9, p10 50 µ L의 총 볼륨에서으로 벡터를 포함 (20 복제 플라스 미드, 10 pmol 뇌관 믹스, 2 U 효소, 1 x 반응 버퍼 2 µ L의 ng), 표 6에 제시 하는 조건을 사용 하 여. 젤 정화 획득 506-혈압 3' UTR 조각 (그림 1E).
6. 퓨전 PCR (그림 1E)에 의해 변환 구문이 생성
- 50 ng / µ L에서 3 조각 (mutagenized rpt4 +, 칸, 그리고 3' UTR)를 준비 합니다.
- 퓨전 3의 PCR 파편 뇌관 p11 및 p12를 사용 하 여 표 7에 설명 된 대로 수행 합니다. (융해 PCR 프로토콜은 원래 프로토콜22의 수정입니다.) 주요 4,398 bp의 PCR 제품을 정화.
- Rpt4 +사용: KAN:3'UTR 1의 비율로 조각: 최적의 결과 대 한 3:1.
참고: 삽입 DNA의 총 금액 500을 넘지 말아야 한다 니. Rpt4 +의 권장된 금액: KAN:3' UTR는 50 ng:150 ng:50 ng. Mutagenized 지역에서 약 1.6 kb가 이므로 다른 3 돌연변이 되 고 각 자료의 모든 가능한 조합에 대 한 계정을 것 이라고 하는 효 모 식민지의 최소 수는 1, 600 x 3 = 4800 식민지. 한 변환 반응 일반적으로 400-500 식민지 수율, PCR 건설 융합의 가치가 10 반응 필요 합니다. 이 필요 10의 요인에 의해 단순히 증가 반응 (즉, PCR 튜브의 수)에 의해 충족 될 수 있다.
- Rpt4 +사용: KAN:3'UTR 1의 비율로 조각: 최적의 결과 대 한 3:1.
7. 변화의 Electroporation (그림 1 층)으로 분열 효 모
- 16 시간 이상 배양 하 여 누 룩 채도 예 매체의 10 mL을 접종.
- 600에서 광학 밀도를 셀 희석 예 매체의 0.2에서 200 mL의 nm (OD600)와 OD600 5-6 h 동안 흔들어 30 ° C에 품 어 = 0.6-0.8.
- OD600 세포 집중 = 30, 4 개의 50 mL 원뿔 관에 분배 하 고 10 분 동안 얼음에 진정.
- 4 ° c.에 3 분 1050 x g에서 원심 분리를 수행 하 여 셀을 수확 얼음에 튜브와 10 전기-큐 벳을 놓습니다. 얼음에 7.3 7.8 단계를 수행 합니다.
- 삭제는 상쾌한 고 1.2 M sorbitol의 15 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브 resuspend 세포를 흔들어.
- 1050 x g 4 ° c.에 3 분에 세포를 원심
- 7.4 및 7.5 단계를 반복 합니다. 폐기는 상쾌한. 각 관에 1.2 M sorbitol의 500 µ L을 추가 하 고 셀, resuspend 한 15 ml 원뿔 튜브에 세포의 모든 수집.
- 1.2 M sorbitol 추가 최대 2.4 mL (OD600 = 0.2 mL 당 10). 얼음에 튜브를 유지.
- Sorbitol 중단 셀 (그들은 완전히 일시 중지 되었는지 확인)의 200 µ L 추가 퓨전 PCR을 포함 하는 EP 튜브 구성, 잘, 그리고 전기 멧에 샘플을 전송.
- Electroporate 다음 옵션으로 셀: 버섯, ShS (2.00kV, 1 펄스).
- 800 µ L의 전체 볼륨에 대 한 각 전기 멧을 1.2 M sorbitol의 600 µ L을 추가 하 고 4 예 판 (200 µ L/접시)에 셀을 확산. 10 전기-큐 벳 것 이다 분배 40 예 판.
- 24 h 30 ° C에서 번호판을 품 어.
- 예 + G418 도금 복제를 수행 하 고 3 일 동안 30 ° C에서 번호판을 품 어.
8. 섬으로 불안정 돌연변이 및 판정에 대 한 검사의 선택
- 각 예 + G418 플레이트에 대 한 예-에이드 (Ade 낮은) PMG-에이드 (Ade 없음) 접시를 복제 도금을 수행 합니다. 예-에이드 접시에 식민지의 일부 빨간 채색 (그림 1G) 표시 될 때까지 30 ° C에서 1-2 일에 대 한 복제 판을 품 어.
- 예-에이드와 PMG-에이드와 예 에이드 접시에 분홍색 또는 흰색을 표시 하 고 또한 PMG-에이드 접시에 성장 하는 선택 셀을 비교 합니다. 그들은 가양성 (예를 들어, 칸 카세트는 게놈에서 비 대상 사이트에 통합 되어 반영) PMG-에이드에 성장 없이 식민지를 선택 하지 마십시오.
- 각 식민지에서 약 1 × 105 셀을 선택 하 고 포함 된 식민지 PCR (그림 1 H)에 대 한 시작 템플릿으로 수행 하기 위해이 솔루션의 적어도 30 분 사용 1 µ L 37 ° C에서 2.5 mg/mL zymolyase 100 T SPZ 솔루션의 10 µ L에서 품 어.
- 2m sorbitol의 30 mL, 4.05 mL의 1 M 나2HPO4, 0.95 mL NaH2포4 증류수 (최종 pH 7.5) 15 mL를 혼합 하 여 SPZ (50 mL)을 확인 합니다. 샘플 (5 mL) zymolyase 보충 고 사용까지-20 ° C에서 500 µ L aliquots에 저장 될 수 있습니다.
- 젤 전기 이동 법 (1.2 %agarose 젤, 180V, 20 분)의 결과 + 식민지 PCR 시각화를 수행 합니다. 선택 적절 한 크기의 PCR 악대를 전시 하 고 Xho와 각 반응 제품의 5 µ L를 소화 하는 반응 (4 U 효소, 1 x 소화 버퍼, 37 ° C 물 목욕, 1 시간)을 화면으로 가양성 (그림 1 H).
- XhoI 소화 (1.2 %Agarose 젤, 180 V, 20 분)을 시각화 하기 위해 젤 전기 이동 법을 수행 합니다. 식민지 PCR 제품은 XhoI, 절단 및 예 + G418 번호판 (그림 1I) 패치를 표시 합니다.
- 분열 효 모 세포에서 gDNA를 분리 하 고 PCR 제품23의 시퀀싱을 수행. 돌연변이 (그림 1I)를 식별 하는 야생-타입 시퀀스와 얻은 시퀀스를 비교 합니다.
- 직접 다시 돌연변이 세포23에서 PCR에 의해 증폭 퓨전 구문으로 변환 하 여 야생-타입 셀에 mutation(s)를 소개 합니다. 새로 만든된 돌연변이 세포 (그림 1J)에 표현 형을 확인 하기 위해 안보를 사용 합니다.
- 퓨전 변환 구문을 증폭 하실 수 있습니다 쉽게 PCR에 의해 뇌관 p1와 p10 50 µ L (~ 1 µ g DNA, 20 U 효소 반응 버퍼 x 1)의 총 볼륨에 템플릿으로 돌연변이의 게놈 DNA를 사용 하 고 표 2에에서 설명 된 반응 사이클을 적용 . 구성의 변화 단계 7.1-7.13에 따라 수행할 수 있습니다.
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Representative Results
그림 1 에 설명 된 절차에 따라 인수 Rpt4 돌연변이 식민지의 색상을 평가 하 여 분석할 수 있습니다. 식민지의 색상은 그림 2에 셀 수 감소에 관련 된 접시에 발견 했다. 섬으로 지역에 삽입 기자 ade6 + 야생-타입에 침묵 하 고 예 에이드 접시에 빨간 식민지를 보여줍니다. 일단는 섬으로 불안정 하 고 ade6 + 기자 표현, 백색 식민지 clr4Δ 돌연변이로 예 에이드 접시에 관찰할 수 있습니다. 스크린된 Rpt4 돌연변이 같이 있습니다. rpt4-1 돌연변이 가장 심각한 섬으로 불안을 보여줍니다.
그림 1 : 프로토콜의 도식 대표. (A) PCR 뇌관 1과 2와 수행의 첫 번째 라운드에서 얻은 PCR 제품의 도식 대표. (B) rpt4 + 조각의 복제 제한을 기반으로 합니다. (C) 사이트 감독 mutagenesis 복제 된 벡터의 XhoI 금지 사이트를 추가 하는 침묵 돌연변이 소개 하는 데 사용 됩니다. (D) rpt4 + 지역 코딩 Random mutagenesis 오류가 PCR를 사용 하 여 수행 됩니다. (E) 돌연변이 rpt4 + 조각, 칸 조각 및 3' UTR 조각 퓨전 생성 변환 준비 카세트를 PCR에 의해 결합 됩니다. (F) 분열 효 모 세포는 퓨전 동종 재결합에 의해 생 rpt4 + 시퀀스 대체 PCR 구문으로 변환 됩니다. (G) 칸 선택 식민지 복제 예-에이드 (Ade 낮은)와 PMG-에이드 (Ade 없음) 플레이트, 도금 고 긍정적인 식민지 선택 됩니다. (H) PCR 및 PCR 제품의 후속 XhoI 제한 틀린 확실성을 피하기 위해 사용 됩니다. (I) 표현 형을 일으키는 돌연변이 선택 된 식민지, 셀의 전파, genomic DNA (gDNA)의 추출 및 rpt4 +의 관련 부분의 시퀀싱의 패치으로 식별 됩니다. (J) 원인이 돌연변이 확인 (및 가양성 배제) 직접 야생-타입 세포에 돌연변이 도입 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Rpt4의 섬으로 드 억압 돌연변이. Otr1::ade6 + 기자 (맨 위)의 회로도. 선택 스크린된 Rpt4 돌연변이의 5 직렬 희석 섬으로 불안 (아래)의 수준을 증가의 순서 대로 표시 된 접시에 목격 됐다. 이 수치는 기사에서 '19S 프로테아좀은 직접 참여 섬으로 분열 효 모에의 규칙에 ' 서구 외., 201724로 수정 되었습니다. 비 자른 그림은 원래 문서에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 구성 요소 | 접시의 유형 | |
| 예 | PMG | |
| 효 모 추출 물 | 5 g/L | |
| 포도 당 | 30 g/L | 20 g/L |
| 아데닌 | 0.15 g/L | 0.1 g/L |
| 히스티딘 | 0.15 g/L | 0.1 g/L |
| 신 | 0.15 g/L | 0.1 g/L |
| Uracil | 0.15 g/L | 0.1 g/L |
| 칼륨 수소 pthalate | 3 g/L | |
| 나2HPO4 | 2.2 g/L | |
| L-글루탐산 | 3.75 g/L | |
| 소금 | 20 ml/L | |
| 비타민 | 1 ml/L | |
| 미네랄 | 0.1 ml/L | |
| 한 천 | 16 g/L | 16 g/L |
표 1입니다. 예의 구성 요소와 PMG 플레이트
| 온도 | 시간 | Cycle(s) |
| 95oC | 2 분 | 1 주기 |
| 95oC | 20 s | 30 사이클 |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 분 | |
| 72oC | 8 분 | 1 주기 |
| 8oC | 보류 |
표 2입니다. 사이트 지시 된 mutagenesis에 대 한 권장된 PCR 프로그램
| 온도 | 시간 | Cycle(s) |
| 95oC | 2 분 | 1 주기 |
| 95oC | 30 s | 19 주기 |
| 55oC | 1 분 | |
| 72oC | 7 분 | |
| 72oC | 10 분 | 1 주기 |
| 8oC | 보류 |
표 3입니다. 오류가 PCR 위한 권장된 PCR 프로그램
| 온도 | 시간 | Cycle(s) |
| 95oC | 2 분 | 1 주기 |
| 95oC | 20 s | 30 사이클 |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 분 | |
| 72oC | 8 분 | 1 주기 |
| 8oC | 보류 |
표 4입니다. 칸 조각을 위한 PCR 프로그램 추천
| 변경 | 받는 사람 | 예 rpt4 +의 경우 | |
| 서식 파일 벡터 | pFA6a-3HA-KANMX6 | ||
| P7의 벡터 바인딩 순서 | ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | |
| P 7의 순서를 거 | 정지 codon를 포함 하 여 마지막 50bp 시퀀스 | ||
| P8의 순서를 거 | 바로 정지 codon (보완 시퀀스) 후 첫 번째 50bp 시퀀스 | AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC | |
| P9의 순서 | 정지 codon 후 바로 시작 | tgcacatatatccaaaaagccatgaa | |
| P10의 순서 | 생산 ~ 500bp 조각을 p9 (보완 seqeucne) | TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC | |
표 5입니다. ADH 터미네이터 생 터미네이터 대신 사용 하는 경우 필요한 변경
| 온도 | 시간 | Cycle(s) |
| 95oC | 2 분 | 1 주기 |
| 95oC | 20 s | 30 사이클 |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 1 분 | |
| 72oC | 8 분 | 1 주기 |
| 8oC | 보류 |
표 6입니다. 3' UTR 조각을 위한 PCR 프로그램 추천
| 온도 | 시간 | 진입로 | Cycle(s) |
| 94oC | 2 분 | 1 주기 | |
| 94oC | 20 s | 10 주기 | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2시 30분 분 | 0.2 oC/s | |
| 94oC | 20 s | 5 사이클 | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2시 30분 분 | 0.2 oC/s + 5 s/사이클 | |
| 94oC | 20 s | 10 주기 | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2시 30분 분 | 0.2 oC/s + 20 s/사이클 | |
| 72oC | 10 분 | 1 주기 | |
| 8oC | 보류 |
표 7입니다. 융해 PCR PCR 프로그램 권장된
| CBL1877 | h + | ade6-210 leu1 32 ura4-D18 otr1R (dg-glu) Sph1:ade6 |
이 연구에 사용 된 테이블 S1: 스트레인
이 연구에 사용 된 뇌관의 테이블 S2: 목록
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Discussion
오류가 PCR 통해 임의의 mutagenesis 주어진된 지역에서 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 특정 상황에서 단백질의 기능을 평가 하는 연구에 대 한 특히 유용 합니다. 예, 우리는 여기는 19S 프로테아좀 소 단위, Rpt4, 섬으로 유지 보수에서의 기능을 평가 하기 위해 오류가 PCR을 사용. 변화 하 여 지역 오류가 PCR에 의해 표적으로 하 고 심사 조건 조정, 우리 관심 및 원하는 표현 형에 대 한 스크린의 게놈 영역에서 셀을 변경할 수 있었다. 최근, 스핀 들 극 신체 구성 요소25에서 돌연변이 은닉 하는 분열 효 모 세포를 분리 하는 유사한 방법 사용 되었다.
무작위 mutagenesis의 주요 장점은 모두 비 필수 및 필수 유전자에 적용할 수 있습니다. 필수적인 유전자의 무작위 mutagenesis 세포 생존 능력 지속 될 수 있도록 하는 미묘한 또는 부분적 기능 오류 등 다양 한 돌연변이 또는 돌연변이 그 함수는 특정 조건 에서만 영향을 얻을 수 있습니다. 후자의 예로 온도 민감한 돌연변이 있습니다. 이러한 돌연변이 5 mg/L phloxine B, 빨간색으로 죽어가는 세포 얼룩 하 고 느린-성장 셀 셀26죽어 구별 될 수 있습니다을 사용 하 여 격리 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계 오류가 PCR 단계가입니다. 이 단계에서 그것은 PCR 주기 수 및 서식 파일의 초기 크기에 따라서 넓게 변화할 수 있다 돌연변이 주파수를 제어 하는 것이 중요. 좋습니다는 사용자 PCR 주기 수를 수정 하 고 서식 파일의 초기 크기를 다 우리가이 최적화를 위한 더 편리 하 게 전략을 발견. 우리 주의 오류가 PCR의 기술을 널리 수십 년 동안 왔다. 사용자가 선택, 그들은 수동으로 오류가 PCR27 상용 mutagenesis 키트를 사용 하지 않고 수행 하는 방법을 찾고 있습니다.
주의로이 프로토콜의 잘못 된 긍정적인 평가 보다 높습니다. 따라서, 돌연변이 후보자는 일련의 잘못 된 반응을 제거 하기 위한 검 진을 받아야 한다. 우리는 대상 유전자에 제한 사이트의 자동 법인 시퀀싱의 상대적으로 힘 드는 단계로 주제 가양성 필요가 없도록 도울 수 있다 발견. 이것은 비용, 또는 넘어 수백에 돌연변이 후보 번호 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트에 대 한 지원 자금 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 과학과 ICT (2016R1A2B2006354)에 의해 자금에 의해 제공 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
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