Summary
توضح هذه المقالة منهجية مفصلة للطفرات العشوائية الجينات الهدف في الأنشطار الخميرة. على سبيل مثال، نحن نستهدف rpt4 +، الذي يشفر وحدة فرعية بروتوزوم 19S، وشاشة للطفرات التي تزعزع استقرار هيتيروتشروماتين.
Abstract
عشوائية الطفرات الجينات المستهدفة يستخدم عادة لتحديد الطفرات التي تسفر عن النمط الظاهري المطلوب. من الأساليب التي يمكن استخدامها لتحقيق الطفرات العشوائية، بكر عرضه للخطأ وضع استراتيجية ملائمة وفعالة لتوليد مجموعة متنوعة من طفرات (أي.، مكتبة متحولة). بكر عرضه للخطأ هو الأسلوب المفضل عندما يسعى باحث إلى التحور منطقة محددة مسبقاً، مثل منطقة ترميز الجينات بينما يترك مناطق الجينوم أخرى لم تتأثر. بعد أن يتم تضخيمه المكتبة متحولة ببكر عرضه للخطأ، يجب المستنسخة إلى بلازميد مناسبة. حجم المكتبة التي تم إنشاؤها بواسطة PCR عرضه للخطأ مقيد بكفاءة الخطوة الاستنساخ. ومع ذلك، في انشطار الخميرة، شيزوساكتشاروميسيس بومبي، يمكن استبدال الخطوة الاستنساخ باستخدام الانصهار خطوة واحدة ذات كفاءة عالية PCR لإنشاء بنيات للتحول. ثم يمكن تحديد طفرات تعمل المطلوب استخدام الصحفيين المناسبة. هنا، نحن وصف هذه الاستراتيجية بالتفصيل، آخذا على سبيل مثال، مراسل إدراجها في هيتيروتشروماتين سينتروميريك.
Introduction
علم الوراثة إلى الأمام هو أسلوب كلاسيكية التي تسعى طفرات تحدث بشكل طبيعي النمط الظاهري خاصة عرض الباحثين، وإجراء التحليلات الجينية. في علم الوراثة، وعكس تدخل الطفرات في جينات للفائدة وبحثها في النمط الظاهري. في هذه الحالة الأخيرة، غالباً ما يستخدم عشوائية الطفرات الجينات المستهدفة لتوليد مجموعة المسوخ التي تم تحديدها فيما بعد لتعمل المطلوب، مثل حساسية درجة الحرارة أو تغيير النشاط الأنزيمي. يمكن استخدام أساليب مختلفة لتحقيق الطفرات العشوائية، بما في ذلك عرضه للخطأ PCR1؛ إشعاع الأشعة فوق البنفسجية2؛ والمطفرات الكيميائية، مثل إيثيل ميثانيسولفوناتي (EMS) أو حمض النيتروز3؛ استخدام سلالات mutator مؤقتة، مثل تلك الإفراط معربا عن mutD5 4؛ والدنا5.
وهنا يصف لنا استراتيجية عكس-علم الوراثة التي نستخدم PCR عرضه للخطأ لإنشاء تجمعات متحولة لجينات مستهدفة في انشطار الخميرة. كما قد تخمين واحد من اسمها، ينشئ هذا الأسلوب الطفرات عن طريق إدخال أخطاء عمدا خلال PCR. خلافا لسائر الأساليب الطفرات، بكر عرضه للخطأ يسمح للمستخدم بتحديد المنطقة لتكون موتاجينيزيد. هذا يجعلها مفيدة بشكل خاص في الجهود الرامية إلى دراسة وظيفة البروتين/مجال الاهتمام.
وللتدليل على هذا الإجراء الطفرات العشوائية، هنا نستخدم rpt4 +، والذي يقوم بترميز فرعية بروتوزوم 19S، على سبيل مثال. Rpt4 قد ثبت أن لها وظائف مستقلة بروتيوليسيس في الكائنات الحية خلاف انشطار الخميرة6،7،،من89، ويمكن أن يسبب وجود عيب في بروتيوليسيس الآثار غير المباشرة بتغيير البروتينات المستويات. أننا، لذلك، فحص لطفرات التي أدت إلى التغييرات proteolysis المستقلة، بهدف التحقيق في وظيفة بروتوزوم في هيتيروتشروماتين.
يمكن تطبيقها على أي منطقة الجين PCR عرضه للخطأ بضبط المكان الذي ربط الإشعال. ويمكن تحديد طفرات تحدث التغيير المنشود المظهرية مع الصحفيين المناسبة. هنا، يمكننا الاستفادة من مراسل ade6 + إدراج كرر 1 الخارجي في السنترومير منطقة (otr)10. ويتكون heterochromatin التأسيسي في هذه المنطقة11، حتى يتم إسكات المراسل ade6 + في حالة البرية من نوع؛ يتم الإشارة إلى هذه المستعمرات الأحمر10. طفرة يزعزع heterochromatin التأسيسي في السنترومير سيؤدي إلى التعبير عن ade6 + المراسل، الذي هو تصور كمستعمرات بيضاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام
- يعد "استخراج الخميرة" مع ملاحق (نعم)، نعم دون الأدنين (نعم منخفضة Ade)، غلوتامات بومبي المتوسطة (فريق رصد السلام12)، وفريق رصد السلام دون الأدنين (فريق رصد السلام-أدى) بخلط المكونات كما هو موضح في الجدول 1. نعم-Ade (Ade منخفضة) ولوحات Ade فريق رصد السلام جميعا من نفس المكونات ولكن محذوفاً الأدنين من هذا الأخير.
- استخدم الأسهم الملح (50 س) التالية: 2 غرام/لتر Na2حتى4 في الماء المقطر، 50 غرام/لتر بوكل 52.5 غرام/لتر مجكل2·6H2س، 2 غرام/لتر كاكل2·2H2س. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- استخدام فيتامين التالية (1، 000 x) الأوراق المالية: بانتوثينات 1 غرام/لتر، 10 غرام/لتر حمض النيكوتينيك، اينوزيتول 10 غرام/لتر، البيوتين 10 مغ/لتر في الماء المقطر. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- استخدام المعادن التالية (10، 000 x) الأوراق المالية: 5 غرام/لتر الماء المقطر، 4 غرام/لتر منسو4, 4 غرام/لتر زنسو4·7H2س، 2 غرام/لتر فيكل2·4H2س، 0.4 غرام/لتر مو3، 1 غرام/لتر كي، 0.4 غرام/لتر CuSO4·5H2س ، حامض الستريك 10 غرام/لتر في الماء المقطر. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن إجراء المتوسطة نعم السائل بإهمال في أجار.
- اﻷوتوكﻻف المتوسطة وباردة إلى أدناه 60 درجة مئوية بينما التحريك مع شريط ضجة، بمعدل 200 لفة في الدقيقة.
- لوحات نعم + G418 (جينيتيسين)، إضافة 1 مل/لتر G418 حل الأسهم المتوسطة نعم.
- استخدام G418 التالية (1، 000 x) الأوراق المالية: 100 مغ/مل G418 في الماء المقطر. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر، الكوة إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي، ومخزن في-20 درجة مئوية.
- يقلب لآخر دقيقة 5-10 وقاسمه وسائط الإعلام في أطباق بتري 90 ملم (1 لتر مختبرين المتوسط إلى ما يقرب من 40 بيتري الأطباق. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية.
2-استنساخ rpt4 + ولها 5/3 ' تحيلها
- إجراء PCR مع الإشعال p1 و p2 (الشكل 1A) استخدام الأنشطار خميرة الحمض النووي (جدنا) كالقالب في إجمالي حجم 50 ميليلتر (~ 1 ميكروغرام الحمض النووي، إنزيم يو 20، 1 x رد فعل المخزن المؤقت)، وتطبيق دورات الرد المبين في الجدول 2 إلى تضخيم قاعدة 3,315 تتألف من rpt4 + ولها 5/3 ' تحيلها يفتت زوج (bp). تنقية المنتج PCR باستخدام أدوات تنقية13 حسب توجيهات الشركة المصنعة (الشكل 1A).
- هضم متجه KS(-) ببلويسكريبت14 والجزء تضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على rpt4 + مع به 5/3 ' تحيلها مع BamH1 و Xho1 في إجمالي حجم 20 ميليلتر (~ 1 ميكروغرام الحمض النووي، إنزيم يو 20، 1 x الهضم العازلة) عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ل 16-18 (ح) (الشكل 1B).
- هلام تطهير ناقلات هضمها (1.2% [اغروس] هلام) وإدراج الحمض النووي بأداء على أساس تاي [اغروس] هلام التفريد (100 V، ح 1) ونسق عصابات الحمض النووي بالأحجام المطلوبة، وعزل الحمض النووي مع مجموعة أدوات استخراج جل15.
- اضطر إدراج الحمض النووي باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى بأداء فعل ربط 20 ميليلتر يحتوي على 50-100 نانوغرام من ناقلات الحمض النووي، والمتجهة ~ فائض المولى 3-fold في الحمض النووي إدراج و 400 "ش T4 الحمض النووي" ليجاسى 1 × ربط المخزن المؤقت. احتضان هذا الخليط عند 18 درجة مئوية ح 16-18.
- تحويل الحمض النووي الواصلة إلى 100 ميليلتر من DH5α كولاي عن طريق تطبيق الصدمة الحرارة 70 s في 42 درجة مئوية. أضف 1 مل رطل واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية للانتعاش. إجراء الطرد المركزي (13,800 س ز)، وتجاهل لوحة طافية، كل من تحول كولاي الخلايا على ألواح الأمبيسلّين رطل (لوس أنجليس)، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 16.
- اختيار المستعمرات 4-8 مع المسواك وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في المتوسط 3 مل لوس أنجليس.
- عزل البلازميدات مع مجموعة أدوات تنقية بلازميد16 المستخدمة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، وأداء ديجيسشنز إنزيم التقييد التحليلية مع 5 ميليلتر من بلازميد معزولة، 5 ش كل إنزيم التقييد (BamH1 و Xho1) و 1 × تقييد المخزن المؤقت. احتضان الخليط رد فعل على 37 درجة مئوية في حمام مائي حاء 3 تأكيد استنساخ حسب تسلسلها والبلازميدات المرشح.
3-الأخذ بالطفرة الصامتة (موقع تقييدXho1 )
- تصميم زوج من الإشعال 33-بي بي (p3 و p4) التي تحتوي على الطفرة المنشودة في تسلسل وإلا مكملة.
- إجراء PCR مع عالية الدقة بوليميريز17 (الشكل 1) في إجمالي حجم 25 ميليلتر (10 نانوغرام بلازميد المستنسخة، 2 ميليلتر 10 pmol التمهيدي مزيج، إنزيم يو 2، 1 x رد فعل المخزن المؤقت) استخدام الدراجات المعلمات المسرودة في الجدول 3.
- هضم بلازميد القالب مع Dpnفي إجمالي حجم 20 ميليلتر (20 إنزيم يو، س 1 الهضم العازلة) عند 37 درجة مئوية في مياه حمام لح 1.
- تحويل ونشر، وعزل، وتسلسل بلازميد يحتوي على الطفرة الصامتة، كما هو موضح في الخطوات 2.5 2.7.
ملاحظة: يمكن أيضا إدخال الطفرة الصامت باستخدام أسلوب استنساخ الذي يسمح بضم عدة شظايا من الحمض النووي في رد واحد18.
4-عشوائية الطفرات rpt4 + ببكر عرضه للخطأ
- إجراء PCR عرضه للخطأ، باستخدام بلازميد مع الطفرة الصامتة (موقعXho1 ) كالقالب، p5 الإشعال و p6، إجمالي حجم 50 ميليلتر (مقدار القالب المحدد في الخطوة 4.1.1، 2 ميليلتر ميكس التمهيدي pmol 10، 2.5 يو الإنزيم، 1 x رد فعل المخزن) ، وبوليميريز خاصة التي تم تصميمها لإنشاء خطأ عالية معدل19 (الشكل 1). تنفيذ بكر كما هو موضح في الجدول 2.
- استخدام 4-5 ميكروغرام من بلازميد القالب للتحكم في وتيرة الطفرة إلى بي بي 1/كيلوبايت (كيلوبس).
ملاحظة: تركيزات عالية (> 500 نانوغرام/ميليلتر) من بلازميد، التي يمكن الحصول عليها باستخدام طقم الإعدادية المصغر20، مطلوب.
- استخدام 4-5 ميكروغرام من بلازميد القالب للتحكم في وتيرة الطفرة إلى بي بي 1/كيلوبايت (كيلوبس).
- استخدم جل التفريد لتأكيد منتج PCR من 2670 bp (1.2% [اغروس] هلام). هلام تنقية هذا المنتج بكر كما هو موضح في الخطوة 2، 5.
5-إعداد الانصهار PCR شظايا (أساسه، 3 ' UTR)
- إجراء PCR باستخدام pFA6a-KANMX621 كقالب، p7 الإشعال و p8، والشروط المدرجة في الجدول 4 للحصول على الجزء ماركر (كان). هلام تطهير الجزء 1,480-بي بي الناتجة كما هو موضح في الخطوة 2، 5 (الشكل 1E).
- تحقق إذا كان كودون التوقف من الجينات المستهدفة لمنطقة ترميز الجينات المتاخمة لها والطفرات مفصولة بأكثر من 500 شركة بريتيش بتروليوم. لا يجوز استخدام فاصل الذاتية عند هذه المنطقة هو أقل من 500 bp؛ بدلاً من ذلك، يجب استخدام فاصل ADH بدلاً من فاصل الذاتية. وترد في الجدول 5البروتوكول التغييرات المطلوبة لاستخدام فاصل ADH .
ملاحظة: هذه التغييرات تنطبق فقط عندما يتم استخدام فاصل ADH ، ومتاح في بلازميد pFA6a-3HA-KANMX6، بدلاً من فاصل الذاتية.
- تحقق إذا كان كودون التوقف من الجينات المستهدفة لمنطقة ترميز الجينات المتاخمة لها والطفرات مفصولة بأكثر من 500 شركة بريتيش بتروليوم. لا يجوز استخدام فاصل الذاتية عند هذه المنطقة هو أقل من 500 bp؛ بدلاً من ذلك، يجب استخدام فاصل ADH بدلاً من فاصل الذاتية. وترد في الجدول 5البروتوكول التغييرات المطلوبة لاستخدام فاصل ADH .
- أداء بكر مع استنساخ rpt4 +--التي تحتوي على ناقل p9 القالب والإشعال و p10 في إجمالي حجم 50 ميليلتر (20 نغ بلازميد المستنسخة، 2 ميليلتر 10 pmol التمهيدي مزيج، إنزيم يو 2، 1 x رد فعل المخزن المؤقت)، استخدام الشروط الواردة في الجدول 6. هلام تنقية UTR الجزء المتحصل عليها 506-بي بي 3 ' (الشكل 1E).
6-جيل بناء التحول من الانصهار بكر (الشكل 1E)
- إعداد الأجزاء 3 (موتاجينيزيد rpt4 +واساسه و 3 ' UTR) في 50 نانوغرام/ميليلتر.
- أداء الانصهار PCR الثلاث شظايا استخدام كبسولة تفجير p11 p12، كما هو موضح في الجدول 7. (بروتوكول للانصهار PCR إدخال تعديل على البروتوكول الأصلي22). تنقية المنتج بكر 4,398-بي بي الرئيسية.
- استخدام rpt4 +: KAN:3 ' UTR شظايا بنسبة 1:3:1 لتحقيق أفضل النتائج.
ملاحظة: ينبغي إلا يتجاوز المبلغ الإجمالي من الحمض النووي إدراج 500 نانوغرام. الكمية الموصى بها من rpt4 +: KAN:3 ' UTR 50 نانوغرام ng:50 ng:150. منطقة موتاجينيزيد حوالي 1.6 كيلوبايت، ذلك هو الحد الأدنى لعدد من المستعمرات الخميرة التي ستمثل كافة التركيبات الممكنة لكل قاعدة يجري تحور إلى الثلاثة الآخرين 1,600 x 3 = 4,800 المستعمرات. لأن عادة غلة رد فعل التحول واحد 400-500 المستعمرات، مطلوب على الأقل 10 ردود الفعل يستحق الانصهار بكر بناء. ويمكن تلبية هذه الحاجة ببساطة زيادة مقدار رد الفعل (أي عدد أنابيب PCR) بمعامل قدرة عشرة.
- استخدام rpt4 +: KAN:3 ' UTR شظايا بنسبة 1:3:1 لتحقيق أفضل النتائج.
7-تحول خميرة الأنشطار قبل انهانسر (الشكل 1F)
- تطعيم الخميرة إلى 10 مل متوسطة نعم للتشبع بحضانة أنه لأكثر من 16 ح.
- تمييع الخلايا كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD600) 0.2 في 200 مل من نعم المتوسطة واحتضان عند 30 درجة مئوية مع الهز ح 5-6، إلى OD600 = 0.6-0.8.
- تركز الخلايا إلى OD600 = 30، الاستغناء عن إلى أربعة أنابيب مخروطية 50 مل والبرد على الجليد لمدة 10 دقائق.
- حصاد الخلايا عن طريق إجراء الطرد المركزي في 1,050 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. وضع الأنابيب والكهربائية 10-الترعة على الجليد. نفذ الخطوات 7.3 7.8 على الجليد.
- تجاهل المادة طافية وإضافة 15 مل السوربيتول 1.2 متر. بلطف يهز الأنابيب ريسوسبيند الخلايا.
- الطرد المركزي الخلايا في ز x 1050 لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- كرر الخطوات من 7، 4 و 7-5. تجاهل المادة طافية. إضافة 500 ميليلتر من السوربيتول 1.2 متر لكل أنبوبة، ريسوسبيند الخلايا، وجمع كافة الخلايا في أحد أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.
- إضافة السوربيتول 1.2 متر يصل إلى 2.4 مل (OD600 = 10 كل 0.2 مل). الاحتفاظ بالانبوب على الجليد.
- إضافة 200 ميليلتر الخلايا علقت السوربيتول (تأكد من أنها علقت تماما) لأنبوب الجيش الشعبي التي تحتوي على الانصهار PCR بناء ومزيج جيد ونقل العينة إلى الكهربائية-ومبومو.
- اليكتروبوراتي الخلايا مع الخيارات التالية: الفطريات، وشبكات الطاقة الشمسية المنزلية (2.00kV، نبض 1).
- إضافة 600 ميليلتر من السوربيتول 1.2 متر لكل الكهربائية ومبومو لإجمالي حجم 800 ميليلتر ومن ثم انتشار الخلايا على أربع لوحات نعم (200 ميليلتر في اللوحة). سوف تستغني عشرة الكهربائية-الترعة إلى 40 نعم لوحات.
- احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية ح 24.
- قم بالطلاء النسخ المتماثلة إلى نعم + G418 واحتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
8-اختيار طفرات Heterochromatin-المزعزعة للاستقرار، والتحقق من وجود إيجابيات كاذبة
- لكل لوحة نعم + G418، نفذ الطلاء النسخ المتماثلة إلى نعم-Ade (Ade منخفضة) ولوحات فريق رصد السلام-Ade (لا أدى). احتضان لوحات متماثلة لعدة أيام 1-2 في 30 درجة مئوية، حتى تظهر بعض المستعمرات على لوحات Ade نعم تلوين أحمر (الشكل 1).
- مقارنة لوحات Ade نعم وفريق رصد السلام-أدى وحدد الخلايا التي تظهر الوردي أو الأبيض على لوحة Ade نعم وتنمو أيضا في لوحة فريق رصد السلام Ade. لا تقم بتحديد المستعمرات دون نمو في فريق رصد السلام-أدى، كما أنها نتائج إيجابية خاطئة (مثلاً، مما يعكس أن الكاسيت كان قد أدمج في موقع غير المستهدفة في أماكن أخرى في الجينوم).
- اختيار حوالي 1 × 105 خلايا من كل مستعمرة واحتضان في 10 ميليلتر من محلول سبز يحتوي على 2.5 ملغ/مل زيمولياسي 100 طن في 37 درجة مئوية على الأقل 30 دقيقة ميليلتر 1 استخدام هذا الحل لأداء كقالب البداية مستعمرة [بكر] (الشكل 1 ح).
- جعل سبز (50 مل) بالاختلاط 30 مل السوربيتول م 2، مل 4.05 م 1 غ2هبو4، 0.95 مل نة2بو4 و 15 مل من الماء المقطر (pH النهائي، 7.5). يمكن استكمالها مع زيمولياسي وتخزينها في مختبرين 500 ميليلتر في-20 درجة مئوية حتى استخدام عينات (5 مل).
- إجراء التفريد هلام (1.2% [اغروس] هلام، 180V، 20 دقيقة) لتصور النتائج + المستعمرة [بكر]. تحديد ردود الفعل التي يحمل عصابات PCR بالحجم المناسب وهضم 5 ميليلتر لكل منتج رد فعل مع زهوالأول (4 إنزيم يو، س 1 الهضم المخزن المؤقت، وحمام الماء 37 درجة مئوية، ح 1) لحجب إيجابيات كاذبة (ح الشكل 1).
- إجراء التفريد جل لتصور النبذ إكسهوي (1.2% [اغروس] هلام، 180 الخامس، 20 دقيقة). وضع علامة على المستعمرات منتجات PCR الذي يتم قطع زهوي، والتصحيح لهم إلى لوحات نعم + G418 (الرقم 1I).
- عزل جدنا من خلايا الخميرة الأنشطار وإجراء تسلسل ل منتجات PCR23. قارن تسلسل الحصول عليها مع تسلسل البرية من نوع تحديد الطفرات (1I الشكل).
- مباشرة إعادة إدخال mutation(s) إلى البرية من نوع الخلايا بتحويلها مع ثوابت الانصهار تضخيمه ببكر من خلايا متحولة23. استخدام اكتشاف للتأكد من النمط الظاهري في خلايا متحولة قدم حديثا (1J الشكل).
- يمكن تضخيمه بناء الانصهار التحول بسهولة من بكر مع p1 الإشعال و p10 استخدام الحمض النووي الجينومي لطفرات كالقالب في إجمالي حجم 50 ميليلتر (~ 1 ميكروغرام الحمض النووي، إنزيم يو 20، 1 x رد فعل المخزن المؤقت)، وتطبيق دورات الرد المبين في الجدول 2 . يمكن أن يتم تحول بنية باتباع الخطوات 7.1 7.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن تحليل طفرات Rpt4 المكتسبة عن طريق اتباع الإجراءات المبينة في الشكل 1 بتقييم ألوان المستعمرات. تم اكتشاف ألوان المستعمرات على لوحات ذات الصلة في تناقص عدد الخلايا في الشكل 2. هو إسكات في البرية من نوع المراسل ade6 + إدراجها في منطقة هيتيروتشروماتين وتظهر المستعمرات الحمراء في لوحة نعم Ade. مرة واحدة هو زعزعة الاستقرار في هيتيروتشروماتين، وهو أعرب عن مراسل ade6 + ، يمكن ملاحظة مستعمرات بيضاء في لوحة Ade نعم كما هو الحال في clr4Δ المسخ. يتم فرزهم طفرات Rpt4 كما هو موضح. يظهر المسخ rpt4-1 في زعزعة هيتيروتشروماتين أشد.
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي للبروتوكول. (أ) التمثيل التخطيطي للمنتج PCR التي حصل عليها الجولة الأولى من بكر، التي تتم مع الإشعال 1 و 2. (ب) على أساس تقييد استنساخ الجزء rpt4 + . (ج) يستخدم الطفرات موقع توجيه ناقل المستنسخة لإدخال طفرة صامتة التي تضيف موقع تقييد زهوي . (د) تتم الطفرات العشوائية rpt4 + ترميز المنطقة باستخدام PCR عرضه للخطأ. (ه) الجزء تحور rpt4 + والجزء كان UTR الجزء 3 ' هي انضم إلى الانصهار PCR لتوليد كاسيت جاهز للتحول. (و) يتم تحويل خلايا الخميرة الأنشطار مع الانصهار بناء بكر، الذي يحل محل التسلسل الذاتية rpt4 + باقترانها مثلى. (ز) تحديد أساسه المستعمرات هي طبق الأصل مطلي بنعم-Ade (Ade منخفضة) ولوحات فريق رصد السلام-Ade (لا أدى)، ويتم اختيار المستعمرات الإيجابية. (ح) بكر وتقييد زهوي اللاحقة للمنتج PCR تستخدم لتجنب المغلوطة. (ط) أن الطفرة التي تسبب النمط الظاهري تم تعريفها بواسطة الترقيع المستعمرات مختارة، وإكثار الخلايا، واستخراج الحمض النووي (جدنا)، وتسلسل من الجزء ذي الصلة من rpt4 +. (ي) وأكد الطفرات المسببة (وهي استبعد المغلوطة) بإدخال الطفرة إلى البرية من نوع الخلايا مباشرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : هيتيروتشروماتين دي القمع طفرات من Rpt4- رسم تخطيطي لمراسل otr1::ade6 + (أعلى). كانت رصدت تخفيف المسلسل 5 إضعاف من تحديد طفرات Rpt4 فرزهم على لوحات المشار إليها في النظام لزيادة مستوى heterochromatin زعزعة الاستقرار (أسفل). تم تعديل هذا الرقم من المادة 'بروتوزوم 19S ويشارك مباشرة في تنظيم heterochromatin تنتشر في انشطار الخميرة' من كبار المسئولين الاقتصاديين et al., 201724. يمكن العثور على هذا الرقم غير اقتصاص في المقالة الأصلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المكون | نوع اللوحة | |
| نعم | فريق رصد السلام | |
| استخراج الخميرة | 5 غرام/لتر | |
| الجلوكوز | 30 جرام/لتر | 20 غرام/لتر |
| الأدنين | 0.15 غرام/لتر | 0.1 جرام/لتر |
| الحامض الأميني | 0.15 غرام/لتر | 0.1 جرام/لتر |
| لوسين | 0.15 غرام/لتر | 0.1 جرام/لتر |
| اليوراسيل | 0.15 غرام/لتر | 0.1 جرام/لتر |
| بثالاتي الهيدروجين بوتاسيوم | 3 غرام/لتر | |
| غ2هبو4 | 2.2 غرام/لتر | |
| حمض الجلوتاميك L | 3.75 g/L | |
| الأملاح | 20 مل/لتر | |
| الفيتامينات | 1 مل/لتر | |
| المعادن | 0.1 مل/لتر | |
| أجار | 16 غرام/لتر | 16 غرام/لتر |
الجدول 1. مكونات نعم ولوحات فريق رصد السلام
| درجة الحرارة | الوقت | Cycle(s) |
| ج 95س | 2 دقيقة | دورة 1 |
| ج 95س | 20 s | دورات 30 |
| ج 55س | 30 s | |
| ج 72س | 2 دقيقة | |
| ج 72س | 8 دقيقة | دورة 1 |
| ج 8س | عقد |
الجدول 2. برنامج PCR الموصى بها للطفرات توجه الموقع
| درجة الحرارة | الوقت | Cycle(s) |
| ج 95س | 2 دقيقة | دورة 1 |
| ج 95س | 30 s | دورات 19 |
| ج 55س | 1 دقيقة | |
| ج 72س | 7 دقيقة | |
| ج 72س | 10 دقيقة | دورة 1 |
| ج 8س | عقد |
الجدول 3. برنامج بكر أوصى لبكر عرضه للخطأ
| درجة الحرارة | الوقت | Cycle(s) |
| ج 95س | 2 دقيقة | دورة 1 |
| ج 95س | 20 s | دورات 30 |
| ج 55س | 30 s | |
| ج 72س | 2 دقيقة | |
| ج 72س | 8 دقيقة | دورة 1 |
| ج 8س | عقد |
الجدول 4. وأوصى البرنامج بكر للحصول على جزء على أساسه
| تغيير | إلى | مثال على حالة rpt4 + | |
| ناقل القالب | pFA6a-3HA-KANMX6 | ||
| ناقلات--ربط تسلسل p7 | أتاكجكتجكتكاجتجكتجا | تجكتجاككتجاجااكتجاجتاكاتجاتاككاااجكتتاج أتاكجكتجكتكاجتجكتجا | |
| معلقة تسلسل p7 | تسلسل 50bp الماضي بما في ذلك كودون التوقف | ||
| تسلسل معلق من p8 | تسلسل 50bp الأول الحق بعد كودون التوقف (تسلسل التكميلية) | جاتكجاجكتكجتتااك آتكتتكاتكجتااكتاتكاتتتكاتجكتتتتجاتاتاتجتجكا | |
| تسلسل p9 | بداية صحيحة بعد كودون التوقف | تجكاكاتاتاتككااااجككاتجا | |
| تسلسل p10 | إنتاج ~ يفتت 500bp مع p9 (سيقيوكني التكميلية) | تاجاكجتتتتككتكجتتكتتجتك | |
الجدول 5. التغييرات المطلوبة عند استخدام فاصل ADH بدلاً من فاصل الذاتية
| درجة الحرارة | الوقت | Cycle(s) |
| ج 95س | 2 دقيقة | دورة 1 |
| ج 95س | 20 s | دورات 30 |
| ج 55س | 30 s | |
| ج 72س | 1 دقيقة | |
| ج 72س | 8 دقيقة | دورة 1 |
| ج 8س | عقد |
الجدول 6. وأوصى البرنامج بكر للحصول على الجزء 3 ' UTR
| درجة الحرارة | الوقت | منحدر | Cycle(s) |
| 94سج | 2 دقيقة | دورة 1 | |
| 94سج | 20 s | 10 دورات | |
| ج 70س | 1 s | ||
| ج 55س | 30 s | 0.1 سج/s | |
| ج 68س | 02:30 دقيقة | ج 0.2 o/s | |
| 94سج | 20 s | 5 دورات | |
| ج 70س | 1 s | ||
| ج 55س | 30 s | 0.1 سج/s | |
| ج 68س | 02:30 دقيقة | 0.2 سج/s + s 5/دورة | |
| 94سج | 20 s | 10 دورات | |
| ج 70س | 1 s | ||
| ج 55س | 30 s | 0.1 سج/s | |
| ج 68س | 02:30 دقيقة | 0.2 سج/s + s/دورة 20 | |
| ج 72س | 10 دقيقة | دورة 1 | |
| ج 8س | عقد |
الجدول 7. برنامج PCR الموصى بها للانصهار بكر
| CBL1877 | h + | otr1R ade6-210 leu1-32 ura4-D18 (dg-غلو) Sph1:ade6 |
الجدول S1: السلالة المستخدمة في هذه الدراسة
الجدول S2: قائمة الإشعال المستخدمة في هذه الدراسة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطفرات العشوائية عن طريق PCR عرضه للخطأ أداة قوية لتوليد مجموعة متنوعة من طفرات في منطقة بعينها. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للدراسات التي تسعى إلى تقييم الدالة بروتين تحت ظرف معين. على سبيل المثال، استخدمنا هنا بكر عرضه للخطأ لتقييم وظيفة فرعية بروتوزوم 19S، Rpt4، في الحفاظ على هيتيروتشروماتين. باختلاف المنطقة المستهدفة ببكر عرضه للخطأ وتعديل شروط الفحص، استطعنا أن تتحول الخلايا في منطقة الجينوم للفائدة وشاشة للنمط الظاهري المطلوب. في الآونة الأخيرة، استخدمت طريقة مماثلة لعزل خلايا الخميرة الأنشطار إيواء الطفرات في محور الدوران القطب الجسم المكون25.
أن الميزة الأساسية للطفرات العشوائية أن فإنه يمكن تطبيقها على الجينات غير ضرورية وأساسية. قد تسفر عن الطفرات العشوائية من الجينات الأساسية طفرات متنوعة، مثل المصابين بعيوب وظيفية خفية و/أو جزئية أن السماح ببقاء الخلية أن تكون مستدامة، أو طفرات تتأثر وظائفها إلا تحت شرط معين. مثال على هذا الأخير متحولة حساسة للحرارة. قد تكون هذه طفرات المعزولة باستخدام فلوكسيني 5 مغ/لتر ب البقع خلايا يموتون باللون الأحمر وتمكن الخلايا النمو البطيء يمكن تمييزها عن موت الخلايا26.
أن الخطوة الحاسمة لهذا البروتوكول هو الخطوة PCR عرضه للخطأ. من المهم في هذه الخطوة، للتحكم في وتيرة الطفرة، التي يمكن أن تختلف على نطاق واسع اعتماداً على عدد دورات بكر والكمية الأولية للقالب. نوصي بأن المستخدم تحديد عدد دورات بكر وتختلف كمية أولية من قالب، كما وجدنا هذا أن تكون استراتيجية أكثر ملاءمة للتحسين. ونلاحظ أن تقنية PCR عرضه للخطأ كانت متاحة على نطاق واسع لعدة عقود. إذا اختار المستخدم، قد يلتمسون وسيلة لأداء عرضه للخطأ بكر27 يدوياً دون استخدام عدة الطفرات متاحة تجارياً.
كتحذير، معدل الإيجابية الكاذبة لهذا البروتوكول عالية بدلاً من ذلك. وهكذا، ينبغي أن يخضع المرشحون متحولة سلسلة من العروض التي تهدف إلى التخلص من إيجابيات كاذبة. ووجدنا أن الصمت إدراج موقع التقييد في الجينات المستهدفة يمكن أن تساعد على تجنب الحاجة إلى موضوع المغلوطة لخطوة شاقة نسبيا من التسلسل. هذا فعالة من حيث التكلفة، كما قد عدد المرشحين متحولة بالمئات أو حتى إلى ما بعد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وقدمت الدعم التمويلي لهذا المشروع من "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) الممولة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (2016R1A2B2006354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
- Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
- QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
- pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
- QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
- QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
- PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
- Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
- GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
- Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).
