Summary
Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode für zufällige Mutagenese Zielgen in Spalthefe. Als Beispiel Ziel ist es, rpt4 +, die kodiert eine Untereinheit der 19 s Proteasom und Bildschirm für Mutationen, die Heterochromatin destabilisieren.
Abstract
Zufällige Mutagenese eines Ziel-Gens wird häufig verwendet, um Mutationen zu identifizieren, die zu den gewünschten Phänotyp führen. Die Methoden, die verwendet werden, um zufällige Mutagenese zu erreichen, fehleranfällige PCR ist eine komfortable und effiziente Strategie für die Erzeugung von einem vielfältigen Pool von Mutanten (i.e., einer mutierten Bibliothek). Fehleranfällige PCR ist die Methode der Wahl, wenn ein Forscher versucht, eine vordefinierten Region, wie der kodierenden Region eines Gens und ohne Auswirkung auf andere genomischen Regionen zu mutieren. Nachdem die mutierte Bibliothek durch fehleranfällige PCR verstärkt wird, muss es in einem geeigneten Plasmid geklont werden. Die Größe der Bibliothek generiert durch fehleranfällige PCR ist von der Leistungsfähigkeit des Klonens Schritt eingeschränkt. Jedoch kann der Klonen Schritt in der Spalthefe Schizosaccharomyces Pombe, durch den Einsatz einer hocheffizienten einstufige Fusion PCR Konstrukte für die Transformation zu generieren ersetzt werden. Mutanten der gewünschten Phänotypen können dann mit entsprechenden Reporter ausgewählt werden. Hier beschreiben wir diese Strategie im Detail, nehmen wir als Beispiel, ein Reporter am Zentromer Heterochromatin eingefügt.
Introduction
Nach vorne Genetik ist eine klassische Methode, in der Forscher suchen natürlich vorkommende Mutanten, die einen bestimmten Phänotyp anzeigen und genetische Analysen durchführen. In reverse Genetik Mutationen in einem gen des Interesses eingebracht werden und der Phänotyp wird untersucht. Im letzteren Fall wird zufällige Mutagenese eines Ziel-Gens häufig verwendet, um einen Pool von Mutanten zu generieren, die anschließend zum gewünschten Phänotypen, wie z. B. die Temperaturempfindlichkeit ausgewählt oder enzymatische Aktivität verändert. Verschiedene Methoden können verwendet werden, um zufällige Mutagenese, inklusive fehleranfällige PCR1zu erreichen; UV-Bestrahlung-2; chemische Mutagene wie Ethyl Methanesulfonate (EMS) oder Salpetrige Säure3; die Verwendung von temporären Mutator Stämme, wie Sie zum Ausdruck zu bringen mutD5 4; und DNA Schlurfen5.
Hier beschreiben wir eine Reverse-Genetik-Strategie, in der wir fehleranfällige PCR um mutierte Pools für ein Target-gen in der Spalthefe erzeugen nutzen. Wie man aus seinem Namen vorstellen kann, erzeugt diese Methode Mutationen durch die Einführung von absichtlich Fehler während der PCR. Im Gegensatz zu anderen Methoden der Mutagenese ermöglicht fehleranfällige PCR dem Benutzer, die Region um mutagenisierter werden zu definieren. Dies macht es besonders geeignet bei den Bemühungen um die Funktion einer Protein/Domäne von Interesse zu untersuchen.
Um dieses zufällige Mutagenese-Verfahren zu demonstrieren, verwenden wir hierin rpt4 +, die die 19 s Proteasom Untereinheit kodiert, als Beispiel. Rpt4 hat gezeigt, dass Proteolyse-unabhängige Funktionen in anderen Organismen als Kernspaltung Hefe6,7,8,9haben, und ein Defekt in der Proteolyse bewirken indirekte Effekte durch die Veränderung von Proteinen Ebenen. Wir daher geschirmt für Mutanten, die Proteolyse-unabhängige Veränderungen, mit dem Ziel der Erforschung der Funktion des Proteasoms auf Heterochromatin ausgelöst.
Fehleranfällige PCR kann in jeder beliebigen Region gen angewendet werden, durch den Standort, an dem die Primer binden-tuning. Durch Mutation entstehende Variationen, die die gewünschte phänotypische Veränderung aufweisen können mit entsprechenden Reportern identifiziert werden. Hier, wir nahmen einen ade6 + Reporter eingefügt in das Zentromer 1 äußere wiederholen (Otr) Region10. Konstitutive Heterochromatin ist in dieser Region11, gebildet, so dass die ade6 + Reporter in der Wildtyp Bedingung zum Schweigen gebracht wird; Dies wird durch rote Kolonien10angezeigt. Eine Mutation, die das konstitutive Heterochromatin an das Zentromer destabilisiert führt auf den Ausdruck ade6 + Reporter, die als weiße Kolonien visualisiert wird.
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Protocol
1. Vorbereitung von Medien
- Bereiten Sie Hefeextrakt mit Ergänzungen (ja), ja ohne Adenin (ja Low Ade), Pombe Glutamate Medium (PMG-12) und PMG ohne Adenin (PMG-Ade) durch Mischen der Komponenten, wie in Tabelle 1beschrieben. Ja-Ade (Low Ade) und PMG-Ade Platten haben alle die gleichen Komponenten, aber die Adenin ist von letzterem ausgelassen.
- Verwenden Sie die folgenden Salz (50 X) Lager: 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L Na2SO4 in Wasser destilliertem. Filter mit einem 0,22 µm Porengröße Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
- Verwenden Sie die folgende Vitamin (1, 000 X) Lager: 1 g/L panthothenat, Nikotinsäure 10 g/L, 10 g/L Inosit, Biotin 10 mg/L in destilliertem Wasser. Filter mit einem 0,22 µm Porengröße Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
- Verwenden Sie die folgende Mineral (10, 000 X) Lager: 5 g/L Borsäure, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L Zitronensäure in destilliertem Wasser. Filter mit einem 0,22 µm Porengröße Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
Hinweis: Ja flüssiges Medium kann durch Weglassen der Agar gemacht werden.
- Autoklaven Medium und Abkühlen auf unter 60 ° C unter Rühren mit Stir Bar, mit einer Rate von 200 u/min.
- Fügen Sie 1 mL/L G418 Stammlösung ja + G418 (Geneticin) Platten hinzu das ja Medium.
- Verwenden Sie die folgenden G418 (1, 000 X) Lager: 100 mg/mL G418 in destilliertem Wasser. Filter zu sterilisieren, verwenden einen 0,22 µm Porengröße Filter, 1,5 mL Zentrifuge Röhren und Store aliquoten bei-20 ° C.
- Rühren Sie für eine weitere 5-10 min und aliquoten Medien in 90 mm Petrischalen (1 L des mittleren Aliquote, rund 40 Petrischalen. Speichern Sie die Platten bei 4 ° C.
2. Klonen von rpt4 + und seine 5' / 3' wo
- Führen Sie PCR Primer p1 und p2 (Abbildung 1A) mit Kernspaltung Hefe genomischen DNA (gDNA) als die Vorlage in einem Gesamtvolumen von 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U Enzym 1 x Reaktion Puffer) und Anwendung der Reaktionszyklen beschrieben in Tabelle 2 zu verstärken 3.315-Basis Paar (bp) Fragment, bestehend aus rpt4 + und seine 5' / 3' wo. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einer Reinigung Kit13 , wie vom Hersteller (Abbildung 1A) gerichtet.
- Die pBlueScript KS(-) Vektor14 und der amplifizierten DNA-Fragment mit rpt4 + mit seinen 5' / 3' wo mit BamH1 und Xho1 in einem Gesamtvolumen von 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U Enzym, 1 X Verdauung Puffer) bei 37 ° C in einem Wasserbad für 16-18 zu verdauen h (Abbildung 1 b).
- Gel reinigen des verdauten Vektors (1,2 % Agarose-Gel) und DNA durch TAE-basierte Agarose-Gelelektrophorese (100 V, 1 h), DNA-Bänder in den gewünschten Größen besteuert, und Isolierung der DNS mit einem Gel Extraction Kit15einfügen.
- Verbinden Sie den Vektor und DNA-Einlage mit T4 DNA-Ligase durch Durchführung einer 20 µL Ligatur Reaktion mit 50-100 ng der Vektor-DNA, ein ~ 3-fold molaren Überschuss von Einsatz DNA, 400 U T4-DNA-Ligase und 1 x Ligatur Puffer. Inkubieren Sie diese Mischung bei 18 ° C für 16-18 h.
- Verwandeln die aufgespaltenen DNA in 100 µL der E. Coli DH5α durch Anwendung von Hitze-Schock für 70 s bei 42 ° C. Fügen Sie 1 mL LB und inkubieren Sie für 1 h bei 37 ° C für die Wiederherstellung. Durchführen Sie Zentrifugation (13.800 x g), verwerfen Sie die überstand, Platte alle transformierten E. Coli Zellen auf LB Ampicillin (LA) Platten und Inkubation bei 37 ° C 16 h.
- Wählen Sie zwischen 4-8 Kolonien mit Zahnstochern und über Nacht bei 37 ° C in 3 mL LA Medium wachsen.
- Isolieren Sie der Plasmide mit einem Plasmid Reinigung Kit16 laut Protokoll des Herstellers verwendet und durchführen analytische Beschränkung Enzym Verdauung mit 5 µL des isolierten Plasmids, 5 U jedes Restriktionsenzym (BamH1 und Xho1) und 1 x Einschränkung Puffer. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 3 h bestätigen das Klonen durch Sequenzierung Kandidat Plasmide.
3. Einführung der Stille Mutation (Xho1 Beschränkung Site)
- Entwerfen Sie ein paar 33-bp-Primer (p3 und p4), die die gewünschte Mutation in der ansonsten komplementäre Sequenz enthalten.
- PCR mit High Fidelity Polymerase17 (Abbildung 1) in einem Gesamtvolumen von 25 µL führen (10 ng von geklonten Plasmid, 2 µL 10 Pmol Grundierung Mix, 2 U Enzym, 1 X Reaktion Puffer) mit Hilfe der Radsport Parameter in Tabelle 3aufgeführt.
- Die Vorlage Plasmid mit Dpnich in einem Gesamtvolumen von 20 µL (20 U Enzym, 1 X Verdauung Puffer) bei 37 ° C in Wasser für 1 h Bad zu verdauen.
- Verwandeln, propagieren, isolieren und das Plasmid enthält die Stille Mutation, wie beschrieben in Schritten 2,5-2,7-Sequenz.
Hinweis: Die Stille Mutation kann auch über eine Klonmethode, die für das Verbinden von mehreren DNA-Fragmente in eine einzige Reaktion18ermöglicht eingeführt werden.
(4) Random Mutagenesis rpt4 + durch fehleranfällige PCR
- Durchführen Sie fehleranfällige PCR mit dem Plasmid mit der Stille Mutation (Xho1 Website) als die Vorlage, Primer p5 und p6, ein Gesamtvolumen von 50 µL (die Menge der Vorlage in Schritt 4.1.1, 2 µL 10 Pmol Grundierung Mix, 2,5 U Enzym, 1 X Reaktion Puffer definiert) , und eine speziellen Polymerase, die entworfen ist, um einen hohen Fehler generieren bewerten19 (Abbildung 1). Führen Sie PCR, wie in Tabelle 2beschrieben.
- Verwenden Sie ca. 4-5 µg der Vorlage Plasmid die Mutation Häufigkeit auf 1 bp/kb (Kilobase) steuern.
Hinweis: Ein hoher Konzentration (> 500 ng/µL) Plasmid, das mit einem Mini-Prep Kit20gewonnen werden kann, erforderlich ist.
- Verwenden Sie ca. 4-5 µg der Vorlage Plasmid die Mutation Häufigkeit auf 1 bp/kb (Kilobase) steuern.
- Verwenden Sie Gelelektrophorese, um ein PCR-Produkt von 2670 bp (1,2 % Agarose-Gel) zu bestätigen. Gel reinigen das PCR-Produkt, wie in Schritt 2.5 beschrieben.
5. Vorbereitung der Fusion-PCR-Fragmente (KAN, 3' UTR)
- PCR mit pFA6a-KANMX621 als Vorlage, Primer p7 und p8 durchführen, und die Bedingungen aufgeführt, in Tabelle 4 Marker (KAN) Fragment zu erhalten. Gel reinigen das resultierende 1.480-bp Fragment wie in Schritt 2.5 (Abbildung 1E) beschrieben.
- Überprüfen Sie, ob das Stopcodon des Gens für Mutation und der kodierenden Region des angrenzenden gen gezielt werden getrennt von mehr als 500 bp. Der endogene Terminator dürfen nicht verwendet werden, wenn diese Region weniger als 500 ist bp; Vielmehr sollte der ADH -Terminator anstelle der endogenen Terminator verwendet werden. Die Protokoll-Änderungen erforderlich, um die ADH -Terminator zu verwenden sind in Tabelle 5dargestellt.
Hinweis: Diese Änderungen gelten nur, wenn der ADH -Terminator, der in der pFA6a-3HA-KANMX6-Plasmid verfügbar ist, wird anstelle der endogenen Terminator verwendet.
- Überprüfen Sie, ob das Stopcodon des Gens für Mutation und der kodierenden Region des angrenzenden gen gezielt werden getrennt von mehr als 500 bp. Der endogene Terminator dürfen nicht verwendet werden, wenn diese Region weniger als 500 ist bp; Vielmehr sollte der ADH -Terminator anstelle der endogenen Terminator verwendet werden. Die Protokoll-Änderungen erforderlich, um die ADH -Terminator zu verwenden sind in Tabelle 5dargestellt.
- Führen Sie PCR mit dem geklonten rpt4 +-mit Vektor als Vorlage und Primer p9 und p10 in einem Gesamtvolumen von 50 µL (20 ng von geklonten Plasmid, 2 µL 10 Pmol Grundierung Mix, 2 U Enzym, 1 X Reaktion Puffer), mit den Bedingungen, die in Tabelle 6dargestellt. Gel reinigen die erhaltenen 506-bp 3' UTR-Fragment (Abbildung 1E).
6. Generation des Konstrukts Transformation durch Fusion PCR (Abbildung 1E)
- Bereiten Sie die 3 Fragmente (mutagenisierter rpt4 +KAN und der 3' UTR) bei 50 ng/µL.
- Durchführen Sie Fusion, die PCR der drei mit Primer p11 und p12, Fragmente wie in Tabelle 7 beschrieben. (Das Protokoll für die Fusion PCR ist eine Modifikation des ursprünglichen Protokolls22.) Reinigen Sie das große 4.398-bp-PCR-Produkt.
- Verwenden Sie rpt4 +: KAN:3'UTR Fragmente in einem Verhältnis von 1:3:1 für optimale Ergebnisse.
Hinweis: Der Gesamtbetrag der Einsatz DNA sollte nicht mehr als 500 ng. Die empfohlene Menge an rpt4 +: KAN:3'UTR ist 50 Ng:150 Ng:50 ng. Die mutagenisierter Region ist etwa 1,6 kb, so ist die minimale Anzahl von Hefe-Kolonien, die alle möglichen Kombinationen von jede Basis wird mutiert, die anderen drei ausmachen würde 1.600 x 3 = 4.800 Kolonien. Da eine Transformation Reaktion in der Regel 400 bis 500 Kolonien ergibt, mindestens 10 Reaktionen Wert der Fusion PCR zu konstruieren ist erforderlich. Dieses Bedürfnis kann erfüllt werden, indem einfach mehr Reaktion (z. B. Anzahl der PCR-Röhrchen) um den Faktor zehn.
- Verwenden Sie rpt4 +: KAN:3'UTR Fragmente in einem Verhältnis von 1:3:1 für optimale Ergebnisse.
7. Veränderung der Spalthefe durch Elektroporation (Abb. 1F)
- Hefe, 10 mL ja Mittel-bis Sättigung von mehr als 16 h Inkubation zu impfen.
- Verdünnen Sie die Zellen zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,2 in 200 mL ja Medium und inkubieren Sie bei 30 ° C mit Schütteln für ca. 5-6 h, OD600 = 0,6 - 0,8.
- Konzentration Zellen auf OD600 = 30, verzichten auf vier 50 mL konische Röhrchen und chill für 10 min auf Eis.
- Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 1.050 x g für 3 min bei 4 ° c durchführen Legen Sie die Rohre und 10 Elektro-Küvetten auf Eis. Führen Sie die Schritte 7,3-7,8 auf Eis.
- Verwerfen Sie den überstand und 15 mL 1,2 M Sorbit. Schütteln Sie die Rohre, um die Zellen aufzuwirbeln.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1050 X g für 3 min bei 4 ° C.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.4 und 7.5. Verwerfen Sie den überstand. Jedes Rohr 500 µL 1,2 M Sorbit hinzu, Aufschwemmen der Zellen, und sammeln Sie alle Zellen in einem 15 ml konische Rohr.
- Hinzufügen von 1,2 M Sorbit bis zu 2,4 mL (OD600 = 10 pro 0,2 mL). Halten Sie das Rohr auf dem Eis.
- Fügen Sie 200 µL Sorbit gefederten Zellen (stellen Sie sicher, sie werden vollständig ausgesetzt), eine EP-Röhrchen mit der Fusion PCR zu konstruieren, gut mischen und übertragen Sie die Probe auf eine Elektro-Küvette.
- Electroporate die Zellen mit den folgenden Optionen: Pilze, ShS (2.00kV, 1 Impuls).
- Jedes Elektro-Küvette für ein Gesamtvolumen von 800 µL 600 µL 1,2 M Sorbit hinzu, und breitete sich dann die Zellen auf vier ja-Platten (200 µL/Platte). Zehn Elektro-Küvetten werden ja auf 40 Platten verzichtet.
- Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 24 h.
- Führen Sie Replica Plattierung ja + G418 und inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 3 Tage.
8. Auswahl von Heterochromatin destabilisieren Mutanten und Fehlalarme werden gesucht
- Führen Sie für jede Platte ja + G418 Replik Plattierung ja-Ade (Low Ade) und PMG-Ade (No Ade) Platten. 1-2 Tage bei 30 ° C, inkubieren Sie die Replik Platten bis einige Kolonien auf den ja-Ade-Platten einer roten Färbung (Abbildung 1 zeigen).
- Ja-Ade und PMG-Ade Platten und wählen Sie Zellen, rosa oder weiß auf die ja-Ade-Platte anzeigen und wachsen auch auf der PMG-Ade-Platte, zu vergleichen. Wählen Sie Kolonien ohne Wachstum auf PMG-Ade, nicht, wie sie Fehlalarme (z. B. widerspiegeln sind, dass die KAN-Kassette auf eine nicht-Ziel-Website an anderer Stelle im Genom integriert worden ist).
- Wählen Sie ca. 1 x 105 Zellen von jeder Kolonie und brüten in 10 µL des SPZ-Lösung enthält 2,5 mg/mL Zymolyase 100 T bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten Einsatz 1 µL dieser Lösung als Ausgangspunkt Vorlage für Kolonie PCR (Abbildung 1 H) durchführen.
- Machen Sie SPZ (50 mL) durch Mischen 30 mL 2 M Sorbit, 4,05 mL 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 und 15 mL destilliertem Wasser (endgültige pH 7,5). Proben (5 mL) werden mit Zymolyase ergänzt und in 500 µL Aliquots bei-20 ° C bis zum Gebrauch gespeichert.
- Durchführen Sie Gelelektrophorese (1,2 % Agarosegel, 180V, 20 min) zur Visualisierung der Ergebnisse der + Kolonie PCR. Wählen Sie Reaktionen, die PCR Bands die richtige Größe aufweisen und verdauen 5 µL jedes Reaktionsprodukt mit XhoI (4 U Enzym, 1 X Verdauung Puffer, 37 ° C Wasserbad, 1 h), Fehlalarme (Abbildung 1 H) auf den Bildschirm.
- Führen Sie Gelelektrophorese um den XhoI Übersichten (1,2 % Agarose-Gel, 180 V, 20 min) zu visualisieren. Markieren Sie die Kolonien deren PCR-Produkte werden durch XhoIgeschnitten und Patchen sie ja + G418 Platten (Abbildung 1I).
- GDNA aus der Kernspaltung Hefezellen zu isolieren und Sequenzierung der PCR Produkte23durchführen. Vergleichen Sie die erhaltenen Sequenz mit Wildtyp Sequenz, die Mutationen (Abbildung 1I) zu identifizieren.
- Führen Sie direkt wieder das Auge zu Wildtyp Zellen mit Fusion-Konstrukten von mutierten Zellen23durch PCR verstärkt zu verwandeln ein. Verwenden Sie Schmierblutungen, um den Phänotyp in den neugebildeten mutierten Zellen (Abbildung 1J) zu bestätigen.
- Fusion Umwandlung Konstrukt kann leicht mittels PCR Primer p1 mit p10 verstärkt werden mithilfe der genomischen DNS der Mutanten als Vorlage in einem Gesamtvolumen von 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U Enzym 1 x Reaktion Puffer), und die Anwendung der Reaktionszyklen, beschrieben in Tabelle 2 . Umwandlung des Konstrukts kann erfolgen, indem Sie die Schritte 7.1-7.13.
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Representative Results
Die erworbenen Rpt4 Mutanten gemäß die in Abbildung 1 beschriebenen Verfahren können analysiert werden, durch die Beurteilung der Farben der Kolonien. Die Farben der Kolonien sind auf die entsprechenden Teller in abnehmender Anzahl von Zellen in Abbildung 2gesichtet. Die ade6 + Reporter an der Heterochromatin Region eingefügt wird in Wildtyp zum Schweigen gebracht und zeigt rote Kolonien in ja-Ade-Platte. Sobald das Heterochromatin destabilisiert und die ade6 + Reporter wird ausgedrückt, können weiße Kolonien in ja-Ade Platte wie in clr4Δ Mutant beobachtet werden. Die abgeschirmten Rpt4 Mutanten sind wie dargestellt. rpt4-1 Mutant zeigt die schwerste Heterochromatin Destabilisierung.
Abbildung 1 : Schematische Darstellung des Protokolls. (A) schematische Darstellung des PCR Produktes erhalten durch die erste Runde der PCR, die mit Primer 1 und 2 durchgeführt wird. (B) Beschränkung auf Klonen des Fragments rpt4 + . (C) Site-verwiesene Mutagenese des geklonten Vektors wird verwendet, um eine Stille Mutation einzuführen, die eine XhoI Einschränkung Website hinzufügt. (D) Random Mutagenesis des rpt4 + Region Codierung erfolgt mittels fehleranfällige PCR. (E) das mutierte rpt4 + Fragment, das KAN Fragment und der 3' UTR Fragment sind Fusion PCR, eine Transformation-Ready-Kassette zu generieren eine Zwangspause einlegen. (F) Kernspaltung Hefezellen werden mit der Fusion PCR Konstrukt, transformiert die endogene rpt4 + Sequenz durch homologe Rekombination ersetzt. (G) KAN ausgewählt Kolonien sind Replik auf Ja-Ade (Low Ade) und PMG-Ade (No Ade) Platten beschichtet, und positiven Kolonien werden ausgewählt. (H) , PCR und nachfolgende XhoI Beschränkung des PCR Produktes werden verwendet, um Fehlalarme zu vermeiden. (I) die Mutation, die bewirkt, den Phänotyp dass ist gekennzeichnet durch das Ausbessern der ausgewählten Kolonien, die Vermehrung von Zellen, Extraktion von genomischer DNA (gDNA) und Sequenzierung der relevante Teil des rpt4 +. (J) ursächliche Mutationen werden bestätigt (und Fehlalarme ausgeschlossen) durch die Einführung von direkt der Mutation zu Wildtyp Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Heterochromatin de-Unterdrückung durch Mutation entstehende Variationen von Rpt4. Schematische Darstellung des Reporters otr1::ade6 + (oben). 5-Fold serielle Verdünnungen von ausgewählten abgeschirmten Rpt4 Mutanten wurden auf die angegebenen Teller in der Reihenfolge der Erhöhung des Heterochromatin Destabilisierung (unten) entdeckt. Diese Zahl wurde aus dem Artikel geändert "19 s Proteasom direkt an der Regulation von Heterochromatin breitet sich in Spalthefe durch Seo Et Al., 201724beteiligt ist". Die nicht beschnitten Figur finden Sie im Originalartikel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Komponente | Plattentyp | |
| JA | PMG | |
| Hefeextrakt | 5 g/L | |
| Glukose | 30 g/L | 20 g/L |
| Adenin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Histidin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Leucin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Uracil | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Kalium-Wasserstoff-pthalate | 3 g/L | |
| Na2HPO4 | 2,2 g/L | |
| L-Glutaminsäure | 3,75 g/L | |
| Salze | 20 ml/L | |
| Vitamine | 1 ml/L | |
| Mineralien | 0,1 ml/L | |
| Agar | 16 g/L | 16 g/L |
Tabelle 1. Komponenten von YES und PMG Platten
| Temperatur | Zeit | Zyklen |
| 95oC | 2 min | 1 Zyklus |
| 95oC | 20 s | 30 Zyklen |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 min | |
| 72oC | 8 min | 1 Zyklus |
| 8oC | Halten |
Tabelle 2. Empfohlene PCR-Programm für Site-verwiesene Mutagenese
| Temperatur | Zeit | Zyklen |
| 95oC | 2 min | 1 Zyklus |
| 95oC | 30 s | 19 Zyklen |
| 55oC | 1 min | |
| 72oC | 7 min. | |
| 72oC | 10 min | 1 Zyklus |
| 8oC | Halten |
Tabelle 3. Empfohlene PCR-Programm für fehleranfällige PCR
| Temperatur | Zeit | Zyklen |
| 95oC | 2 min | 1 Zyklus |
| 95oC | 20 s | 30 Zyklen |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 min | |
| 72oC | 8 min | 1 Zyklus |
| 8oC | Halten |
Tabelle 4. PCR-Programm für den Erhalt der KAN-Fragment zu empfehlen
| Änderung | An | Fallbeispiel des rpt4 + | |
| Vorlage-Vektor | pFA6a-3HA-KANMX6 | ||
| Vektor-verbindliche Reihenfolge der p7 | ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | Ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | |
| Hängende Abfolge von p7 | Die letzten 50bp Sequenz einschließlich das Stopp-codon | ||
| Hängende Abfolge von p8 | Die erste 50bp Sequenz direkt nach das Stopp-Codon (komplementäre Sequenz) | AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC | |
| Reihenfolge der p9 | Beginnen Sie direkt nach dem Stopp-codon | tgcacatatatccaaaaagccatgaa | |
| Reihenfolge der p10 | Produzieren ~ 500bp Fragment mit p9 (ergänzende Seqeucne) | TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC | |
Tabelle 5. Änderungen erforderlich, wenn der ADH-Terminator anstelle der endogenen Terminator verwendet wird
| Temperatur | Zeit | Zyklen |
| 95oC | 2 min | 1 Zyklus |
| 95oC | 20 s | 30 Zyklen |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 1 min | |
| 72oC | 8 min | 1 Zyklus |
| 8oC | Halten |
Tabelle 6. PCR-Programm für den Erhalt der 3' UTR Fragment empfohlen
| Temperatur | Zeit | Rampe | Zyklen |
| 94oC | 2 min | 1 Zyklus | |
| 94oC | 20 s | 10 Zyklen | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 02:30 min | 0,2 oC/s | |
| 94oC | 20 s | 5 Zyklen | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 02:30 min | 0,2 oC/s + 5 s/Zyklus | |
| 94oC | 20 s | 10 Zyklen | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 02:30 min | 0,2 oC/s + 20 s/Zyklus | |
| 72oC | 10 min | 1 Zyklus | |
| 8oC | Halten |
Tabelle 7. Empfohlene PCR-Programm für die Fusion PCR
| CBL1877 | h + | ade6-210 leu1-32 ura4-D18 otr1R (GD-Glu) Sph1:ade6 |
Tabelle S1: In dieser Studie verwendete Stamm
Tabelle S2: Liste der in dieser Studie verwendeten Primer
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Discussion
Zufällige Mutagenese über fehleranfällige PCR ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erzeugung von einem vielfältigen Pool von Mutanten in einer bestimmten Region. Diese Technik eignet sich besonders für Studien, die versuchen, die Funktion eines Proteins unter bestimmten Umständen zu beurteilen. Zum Beispiel verwendeten wir hierin fehleranfällige PCR, um die Funktion der 19 s-Proteasom Untereinheit, Rpt4, im Heterochromatin Wartung zu beurteilen. Durch Variation die Region gezielt durch die fehleranfällige PCR und Anpassung der Screening-Bedingungen, konnten wir Zellen an die genomische Region von Interesse und Bildschirm für den gewünschten Phänotyp zu mutieren. Vor kurzem wurde eine ähnliche Methode zur Kernspaltung Hefezellen beherbergen Mutationen in der Spindel Pol Körper Komponente25zu isolieren.
Der entscheidende Vorteil der zufällige Mutagenese ist, dass es um unwesentliche und wesentlichen Gene angewendet werden kann. Zufällige Mutagenese der wesentlichen Gene kann führen, verschiedene Mutanten, z. B. mit subtilen und/oder teilweise Funktionsstörungen, die Zellviabilität aufrechterhalten werden können, oder durch Mutation entstehende Variationen, deren Funktionen nur unter einer bestimmten Bedingung betroffen sind. Ein Beispiel für Letzteres ist ein temperaturempfindlicher Mutant. Solche Mutanten möglicherweise isoliert mit 5 mg/L Phloxine B, die sterbende Zellen in roten Flecken und langsam wachsende Zellen vor dem Absterben von Zellen26unterschieden werden kann.
Der entscheidende Schritt dieses Protokolls ist die fehleranfällige PCR-Schritt. Bei diesem Schritt ist es wichtig, die Mutation Frequenz zu kontrollieren, die abhängig von der Anzahl der PCR-Zyklen und der ursprüngliche Betrag der Vorlage sehr unterschiedlich sein kann. Wir empfehlen, dass der Benutzer die Anzahl der PCR-Zyklen zu beheben und variieren Sie die ursprüngliche Menge Vorlage, da wir fanden, dass dies ein bequemer Strategie zur Optimierung sein. Wir stellen fest, dass die fehleranfällige PCR-Technik Jahrzehnten weit verbreitet seit. Wenn der Benutzer wählt, können sie eine Methode zur manuellen Abgleich fehleranfällige PCR27 ohne mit einem handelsüblichen Mutagenese-Kit suchen.
Als eine Verwarnung ist false-positive-Rate dieses Protokolls ziemlich hoch. Daher sollten mutierte Kandidaten einer Reihe von Screenings soll die Fehlalarme aussortieren unterziehen. Wir fanden, dass die Stille Einbeziehung einer Einschränkung-Website in das Zielgen helfen kann Thema Fehlalarme mit dem relativ mühsam Schritt der Sequenzierung zu vermeiden. Dies ist kostengünstig, wie die mutierten Kandidaten in die Hunderte oder sogar darüber hinaus Nummer können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Finanzielle Unterstützung für dieses Projekt lieferte die grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft und IKT (2016R1A2B2006354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
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