Summary
Denne artikkelen beskriver en detaljert metodikk for tilfeldige mutagenese med et mål i fisjon gjær. Som et eksempel målet vi rpt4 +, som koder en undergruppe av 19S proteasome og skjermen for mutasjoner som destabilisere heterochromatin.
Abstract
Tilfeldige mutagenese med et mål brukes vanligvis til å identifisere mutasjoner som gir ønsket fenotypen. Av metoder som kan brukes til å oppnå tilfeldig mutagenese, feilutsatte PCR er en praktisk og effektiv strategi for å generere en variert samling av mutanter (dvs., en mutert biblioteket). Feilutsatte PCR er metoden for valg når forsker søker å mutere et forhåndsdefinert område, som koding regionen et gen samtidig la andre genomisk regioner upåvirket. Etter mutant biblioteket forsterkes av feilutsatte PCR, må det være klonet i en egnet plasmider. Størrelsen på biblioteket generert av feilutsatte PCR er begrenset av effektiviteten av kloning trinnet. Men i fisjon gjær, Schizosaccharomyces pombe, kan kloning trinnet erstattes ved bruk av en svært effektiv ettrinns fusjon PCR generere konstruksjoner for transformasjon. Mutanter av ønsket fenotyper kan deretter velges med passende journalister. Her beskriver vi denne strategien i detalj, ta for eksempel, en reporter satt inn på centromeric heterochromatin.
Introduction
Fremover genetikk er en klassisk metode som forskere søker naturlig forekommende mutanter som viser en bestemt fenotype, og utføre genetiske analyser. I omvendt genetikk, mutasjoner innføres i en genet av interesse og fenotypen undersøkes. I det siste tilfellet brukes ofte tilfeldige mutagenese med et mål å generere en pool av mutanter som velges senere for ønsket fenotyper, som temperatur følsomhet eller endret enzymatisk aktivitet. Ulike metoder kan brukes til å oppnå tilfeldig mutagenese, inkludert feilutsatte PCR1; UV bestråling2; kjemisk mutagener, som ethyl methanesulfonate (EMS) eller nitrøse syre3; Bruk av midlertidige mutator stammer, som de over uttrykke mutD5 4; og DNA stokking5.
Her beskriver vi en omvendt-genetikk strategi som vi utnytter feilutsatte PCR vil generere mutant basseng for et mål gen i fisjon gjær. Som en kunne gjette fra navnet, genererer denne metoden mutasjoner av bevisst introdusere feil under PCR. I motsetning til andre mutagenese metoder tillater feilutsatte PCR brukeren å definere regionen for å være mutagenized. Dette gjør det spesielt nyttig i arbeidet med å studere funksjonen av et protein/domene av interesse.
For å demonstrere dette tilfeldig mutagenese prosedyre, bruk vi her rpt4 +, som koder 19S proteasome delenhet, som et eksempel. Rpt4 har vist seg å ha uavhengig av proteolyse funksjoner i organismer enn fisjon, gjær,6,,7,,8,,9, og en feil i proteolyse føre indirekte effekter ved å endre proteiner nivåer. Vi er derfor vist for mutanter som utløste proteolyse-uavhengig endringer, med mål om å undersøke funksjonen til proteasome på heterochromatin.
Feilutsatte PCR kan brukes til alle gen-regionen ved å justere plasseringen der primerne binde. Mutanter som viser ønsket fenotypiske endringen kan identifiseres med riktig journalister. Her vi utnyttet en ade6 + reporter satt på centromere 1 ytre gjenta (otr) regionen10. Grunnleggende heterochromatin blir dannet denne regionen11, så ade6 + reporteren er stille i vill-type tilstand; Dette indikeres av røde kolonier10. En mutasjon som destabilizes den grunnleggende heterochromatin på centromere vil føre til uttrykk for ade6 + reporteren, som er visualisert som hvit kolonier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av Media
- Forberede gjærekstrakt med kosttilskudd (Ja), ja uten adenine (ja lav Ade), Pombe Glutamate medium (PMG12) og PMG uten adenine (PMG-Ade) ved å blande komponenter som beskrevet i tabell 1. Ja-Ade (lav Ade) og PMG-Ade plater har alle de samme komponentene, men adenine utelates fra sistnevnte.
- Bruk følgende salt (50 x) lager: 52.5 finans MgCl2·6H2O, 2 finans CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 finans Na2så4 i destillert vann. Filteret sterilisere bruke filtere 0.22-µm pore-størrelse og lagre på 4 ° C.
- Bruk følgende vitamin (1 000 x) lager: 1 finans pantothenate, nikotinsyre 10 g/L, 10 finans inositol, 10 mg/L biotin i destillert vann. Filteret sterilisere bruke filtere 0.22-µm pore-størrelse og lagre på 4 ° C.
- Bruk følgende mineralet (10 000 x) lager: 5 finans borsyre, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 finans FeCl2·4H2O, 0.4 finans MoO3, 1 g/L KI, 0.4 finans CuSO4·5H2O , 10 finans sitronsyre i destillert vann. Filteret sterilisere bruke filtere 0.22-µm pore-størrelse og lagre på 4 ° C.
Merk: Ja flytende medium kan gjøres ved å unnlate agar.
- Autoclave mediet og avkjøle den til under 60 ° C under omrøring med rør bar frekvensen av 200 rpm.
- For Ja + G418 (geneticin) plater, legge til 1 mL/L G418 lagerløsning Ja medium.
- Bruk den følgende G418 (1 000 x) lager: 100 mg/mL G418 i destillert vann. Filteret sterilisere bruker 0.22-µm pore-størrelse filter, aliquot 1,5 mL sentrifuge rør, og butikken på 20 ° C.
- Rør for en annen 5-10 min og aliquot media i 90 mm Petri retter (1 L middels dele omtrent 40 Petri retter. Lagre platene på 4 ° C.
2. kloning av rpt4 + og dens 5/3' UTRs
- Utføre PCR primere p1 og p2 (figur 1A) bruker fisjon gjær genomisk DNA (gDNA) som malen i et totalt volum på 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x reaksjon buffer), og bruke reaksjon sykluser beskrevet i tabell 2 å forsterke en 3,315-base par (bp) fragment bestående av rpt4 + og dens 5/3' UTRs. Rense PCR produktet bruker en rensing kit13 som anvist av produsenten (figur 1A).
- Fordøye det pBlueScript KS(-) vektor14 og forsterket DNA fragmentet som inneholder rpt4 + med sine 5/3' UTRs med BamH1 og Xho1 i et totalvolum på 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x fordøyelsen buffer) på 37 ° C i et vannbad for 16-18 h (figur 1B).
- Gel rense fordøyd vektoren (1,2% agarose gel) og DNA sett av utfører TAE-baserte agarose gel geleelektroforese (100 V, 1 h) excising DNA bånd ønskede størrelsene og isolere DNA med en gel utvinning kit15.
- Ligate vector og DNA sett inn ved hjelp av T4 DNA ligase ved å utføre en 20 µL ligation reaksjon som inneholder 50-100 ng av vektoren DNA, en ~ 3-fold molar overskudd av sett inn DNA, 400 U T4 DNA ligase og 1 x ligation buffer. Inkuber denne blandingen ved 18 ° C i 16-18 h.
- Forvandle ligated DNA 100 µL av E. coli DH5α ved å bruke varme sjokk for 70 s på 42 ° C. Legg 1 mL av LB og ruge 1t på 37 ° C for utvinning. Utføre sentrifugering (13 800 x g), forkaste supernatant, platen alle transformert E. coli celler på LB-Ampicillin (LA) plater, og ruge på 37 ° C 16 h.
- Velg 4-8 kolonier med tannpirkere og vokse over natten på 37 ° C i 3 mL LA medium.
- Isolere plasmider med en plasmider rensing kit16 brukes i henhold til produsentens protokollen og utføre analytisk begrensning enzym digestions med 5 µL av de isolerte plasmider, 5 U av hver begrensning enzym (BamH1 og Xho1) og 1 x begrensning buffer. Inkuber reaksjonsblandingen på 37 ° C i et vannbad for 3 h. Bekreft kloning av sekvensering kandidat plasmider.
3. innføring av stille mutasjon (Xho1 begrensning nettsted)
- Utforme et par 33-bp primere (p3 og p4) som inneholder ønsket mutasjon i ellers komplementære sekvensen.
- Utføre PCR med Hi-Fi-polymerase17 (figur 1 c) i et totalt volum på 25 µL (10 ng klonet plasmider, 2 µL av 10 pmol primer mix, 2 U enzym, 1 x reaksjon buffer) bruker parameterne sykling oppført i tabell 3.
- Fordøye det mal plasmider med DpnI et totalvolum på 20 µL (20 U enzym, 1 x fordøyelsen buffer) på 37 ° C i en vann bad for 1 h.
- Transformere, overføre, isolere og sekvens plasmider inneholder stille mutasjonen, som beskrevet i trinn 2.5-2.7.
Merk: Stille mutasjonen kan også presenteres ved hjelp av en kloning metoden hvilke innrømmer for sammenføyning av flere DNA fragmenter i et enkelt reaksjon18.
4. tilfeldig mutagenese av rpt4 + av feilutsatte PCR
- Utføre feilutsatte PCR, plasmider med stille mutasjon (Xho1 område) som malen, primere p5 og p6, et totalt volum på 50 µL (mengden mal definert i trinn 4.1.1, 2 µL av 10 pmol primer blanding, 2,5 U enzym, 1 x reaksjon buffer) , og en spesiell utvalg som er utformet for å generere en høy feil rate19 (figur 1 d). Utfør PCR som beskrevet i tabell 2.
- Bruk 4-5 µg av malen plasmider for å styre mutasjon frekvensen med 1 bp/kb (kilobase).
Merk: En høy-konsentrasjon (> 500 ng/µL) plasmider, som kan oppnås ved hjelp av en mini prep kit20, er obligatoriske.
- Bruk 4-5 µg av malen plasmider for å styre mutasjon frekvensen med 1 bp/kb (kilobase).
- Bruke gel geleelektroforese for å bekrefte et PCR-produkt av 2670 bp (1,2% agarose gel). Gel rense PCR produktet som beskrevet i trinn 2.5.
5. forberedelse av Fusion PCR (KAN, 3' UTR)
- Utføre PCR med pFA6a-KANMX621 som mal, primere p7 og p8, og vilkårene oppført i tabell 4 å få markør (KAN) fragmentet. Gel rense resulterende 1,480-bp fragmentet som beskrevet i trinn 2.5 (figur 1E).
- Sjekk Hvis stopp codon av genet mål for mutasjon og regionen koding i det tilstøtende genet er atskilt med mer enn 500 bp. Endogene terminator kan ikke brukes når denne regionen er mindre enn 500 bp; snarere bør ADH terminator brukes i stedet for endogene terminator. Protokollen endringene må bruke ADH terminator er presentert i tabell 5.
Merk: Disse endringene gjelder bare når ADH terminator, som er tilgjengelig i pFA6a-3HA-KANMX6-plasmider, brukes endogene terminator.
- Sjekk Hvis stopp codon av genet mål for mutasjon og regionen koding i det tilstøtende genet er atskilt med mer enn 500 bp. Endogene terminator kan ikke brukes når denne regionen er mindre enn 500 bp; snarere bør ADH terminator brukes i stedet for endogene terminator. Protokollen endringene må bruke ADH terminator er presentert i tabell 5.
- Utføre PCR med det klon rpt4 +-inneholder vektorgrafikk som mal og primere p9 og p10 i et totalt volum på 50 µL (20 ng klonet plasmider, 2 µL av 10 pmol primer mix, 2 U enzym, 1 x reaksjon buffer), betingelser som er presentert i tabell 6. Gel rense innhentet 506-bp 3' UTR fragmentet (figur 1E).
6. generasjon av transformasjon Konstruer av Fusion PCR (figur 1E)
- Forberede 3 fragmenter (mutagenized rpt4 +, KAN og de 3' UTR) på 50 ng/µL.
- Utføre fusion PCR av tre fragmenter primere p11 og p12, som beskrevet i tabell 7. (Protokollen for fusion PCR er en modifikasjon av den opprinnelige protokollen22.) Rense store 4,398-bp PCR produktet.
- Bruk rpt4 +: KAN:3'UTR fragmenter på forholdet 1:3:1 for optimale resultater.
Merk: Den totale mengden sett inn DNA bør ikke overstiger 500 ng. Den anbefalte mengden rpt4 +: KAN:3'UTR er 50 ng:150 ng:50 ng. Mutagenized regionen er ca 1,6 kb, så antallet gjær koloniene som står for alle mulige kombinasjoner av hver base blir mutert til tre andre er 1600 x 3 = 4800 kolonier. Fordi en transformasjon reaksjonen gir vanligvis 400-500 kolonier, kreves minst 10 reaksjoner verdt Fusion PCR konstruere. Dette behovet kan oppfylles ved å øke reaksjon beløpet (dvs. antall PCR rør) av en faktor av ti.
- Bruk rpt4 +: KAN:3'UTR fragmenter på forholdet 1:3:1 for optimale resultater.
7. transformasjon av fisjon gjær av Electroporation (figur 1F)
- Vaksinere gjær til 10 mL av Ja medium til metning av rugende den for mer enn 16 timer.
- Fortynne cellene til en optisk tetthet på 600 nm (OD600) 0,2 i 200 ml av Ja medium og Inkuber på 30 ° C med skjelvende for 5-6 h, OD600 = 0.6 - 0,8.
- Konsentrere celler OD600 = 30, dispensere til fire 50-mL konisk rør og chill på is 10 min.
- Høste celler ved å utføre sentrifugering 1050 x g i 3 minutter på 4 ° C. Plassere rør og 10 elektro-cuvettes på is. Utfør trinnene 7.3-7.8 på is.
- Forkaste nedbryting og legge 15 mL 1,2 M sorbitol. Forsiktig risting rør for å resuspend cellene.
- Sentrifuge cellene 1050 x g i 3 minutter på 4 ° C.
- Gjenta trinn 7.4 og 7.5. Kast nedbryting. Legge til 500 µL av 1,2 M sorbitol hver rør resuspend cellene og samle alle cellene i en 15-ml konisk tube.
- Legge til 1,2 M sorbitol opptil 2,4 mL (OD600 = 10 per 0,2 mL). Holde røret på is.
- Legge til 200 µL sorbitol-suspendert celler (Kontroller at de er fullt suspendert) til en EP rør som inneholder fusion PCR konstruere, bland godt og overføre prøven til en elektro-cuvette.
- Electroporate cellene med følgende alternativer: sopp, ShS (2.00kV, 1 puls).
- Legge til 600 µL av 1,2 M sorbitol hver electro-cuvette for et totalt volum på 800 µL, og deretter spre cellene i fire Ja plater (200 µL/plate). Ti elektro-cuvettes vil påføre 40 Ja plater.
- Inkuber platene på 30 ° C i 24 timer.
- Utfør kopi plating å ja + G418 og ruge platene på 30 ° C i 3 dager.
8. valg av Heterochromatin-destabiliserende mutanter og kontroll for falske positiver
- For hver Ja + G418 plate, utføre kopi plating å ja-Ade (lav Ade) og PMG-Ade (ingen Ade) plater. Inkuber kopi platene for 1-2 dager på 30 ° C, inntil noen koloniene på Ja-Ade platene viser en rød coloration (figur 1G).
- Sammenligne Ja-Ade og PMG-Ade og merker cellene som viser rosa eller hvite på Ja-Ade plate og også vokse på PMG-Ade tallerkenen. Ikke Velg kolonier uten vekst på PMG-Ade, som de er falske positiver (f.eks reflekterer at KAN kassetten har blitt integrert i et ikke-målområde andre steder i genomet).
- Plukk ca 1 x 105 celler fra hver kolonien og ruge i 10 µL SPZ løsning som inneholder 2,5 mg/mL zymolyase 100 T på 37 ° C i minst 30 min. Bruk 1 µL av denne løsningen til å utføre som starter mal for kolonien PCR (figur 1 H).
- Gjøre SPZ (50 mL) ved å blande 30 mL av 2 M sorbitol, 4.05 mL 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 og 15 mL destillert vann (siste pH, 7.5). Eksempler (5 mL) kan suppleres med zymolyase og lagret i 500-µL dele på 20 ° C før bruk.
- Utføre gel geleelektroforese (1,2% agarose gel, 180V, 20 min) for å se resultatene av + kolonien PCR. Velg reaksjoner som viser PCR band av riktig størrelse og fordøye 5 µL hver reaksjon produktet med Xhojeg (4 U enzym, 1 x fordøyelsen buffer, 37 ° C vannbad, 1 h) å sile ut falske positiver (figur 1 H).
- Utføre gel geleelektroforese å visualisere XhoI format (1,2% Agarose gel, 180 V, 20 min). Merk koloniene PCR produkter er kuttet av XhoIog sy dem på Ja + G418 plater (figur 1I).
- Isolere gDNA fra fisjon gjær cellene og utføre sekvensering av PCR produkter23. Sammenligne innhentet sekvensen med vill-type sekvensen å identifisere mutasjoner (figur 1I).
- Direkte re-introdusere mutation(s) vill-type celler gjøre dem med fusion konstruksjoner forsterket av PCR fra mutant celler23. Bruke småblødninger for å bekrefte fenotypen i nylig gjort mutant cellene (figur 1J).
- Fusion transformasjon konstruksjonen kan være lett forsterket av PCR primere p1 og p10 bruker genomisk DNA av mutanter som malen i et totalt volum på 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x reaksjon buffer), og bruke reaksjon sykluser beskrevet i tabell 2 . Transformasjon av Konstruer kan gjøres ved å følge fremgangsmåten 7.1-7.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ervervet Rpt4 mutanter ved å følge fremgangsmåtene i figur 1 kan analyseres ved å vurdere farger i koloniene. Fargene i koloniene er oppdaget på relevante platene i å redusere celle nummer i figur 2. Ade6 + reporteren inn ved heterochromatin regionen er stille i vill-type og viser rød kolonier i Ja-Ade plate. Når heterochromatin er ustabil og ade6 + reporteren uttrykkes, kan hvit kolonier observeres i Ja-Ade plate som clr4Δ mutant. Vist Rpt4 mutanter er som vist. rpt4-1 mutant viser alvorligste heterochromatin destabilisering.
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av protokollen. (A) skjematisk fremstilling av PCR produktet oppnås ved den første runden av PCR, utføres med primere 1 og 2. (B) begrensning-basert kloning av rpt4 + fragment. (C) nettsted-rettet mutagenese av klonet vektoren brukes til å innføre en stille mutasjon som legger til et XhoI begrensning område. (D) tilfeldig mutagenese av rpt4 + koding regionen utføres med feilutsatte PCR. (E) muterte rpt4 + fragmentet, KAN fragmentet og 3 UTR fragmentet er sammen med fusion PCR generere en transformasjon-klar kassett. (F) fisjon gjærceller tilberedes med fusion PCR konstruksjonen som erstatter endogene rpt4 + sekvensen av homologe rekombinasjon. (G) KAN velge koloniene er kopi belagt Ja-Ade (lav Ade) og PMG-Ade (ingen Ade) plater, og positiv koloniene er valgt. (H) PCR og påfølgende XhoI begrensning av PCR produktet brukes til å unngå falske positiver. (I) mutasjon som forårsaker fenotypen identifiseres av patching av valgte kolonier, overføring av celler, utvinning av genomisk DNA (gDNA) og sekvensering av den relevante delen av rpt4 +. (J) forårsaker mutasjoner er bekreftet (og falske positiver er utelukket) ved å direkte innføre mutasjon vill-type celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Heterochromatin de undertrykkelse mutanter av Rpt4. Skjematisk diagram av otr1::ade6 + reporteren (øverst). 5-fold føljetong fortynninger av Velg vist Rpt4 mutanter ble oppdaget på de angitte platene etter økende grad av heterochromatin destabilisering (nederst). Dette tallet ble endret fra artikkelen '19S proteasome direkte involvert i regulering av heterochromatin sprer seg i fisjon gjær' av Seo et al., 201724. Ikke beskjæres figuren finnes i den opprinnelige artikkelen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Type plate | |
| ja | PMG | |
| Gjærekstrakt | 5 g/L | |
| Glukose | 30 g/L | 20 finans |
| Adenine | 0.15 g/L | 0,1 finans |
| Histidin | 0.15 g/L | 0,1 finans |
| Leucine | 0.15 g/L | 0,1 finans |
| Uracil | 0.15 g/L | 0,1 finans |
| Kalium hydrogen pthalate | 3 g/L | |
| Na2HPO4 | 2.2 finans | |
| L-Glutaminsyre | 3.75 g/L | |
| Salter | 20 ml/L | |
| Vitaminer | 1 ml/L | |
| Mineraler | 0,1 ml/L | |
| Agar | 16 g/L | 16 g/L |
Tabell 1. Komponenter av Ja og PMG plater
| Temperatur | Tid | Cycle(s) |
| 95oC | 2 min | 1 syklus |
| 95oC | 20 s | 30 sykluser |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 min | |
| 72oC | 8 min | 1 syklus |
| 8oC | Hold |
Tabell 2. Anbefalte PCR programmet for området-rettet mutagenese
| Temperatur | Tid | Cycle(s) |
| 95oC | 2 min | 1 syklus |
| 95oC | 30 s | 19 sykluser |
| 55oC | 1 min | |
| 72oC | 7 min | |
| 72oC | 10 min | 1 syklus |
| 8oC | Hold |
Tabell 3. Anbefalte PCR programmet for feilutsatte PCR
| Temperatur | Tid | Cycle(s) |
| 95oC | 2 min | 1 syklus |
| 95oC | 20 s | 30 sykluser |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 min | |
| 72oC | 8 min | 1 syklus |
| 8oC | Hold |
Tabell 4. Anbefalt PCR programmet for å få KAN fragmentet
| Endre | Til | Eksempel tilfelle av rpt4 + | |
| Mal vector | pFA6a-3HA-KANMX6 | ||
| Vektor-bindende rekke p7 | ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | |
| Henger rekke p7 | Siste 50bp sekvens inkludert stopp codon | ||
| Henger rekke p8 | Den første 50bp sekvensen rett etter stopp codon (komplementære sekvens) | AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC | |
| Rekke p9 | Start rett etter stopp codon | tgcacatatatccaaaaagccatgaa | |
| Rekke p10 | Produsere ~ 500bp fragment med p9 (utfyllende seqeucne) | TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC | |
Tabell 5. Endringene som trengs når ADH terminator brukes endogene terminator
| Temperatur | Tid | Cycle(s) |
| 95oC | 2 min | 1 syklus |
| 95oC | 20 s | 30 sykluser |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 1 min | |
| 72oC | 8 min | 1 syklus |
| 8oC | Hold |
Tabell 6. Anbefalt PCR programmet for å få 3 UTR fragmentet
| Temperatur | Tid | Rampen | Cycle(s) |
| 94oC | 2 min | 1 syklus | |
| 94oC | 20 s | 10 sykluser | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0,2 oC/s | |
| 94oC | 20 s | 5 sykluser | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0,2 oC/s + 5 s/syklus | |
| 94oC | 20 s | 10 sykluser | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0,2 oC/s + 20 s/syklus | |
| 72oC | 10 min | 1 syklus | |
| 8oC | Hold |
Tabell 7. Anbefalte PCR programmet for fusion PCR
| CBL1877 | h + | ade6-210 leu1-32 ura4-D18 otr1R (dg-glu) Sph1:ade6 |
Tabellen S1: Press brukt i denne studien
Tabellen S2: Liste over primere brukt i denne studien
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilfeldige mutagenese via feilutsatte PCR er et kraftig verktøy for å generere en variert samling av mutanter i en gitt region. Denne teknikken er spesielt nyttig for studier som søker å vurdere funksjon av et protein under et bestemt forhold. For eksempel brukt vi her feilutsatte PCR for å vurdere funksjon 19S proteasome underenheten, Rpt4, i heterochromatin vedlikehold. Ved å variere regionen målrettet av feilutsatte PCR og justering av screening forholdene, kunne vi mutere cellene på genomisk regionen interesse og skjermen for ønsket fenotypen. Nylig ble en lignende metode brukt til å isolere fisjon gjærceller skjuler mutasjoner i spindel pole kroppen komponent25.
Hovedfordelen ved tilfeldige mutagenese er at den kan brukes på både ikke-essensielle og viktig gener. Tilfeldig mutagenese av viktige gener kan gi ulike mutanter, som dem med subtile og/eller delvis funksjonelle feil at cellen levedyktighet å være vedvarende, eller mutanter med funksjoner påvirkes under en bestemt betingelse. Et eksempel på sistnevnte er en temperatur-sensitive mutant. Slike mutanter kan isoleres ved hjelp av 5 mg/L phloxine B, som flekker døende celler i rødt og aktiverer sakte voksende celler skilles fra døde celler26.
Det kritiske trinnet av denne protokollen er utsatt for feil PCR skritt. På dette trinnet er det viktig å kontrollere mutasjon frekvensen, som varierer avhengig av antall PCR sykluser og den innledende beløpet av malen. Vi anbefaler at du fastsette antall PCR sykluser og varierer den innledende beløpet av malen, som vi fant dette å være en enklere strategi for optimalisering. Vi registrerer at teknikken av feilutsatte PCR har vært tilgjengelig i flere tiår. Hvis brukeren velger, kan de søke en metode for å manuelt utføre feilutsatte PCR27 uten å bruke et kommersielt tilgjengelig mutagenese kit.
Som en forholdsregel er falsk positiv rate av denne protokollen ganske høy. Dermed bør mutant kandidater gjennomgå en rekke screenings å luke ut de falske positiver. Vi fant at stille inkorporering av en begrensning området i målet genet kan hjelpe unngå å emnet falske positiver til relativt arbeidskrevende trinn i rekkefølgen. Dette er kostnadseffektiv, som mutant kandidater kan nummer i hundrevis eller enda lenger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Midler støtte til dette prosjektet ble gitt av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap og IKT (2016R1A2B2006354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
- Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
- QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
- pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
- QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
- QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
- PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
- Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
- GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
- Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).
