Summary
Burada, biz mevcut her iki mimari beyannamedir bir 3D organotypic Melanom küresel Cilt modeli oluşturmak için bir protokol ve bir organ/tümör vivo içinde ama aynı zamanda çok hücreli karmaşıklık barındırır sistematik deneysel müdahale.
Abstract
Malign transformasyon melanosit, insan derisi, pigment hücrelerinin, melanom, artan metastatik potansiyeli olan son derece saldırgan bir kanser oluşumuna neden olur. Son zamanlarda, mono-chemotherapies Melanom belirli birleşimi terapileri ile hedeflenen kinaz inhibitörleri tarafından geliştirmeye devam. Yine de, tümörleri birincil direnç gösteren veya yeni tedaviler, böylece tumorigenic kapasite yeniden kazanmak için direnç geliştirmek çünkü metastatik Melanom yaşamı tehdit eden bir hastalık kalır. Malign melanom tedavi başarısını artırmak için moleküler mekanizmaları konvansiyonel tedavi yaklaşımları karşı direnç veriyor belirlenmesi gereklidir; Ancak, yenilikçi hücresel vitro modelleri gerektirir. Burada, yeni görüşler beyan ve malign melanom vivo içinde mimarisini tasvir bir vitro üç boyutlu (3D) organotypic Melanom küresel modeli tanıtmak içi-tumoral yanı sıra tümör-ana etkileşimler. Model olgun ve farklılaştırılmış Melanom pulcuklarının birincil cilt hücrelerinin oluşan bir 3D insan tam cilt yeniden yapılanma modeli tanımlanmış numaralarını içerir. Katıştırılmış Melanom pulcuklarının hücresel kompozisyon ve farklılaşma durumunu kutanöz Melanom metastazı içinde vivobirine benzer. Platform eleme bir ilaç için cevaplama tanımlaması desteklemiyor olabilir gibi bu organotypic Melanom küresel model kullanarak kombinasyon tedavileri, seçili olmayan böylece yararına artan cevaplama için gereksiz tedavi yük tutumlu süre tedavi müdahaleler.
Introduction
İnsan derisi vücut koruma konusunda olumsuz çevresel etkileri1' den farklı işlevlere hizmet eden iki ayrı bölmeleri oluşur. Alt dermal bölmenin bir fibro-elastik bağ dokusu oluşur. Gevşek bağlı kollajen ve elastin lifleri mekanik bariyer fonksiyonu hizmet fibroblastlar tarafından sentezlenen oluşur. Dermisin üst epidermis bir hücre dışı matriks nedeniyle her iki cilt bölmeleri arasında sürekli bir iletişim olarak üretilen bazal lamina ayrılır. Dermis, aksine epidermis skuamöz epitel keratinositler esas olarak oluşan olduğunu ve dört katmanlara ayrılır. Stratum basale sürekli cilt progenitor hücrelerini stratum spinosum ve stratum granulosum aşamalarından stratum korneum stratifying türetilen farklılaşmamış bazal Lenfositi oluşur vücudu su kaybı ve enfeksiyonlar2den korumak için. Melanosit bazal membran hizalanır ve birden çok Lenfositi ile dendritik uzantıları aracılığıyla iletişim. Deri dokusu deri yaşlanma, immünosupresyon, inflamasyon ve indüksiyon Sigara Melanom cilt kanseri gibi UV radyasyon olumsuz etkilerinden korumak için pigment melanin üretiyorlar. UV ışınlarına katkı dönüşümü ile Malign Melanom melanositlerin be altında hala3tartışma.
Melanom geliştirme farklı tümör ilerleme aşamaları Ayrıştırılan ve bazı genetik, morfolojik ve histolojik değişiklikler4tarafından karakterize. Her iki de novo kaynaklanan veya doğuştan gelen veya alınan nevus nedeniyle bir yerel dan iyi huylu neoplazi neden melanosit çoğalması artırın. Bu öncül lezyon ilk malign sahne alanı'na, radiyal büyüme aşaması (alp) devam edebilir atypic hücreleri içeren yapısal olarak değiştirilmiş displastik dokusuna dönüştürebilir. Bu erken tümör ilerleme aşaması radyal birkaç yerel olarak invazif hücrelerin papiller dermiste içinde gösterilen epidermiste Proliferasyona hücreleri ile karakterizedir. Sırasında sonraki dikey büyüme aşaması (VGP) Melanom hücreleri zaten dermis ve subkutan doku5derin parçalar sızmaya bazal lamina kırarak metastatik ve invaziv fenotip gösterir. Son olarak, metastatik Melanom (MM) en agresif ilerleme sahne sistemik klemple organlara karaciğer, akciğer ve beyin6gibi istila etmek için kan ve lenf sistemi boyunca yayılan metastatik hücrelerle temsil eder.
Bugüne kadar erken tanı cerrahi ile takip hala en etkili tedavi Malign Melanom ve kalır. Klasik kemoterapi rejimleri sadece küçük hayatta kalma parası8,9görüşmek çünkü uzak metastaz olan hastalar için prognoz ancak, özellikle yoksul7, kalır. Ancak, durgunluk onlarca yıl sonra son gelişmeler hedefli tedaviler oldukça Malign Melanom prognozunda iyileştirilmiştir.
Bozukluk iki büyük mitojenle aktif yolları, RAS-RAF-MEK-ERK ve PI3K-AKT-PTEN sinyalleşme yolları mevcut Melanom progresyon tuşu sürücüleri ne zaman özellikle yapısal proto-oncogenes BRAFV600 nokta mutasyonlar harekete geçirmek ve NRAS mevcut10vardır. Buna göre hedeflenen kinaz inhibitörleri icadı için metastatik melanom hastalarda terapötik yararı söz verdim. Bu noktaya yapılan klinik çalışmalarda çok sayıda metastatik melanom hastalarda önemli yararı elde değil. Kısmi, birincil direnç gösteren hastalar subpopulation ile neredeyse tüm yanıtlardır. Ayrıca, ikincil direnç relapse için önde gelen edinimi hastalar11,12çoğunda gözlendi.
Yalnız mutasyon durum analizi en etkili tedavi stratejisi geliştirmek için yeterli değildir netleşiyor. Yeni hızlı ve güvenilir tanı araçları sistematik olarak kaydetmek ve bireysel kanser hücrelerinin yanıt çözümlemek gereklidir. Şu anda kullanılabilir veri insan Melanom üzerinde büyük çoğunluğu iki boyutlu (2D) melanom hücre kültürleri elde etmiş olursunuz. 3D yetişkin tümör hücreleri, ancak, farklılaştırılmış kanser arasındaki hücreler arası çapraz karışma hücre altgrupları de kanser hücrelerinin ve çevredeki ev sahibi olmayan dönüştürülmüş doku sağlar. Bu nedenle, hangi Melanom geliştirilen preklinik tarama olarak kullanılmak üzere 3D ortamı yeniden oluşturmak en iyi model13,14.
Protocol
Tüm insan doku çalışması onaylı kurumsal iletişim kuralları kullanılarak gerçekleştirildi.
1. ayrılması Dermis ve Epidermis insan deri (sünnet çocuk sünnet)
- Sünnet (genellikle 1-2 cm2) bir sigara yapışkan steril hücre kültür tabak (Ø 10 cm) yerleştirin ve fosfat tamponlu tuz+ 10-12 mL ile kapak (PBS, 0,5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, pH 7.2 PBS+=). Tüm aşırı (yağ) doku steril neşter ve forseps kullanarak kaldırın.
- Cilt 3 mm x 5 mm parçalar halinde kesip, onları PBS ile yıkayın ve bir yapıştırıcı steril hücre kültür çanak (Ø 6 cm) aktarmak. Dispase çözüm (2 U/mL PBS) 5-7 mL ile doku parçaları kapsayacak. Parafin film ile hücre kültür çanak mühür ve 4 ° C'de 16 h için kuluçkaya
- Epidermal dermal bölümünden iki steril forseps ile geri çek. Disseke doku parçaları tek tek yapışkan olmayan hücre kültür yemekleri (Ø 6 cm) aktarmak ve her-in onları PBS+ile kaplayın.
2. birincil Lenfositi Epidermis den yalıtım
- Dikkatle PBS+ bir Pasteur pipet kullanarak hücre kültür çanak kaldırmak ve epidermal doku parçalar (bölümünde 1,3) PBS ile yıkayın. Epidermis (1 mm2) daha küçük parçalar halinde kesilmiş ve onları bir 50 mL konik tüp içinde toplamak. 10 mL 1 ekleyin tripsin-EDTA (37 ° C'ye ısıtılmış) x ve 37 ° C'de bir su banyosunda 5 min için kuluçkaya Girdap doku süspansiyon her 2 dak.
- Enzimatik reaksiyon 1 mL fetal buzağı serum (FCS) ekleyerek durdurmak. Hücreleri yukarı ve aşağı 4 dk. kabarcıklar önlemek ve köpük oluşumu için denemek için bir 10 mL plastik pipet ile pipetting tarafından resuspend.
- Damlalıklı hücre süspansiyon bir hücre süzgeç (gözenek boyutu 100 µm), içine taze 50 mL konik tüp üstüne yerleştirilir ve 3 x 5 mL PBS ile durulayın. 2-6 mL kültür %1 (v/v) viomisin içeren ortamda hücre Pelet 5 dk. Resuspend için hücreleri 200 x g, santrifüj kapasitesi. Cep numarasını el ile hemasitometre ve tohum 6 x 105 hücrelerdeki sayım hücreleri tarafından bir T75 hücre kültür şişesi belirlemek.
3. birincil Lenfositi tarımı
- Birincil Lenfositi adım 2.3 37 ° C ve % 5 CO2 keratinosit Orta'de bir hücre kuluçka olmadan FCS, % 50-70 confluency izole kuluçkaya.
- Keratinositler dikkatle geçiş için orta kaldırmak, 5 mL PBS-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika için hücreleri kuluçkaya Hücre kültür şişeye hafif bir mikroskop altında dan ayırmak başlamıştır kontrol (4 X büyütme: hücreler yuvarlak görünür, ancak hala takılı!). Aksi takdirde, eski PBS-EDTA taze PBS-EDTA ile değiştirin ve yeniden başka bir 10 dakika 37 ° C'de kuluçkaya
- 5 mL 1 eklemek x tripsin-EDTA yuvarlak hücrelere hala 10 mL PBS-EDTA ile kaplı ve onları yeniden için 1-3 dk. 37 ° C'de kuluçkaya 1 mL FCS ekleyerek enzimatik reaksiyon durdurmak ve 50 mL konik tüp içinde müstakil hücreleri toplamak. Hücreleri 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi, Pelet keratinosit orta ve tohum 6 x 105 hücre taze bir T75 hücre kültür şişesi resuspend.
Not: organotypic cilt yeniden yapılandırır oluşturmak için birincil Lenfositi 3-4 geçiş daha geç kullanılmalıdır.
4. yalıtım Dermis gelen birincil fibroblastlar
- Dermal doku (bölümünde 1,3) (1 mm2) daha küçük parçalar halinde kesilmiş ve 50 mL konik tüp içine aktarabilirsiniz. 10 mL collagenase-çözüm (5 U/mL PBS+) ekleyin ve 37 ° C'de bir su banyosunda 45 dk için kuluçkaya Doku parçaları ve hücreleri 200 x g 5 min için de karışımı santrifüj kapasitesi.
- Hücre Pelet iki kez 10 mL DMEM içeren 4,5 g/M glikoz ve L-glutamin içeren, ancak L-Pyruvate yıkayın. Son olarak doku parçaları 2 mL % 1 ' (v/v) viomisin ve % 10 FCS içeren DMEM resuspend. Onları bir T25 hücre kültür şişesi aktarın ve onlara bir hücre kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 gecede kuluçkaya.
Not: Küçük hacimli fibroblastlar doku-enkaz dışında geçirmek izin verir ve onları kültür şişeye takmak için zorlar. - Ertesi sabah, başka bir 6 mL DMEM/viomisin/FCS ekleyin ve 2-3 gün 37 ° C'de % 80-90 confluency hücreleri gelinceye kuluçkaya.
5. birincil fibroblastlar tarımı
- Fibroblastlar geçiş için orta kaldırın ve yapışık hücreleri PBS ile yıkayın. 5 mL 1 ekleyin tripsin-EDTA x ve 37 ° C'de 3 min için kuluçkaya
- Enzimatik reaksiyon 5 mL DMEM/FCS ekleyerek durdurmak ve 50 mL konik tüp içinde müstakil hücreleri toplamak. Hücreleri 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi, Pelet DMEM ortamda resuspend ve 6 x 105 hücre taze bir T75 hücre kültür şişesi tohum.
Not: organotypic cilt yeniden yapılandırır oluşturmak için birincil fibroblastlar 4-6 geçiş daha geç kullanılmalıdır.
6. nesil 3D Melanom pulcuklarının yolu ile asılı bırak yöntemi
- Kültür Melanom hücreleri (Örneğin, 451-LU veya herhangi bir melanom hücre satırı ilgi) göre % 10 FCS15içeren RPMI kullanarak genel iletişim kuralları.
- Melanom pulcuklarının benzer boyutu ve kalitesi oluşturmak için PBS Melanom hücreleri yıka, tripsin-EDTA içinde PBS bir T175 hücrelerde hücre kültür şişesi ve oda sıcaklığında (RT) 3-5 min için kuluçkaya 1 x 5 mL ekleyin. Tripsin 5 mL RPMI/10% FCS ekleyerek etkisiz hale getirin. Hasat hücreleri tarafından Santrifüjü 200 x g 5 dakika süreyle, hücre Pelet RPMI/FCS içinde 10.000 hücre/mL bir hemasitometre sayılarak belirlenen son bir konsantrasyon, yeniden askıya alma.
- (= 250 hücre) 40 x 25 µL elektronik bir çok pipet kullanarak hücre süspansiyon steril olmayan yapışkan hücre kültür çanak (Ø 10 cm) kapak iç yüzeyine nokta. Hızlı ama düzgün hareketi ile kapak dön ve 5 mL PBS içeren ilgili hücre kültür çanak yerleştirin.
- "Damla yemekleri bir hücre kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 kullanılan hücre türüne bağlı olarak 10-14 gün boyunca asılı" kültür.
Not: MM büyüme aşaması hücrelerden genellikle daha hızlı büyümek ve içinde asılı damla alp veya VGP türetilmiş Melanom hücrelere kıyasla daha sağlam pulcuklarının oluştururlar. Bireysel değerlendirme için küresel büyüme ışık mikroskobu (4 X büyütme) altında veya dürbün çifti gözlemlemek. Genellikle, pulcuklarının sonra 48 h ışık mikroskobu (4 X büyütme) altında veya dürbün çifti algılanabilir hale. 10-14 gün sonra onlar herhangi bir büyütme aygıt ezelî görülebilir.
- "Damla yemekleri bir hücre kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 kullanılan hücre türüne bağlı olarak 10-14 gün boyunca asılı" kültür.
- 5 gün sonra ilk açılan lekelenme, taze RPMI/10% FCS orta 10 µL her damla ekleyin. Daha sonra exchange 10 µL orta her geçen gün. Elektronik bir dağıtıcı kullanımı bu adımda çok yararlıdır.
- Hücre türüne bağlı olarak, 10-15 gün sonra tarafından yavaşça onları kapalı hücre kültür çanak kapak PBS ile durulama (Ayrıntılar için 10 bölümüne bakın) pulcuklarının hasat. Bir taze yapışkan olmayan hücre kültür tabak içinde koleksiyon yapıyorum.
Not: Yetiştirme dönemi tümör büyüme aşamasına bağlıdır onlar başlangıçta elde edilmiştir, Melanom hücreleri Örneğin, 451-LU hücrelerden türetilmiş pulcuklarının çapı yaklaşık 500 µm için asılı damla15 kültür 12 gün içinde büyümek .
7. nesil Organotypic tam cilt Dermal bölmesinin yeniden yapılandırır
- 24-şey hücre gözenekli membran ekler (gözenek boyutu 8 µm) 24-şey levha yerleştirilir kullanarak cilt modelleri oluşturma.
Not: asılı kullanmak emin olun ama 6-şey plaka hava-sıvı ekimi daha sonraki bir aşamada içine yerleştirilir çünkü ekler, ayakta. - Jel nötralize çözüm (GNL)15, hem de kültür MM ve endotelyal büyüme medya (EGM)16,17anılacaktır ortam hazırlamak. Koagülasyon önlemek için mağaza kollajen tip ı (genellikle üzerinden fare kuyruğu, 3.5-4 mg/mL 0,02 N asetik asit) buza kadar kullanmak, RT jel başlar çünkü
- 1 x 105 fibroblastlar Ekle başına GNL içinde yeniden askıya almak ve hızlı bir şekilde oranı 1:3 500 µL/INSERT son hacmine, kollajen ile hücre süspansiyon karıştırın. Kabarcıklar cilt kalitesini bozabilen olarak yukarı ve aşağı kabarcık oluşumunu önlemek için hafifçe pipetting tarafından Mix yeniden.
- Bireysel dermal jelleri onları olmadan orta RT 30 dk içinde steril bir başlık için tutarak yerleşmek izin verir. Daha sonra her jel 4,5 g/M glikoz, % 1'i içeren DMEM ile kapak L-glutamine, % 10 FCS ve L-pyruvate, olmadan ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
8. nesil Organotypic tam derinin Epidermal bölme yeniden yapılandırır
- Ertesi gün Orta dermal jelleri kaldırmak ve onları 37 ° C'de 2 h için EGM medya (% 10 FCS, %1 PenStrep, 10 mg/mL gentamisin) ile equilibrate Orta geri çekilin ve dikkatle 100 µL EGM dermal jel üstüne resuspended 1 x 105 Lenfositi tohum.
- Kuluçkaya 1,5 saat 37 ° C'de Lenfositi dermal bölüme bağlı kalmak izin vermek için yeniden yapılandırır.
Not: Bu kuluçka süresi sırasında fibroblast kaynaklı daralma nedeniyle küçültmek ve böylece, en azından kısmen ayırmak Ekle duvarlarından jelleri başlayacaktır. - Yaklaşık 800 µL EGM cilt eşdeğerleriyle kapak ve dikkatli bir şekilde küçük (beyaz) pipet ucu ile INSERT duvardan kalan jel çıkarın. EGM içinde bir hücre kuluçka 37 ° c, % 5 CO2, 7 gün sular altında deri eşdeğerleri kültür ve orta her gün değiştirin.
Not: Bu süre içinde deri eşdeğerleri önemli ölçüde küçülür.
9. Organotypic tam cilt hava-sıvı tarımı yeniden yapılandırır
- Gün 8, transfer her 6-şey plaka bireysel bir kuyunun içine yerleştirin. Sadece böylece cilt yeniden yapılandırma orta kuyu dibinden ile sağlanan ancak orta ile kapsamına girmeyen MM orta 1.2-1.4 mL her şey için ekleyin.
Not: Stratifikasyon epidermal bölümü ve tam cornified katman (stratum korneum) kurulması ekimi hava-sıvı arayüzü sağlar. - Sonraki 10-17 gün boyunca orta 9.1 her gün bölümünde belirtilen şekilde değiştirin. Bu dönemde, uyuşturucu veya diğer uyaranlara orta olarak gerektiği gibi ekleyin. Dikkatle tam cilt yeniden yapılandırma daha fazla çözümleme için Örneğin, immunohistokimyasal analiz (Şekil 1) eğri Cımbız kullanarak gözenekli membran Ekle Kaldır.
10. nesil Organotypic Melanom küresel cilt modelleri
- Melanom pulcuklarının organotypic tam cilt yeniden yapılandırır dermal yuvası içine entegre etmek için dikkatle (sonra adım 6.4) pulcuklarının asılı kapağını kapalı durulama PBS ile damla hücre kültür çanak. 10-20 pulcuklarının/INSERT bir steril olmayan yapışkan hücre kültür tabak içinde toplamak. Aşırı PBS Pasteur pipet ile dikkatli bir şekilde çıkarın.
- EGM, mümkün olan en küçük birim pulcuklarının Aspire edin. Bu noktada gözlemlemek ve çıplak gözle olmadan daha fazla büyütme aygıt pulcuklarının saymak. Cilt modeli/jel, başına 10-20 pulcuklarının 10.1. adımda belirtilen şekilde alın.
- Onları fibroblastlar (adımı sırasında 7.3) içeren GNL istenen hacmi takabilir ve kollajen türü ile karıştırın. Bu basamakta 7,3-9.1 bölümlerinde açıklandığı gibi devam.
Not: Tümör pulcuklarının beyaz noktalar (Şekil 2) dermal jel görünür hale gelir
Representative Results
Melanom metastazı başarılı tedavi tümör hücreleri de tümör arasında ve sigara dönüştürülmüş konak hücreleri arasında çapraz konuşma tarafından etkilenebilir. Kanser vitro organotypic modellerinin geliştirilmesi amacıyla 3D organizasyon ve insan Melanom karmaşıklığı özetlemek uygun preklinik test sistemleri sağlamaktır içinde vivo. Bu bir organotypic ve paralel çevreleyen birincil doku üzerinde olumsuz etkileri içinde tümör üzerinde tedavi edici etkisi çalışma sağlar.
En iyi organotypic ten modellerinin geliştirilmesi için primer hücre kalitesi çok önemlidir. Onlar genellikle daha az yetişkin birincil deri hücreleri ile karşılaştırıldığında ayırt çünkü Juvenil birincil fibroblastlar ve keratinositler, kullanmak avantajlıdır. Juvenil cilt hücreleri ya çocuk sünnet 1-5, protokolü bölümlerinde açıklandığı gibi izole olamaz ancak aynı zamanda Doğum öncesi birincil fibroblastlar ve Lenfositi olarak şirketlerden satın. Satın alma, bu sipariş hücrelere farklı bağışçılardan donör özgü sonuçlar Örneğin, uyuşturucu hassasiyeti önlemek için gereklidir. Tüm iletişim kuralı olarak Şekil 3düzeninde görüntülenir.
Kalite kontrolü 3D tam-deri eşdeğerleri immunohistokimyasal analiz gerektirir. Bir ilk izlenim hematoksilen-eozin tarafından elde edilebilir (H & E) parafin boyama gömülü bölümleri (3 µm). Epidermal farklılaşma kalitesini detaylı analiz ve dermis ve epidermis arasındaki bazal lamina oluşumu özel antikorlar karşı bir epidermal stratifikasyon işaretleyici kullanarak immunohistokimyasal analiz gerektirir. Bu farklılaşmamış, son derece proliferatif hücreler arasında ayrım bazal membran yakın bulunan ve son derece farklılaşmış ve farklı epidermal katmanları oluşumu aracılığıyla stratum korneum hücreleri arasında keratinli sağlar . Bağışıklık histolojik boyama tarafından gösterildiği gibi (Şekil 4), keratinositler epidermis boyunca farklılaşma elde edilebilir normal ciltler için benzer: esas olarak daha düşük epidermal katmanlardan farklılaşmamış hücreleri (tabaka basale ve stratum spinosum) supra bazal katman (stratum granulosum ve stratum korneum) daha farklılaştırılmış hücrelerden 10 ve involucrin için keratin pozitif leke ederken keratin 14, pozitif leke. Buna göre filaggrin boyama sadece stratum korneumson derece farklı hücrelerde gözlenen. En önemlisi, laminin 5 boyama bazal lamina fizyolojik olarak epidermal yapay deri yeniden yapılandırma dermal bölüme bağlanmak için oluşturulan ortaya koymaktadır. Bu iletişim organotypic microenvironment konak Melanom hücreleri veya pulcuklarının fizyolojik ve etyopatogenezi analizi için oluşturulan kanıtlıyor.
Melanom uyuşturucu tarama amacıyla tek Melanom hücreleri de de novo Melanom yuva oluşumu18,19izin vermek için tam deri eşdeğerleri dermis entegre edilebilir. Bu nedenle, Melanom hücreleri 5:1, centrifuged 200 x g 5 min için de birlikte oranında, birincil fibroblastlar ile birlikte ve kollajen ile karıştırma önce GNL içinde resuspended. Sonuç olarak, melanom hücre yuva kendiliğinden dermal kompartımanda oluşturacak. Bizim deneyim göre yalnızca hücreleri metastatik büyüme formu uygun yuva, alp veya VGP15Melanom hücrelere göre evre. Bir büyük dezavantaj modelleri bu tür sayısı ve boyutu Melanom yuva kurdu bilinemez ve bireysel cilt arasında değişebilir gerçektir, herhangi bir tedavi bağımsız olarak yeniden yapılandırır. Örneğin, 1000 hücreleri dermal bölmesine seribaşı oluşan 100 hücreleri ya da 100 yuva her (Şekil 5) 10 hücrelerinin oluşan 10 yuva kazanırlar. Bu biyolojik değişkenlerini üç eksiklikleri ile sunmak: ilk olarak, melanom yuva kurdu boyutunu ve sayısını tahmin edilemez; İkinci olarak, metastaz vivo içinde Melanom yuva genellikle daha büyük ve daha karmaşık bir içi tumoral çeşitlilik sergiler; ve üçüncü olarak, sınırlı yaşam süresi tümör-nest modelleri, nedeniyle tedavi erken başlatılır ve sonuç olarak oldukça tümör yapılan regresyon varolan tümör yuva neden yerine engeller.
Bu sınırlamalar organotypic Melanom küresel cilt modelleri üstesinden gelmek için oluşturulabilir. Bir asılı hücreler için 14 gün20damla kodlamayla 250 metastatik Melanom tarafından pulcuklarının kompakt bir yapı yaklaşık 500 µm taklit olmayan bir son çapı ile sunulması hücreleri skarların kalıcı Melanomu oluşan tekrarlanarak üretilen tümör düğümleri, mikro-metastaz veya arası kılcal mikro bölgeler solid tümör21,22. Genel olarak, herhangi bir melanom hücre kültürünü pulcuklarının idam yoluyla nesil için uygun bırakma yöntemi; Ancak, hücre türetilen daha erken ilerleme aşamaları, Örneğin, alp türetilmiş hücre satırları kıyasla daha sağlam pulcuklarının metastatik tümör aşamaları formu gelişmiş.
Bazı hücreler için idam viskozite geliştirmek uygun küresel oluşumu için avantajlı damla kültür orta. Bu 10-%50 metil selüloz kültür ortamına ilavesi ile elde edilebilir. Metil selüloz hisse senedi için çözüm, otoklav 1,2 g metil-selüloz ile birlikte 100 mL Cam şişe manyetik heyecan barda. 100 mL önceden ısıtılmış (60 ° C) orta ve heyecan için oda sıcaklığında 20 dk ve başka bir 1-2 h 4 ° C'de ekleyin 2 h 5000 x g de hisse senedi üçün santrifüj kapasitesi ve viskoz süpernatant 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
Tam deri Melanomu küresel modeller uygun doğrulama olduğu gerçeği ile tanımlanmış bir numara Melanom pulcuklarının can - en azından istatistiksel - dermal fibroblast/kollajen entegre Cilt modeli inşaat 1 gün iskele sağlanan izin Onları 25-27 gün daha epidermal farklılaşma sırasında işbirliği geliştirmek için. Çünkü beyaz noktalar şeffaf dermal jel ve herhangi bir büyütme aygıt (Şekil 2) ezelî görülebilir pulcuklarının görünür pulcuklarının verimini doğrudan tohum sonra analiz edilebilir. Sonuç olarak, bir 3B cilt modeli kültürlü vitro yaklaşık 42 gün içi tumoral en üst düzeyde gösterilen toplam olmuştu limanları olgun Melanom pulcuklarının farklılaşma15hücre oluşturulur.
H & E deri Melanomu küresel model boyama histolojik görünüm ve hücresel olmayan skarların insan Melanom Deri Metastazlari vivo içinde15 (Şekil 6 bir çok benzer şekilde Melanom pulcuklarının dağılımını ortaya çıkarır ). Melanom hücreleri iki altgrupları bu koşullarda açıkça ayırt: periferik Proliferasyona subpopulation ve esas olarak oluşan bir merkez subpopulation çekmiş, apoptotik veya sözde şekillendirme nekrotik hücre "çürümüş" Merkezi. Hücreleri nekrotik Merkezi tünel boyama15tarafından görüntülenmeyecektir ise yaşayan ve altgrupları Proliferasyona Immunohistochemically KI-67, nükleer silahların yayılmasına karşı marker karşı antikor kullanarak tespit edilebilir. Bu belirli dağıtımı tümör hücre altgrupları, besin ve oksijen merkezi bölümünde nerede katabolik atık biriken eksikliği ortaya çıkan küresel boyutuyla (≥500 µm), garanti kapsamındadır. Burada sağlayacaktır sağlanan güvenilir ve tekrarlanabilir organotypic nesil protokol sonrası insan tam kalınlıkta deri modeli ile insan melanom cilt metastazı taklit insan Melanom pulcuklarının gömülü. Uygulamalar bu modeli Ekle uyuşturucu test, toksinler, eleme kozmetik bileşikler etkisi veya lazer tedavisi Melanom akıbet ve tedavi.
Resim 1 : 3D organotypic cilt yeniden yapılandırır tarımı batık ile orta ve hava-sıvı arayüzey. Gün birincil keratinositler birincil fibroblastlar içeren dermal bölme üstünde tepe-in seribaşı 0 gömülü bir kollajen türüne ben matris. 3B cilt yeniden yapılandırır EGM ile 7 gün boyunca batık ekili kal, INSERT duvardan ayırmak ve daralma başlatın. Gün 8 ekler 6-wells için transfer ve epidermal stratifikasyon izin vermek için hava-sıvı arayüzü ekili. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Melanom pulcuklarının dermal yuvası içine katıştırılmış beyaz noktalar görünür. 3B cilt yeniden yapılandırma, melanom pulcuklarının sayıda dermal bölmesinin hazırlanıyor fibroblast kollajen türü için ekledi süre karıştırın. Dermal jel yerleşmiş sonra Melanom pulcuklarının beyaz noktalar görünür hale gelir.
Şekil 3 : 3D organotypic Cilt modeli inşaat düzeninin. Yağ dokusu deri örneğinden kaldırmak ve daha küçük parçalar halinde kesin. Kuluçka dispase çözüm gecede 4 ° C'de ile dermis epidermis ayrılması kolaylaştırır. İzole birincil fibroblastlar ve Lenfositi ayrı ayrı ekili ve 4-6 ve 3-4, geçit arasında sırasıyla kullanılır. Daha sonra 3B cilt model nesil iletişim kuralında tanımlandığı gibi devam edebilirsiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : 3D organotypic cilt yeniden yapılandırır göstermek bir farklılaşma düzeyi normal insan deri benzer. Alkol deri eşdeğerleri bölümlerini (a)kıyasla normal insan derisi (B) keratins 14 ifade için lekeli (kırmızı: λex 554 nm; λem 568 nm) ve 10, involucrin (yeşil: λex 490 nm; λem 525 nm ), filaggrin (yeşil: λex 490 nm; λem 525 nm) ve laminin 5 (yeşil: λex 490 nm; λem 525 nm) ve confocal floresan mikroskop ile analiz. Hücre çekirdeği görselleştirildiği DAPI boyama tarafından (mavi: λex 340 nm; λem 488 nm). Normal insan deride görülen epidermis ayrı katmanlar oluşturan deri eşdeğerleri ortaya doğru epidermal stratifikasyon 3D tam kalınlığı immunohistokimyasal incelenmesi. Alt epidermal katmanlardan hücreleri keratin 14 için olumlu lekeli iken, daha fazla hücreleri keratin 10 ve involucrin boyama gösterdi supra bazal katmanından farklı. Stratum korneum yakın son derece farklılaşmış hücreler filaggrin dile getirdi. Laminin 5 boyama bazal lamina fizyolojik olarak epidermal dermal yuvası (en düşük fiyat paneli) bağlanmak için oluşturulan gösterir. Bu rakam Voersmann vd alınmıştır 15 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Kendiliğinden oluşan Melanom yuva boyutunu ve sayısını bilinemez. De novo Melanom yuva oluşumu dermal yerde tam deri eşdeğerleri Melanom sayıda karıştırılarak elde edilebilir hücreleri kollajen tipinde her iki hücre tipleri katıştırmak için birincil fibroblastlar ile ben matris. Kendiliğinden oluşan Melanom yuva boyutunu ve sayısını sadece olgun 3B cilt yeniden yapılandırma yaklaşık 21 gün sonra gelen analiz edilebilir. İki örnek(a)tasvir ve (B), sayıları ve boyutları Melanom yuva bireysel cilt yeniden yapılandırır arasında değişebilir. Sonuç olarak, bu modeller doğrulamak ve tedavi edici etkisini tahmin etmek zordur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Deri eşdeğerleri entegre Melanom pulcuklarının özetlemek anahtar şekil-in insan kutanöz Melanom metastazı. H & E deri eşdeğerleri gömülü tümör pulcuklarının bölümlerini parafin lekeli pulcuklarının temel özellikleri ile sigara skarların insan kutanöz Melanom Metastazlari vivo içindepaylaşmak için ortaya koydu. İki hücre altgrupları açıkça ayırt: periferik yaşam subpopulation ve esas olarak oluşan Merkez subpopulation çekmiş, apoptotik veya "çürümüş" Merkezi oluşturan nekrotik hücre. Bu şekilde dağıtılması, tümör hücre altgrupları küresel boyutuna göre garantilidir. Bu rakam Voersmann ve ark. değiştirildi 15 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Burada tanıtılan organotypic Melanom küresel Cilt modeli içi tumoral daha derin bir anlayış yeni trendleri garanti eder ve tümör-ana etkileşim ve tümör gelişiminin moleküler mekanizmaları incelemek için bir gelişmiş tarama platform sağlayabilir ve terapi direnç içinde belgili tanımlık gelecek.
En iyi garanti altına almak için fizyolojik ve cilt koşulları taklit vivo içinde yeniden yapılandırır, primer hücre kalitesi son derece önemlidir. Yukarıda belirtildiği gibi çocuk veya Doğum öncesi cilt hücrelerini en düşük farklılaşma sınıf göstermek ve bu nedenle en iyi tam kalınlıkta deri eşdeğerleri oluşturmak uygundur. İlk mümkün kalite kontrol Lenfositi tohum ve EGM (iletişim kuralı Bölüm 8.2 ve 8.3) jöleye sıcaklığına sonra 2 gün dermal daralma ölçüde olduğu. Dermal jelleri fibroblastlar en kaliteli en küçülür. Ayrıca, çok az veya çok fazla fibroblastlar entegrasyonu dermal kasılma ve sonuç olarak epidermal eki dermal yuvası bozabilen. Bu işlem bir kapsamlı çapraz-hadis dermal ve epidermal hücrelerin arasına gerektirdiğinden bu sırayla epidermal farklılaşma, tehlikeye sokacaktır.
Primer Hücre kalitesi de eleştirel hücre confluency gibi hücreleri geçirilmesi bağlıdır. Lenfositi ≥80% confluency için yetiştirilen iseniz hemen Proliferasyona durdurmak ve ayırt etmeye başlar. Bu nedenle onları 40-%70 confluency için passaging sırasında kültür ve Hayır passage 3-4 daha sonra kullanmak önemlidir. Fibroblastlar daha az duyarlıdır ama 4-6 geçiş daha sonra kullanılmamalıdır. Ayrıca tüm primer hücre ve hücre hatları organotypic Melanom küresel cilt modelleri oluşturmak için kullanılan kültürlü unutmayın antibiyotik özgür ve bu nedenle kirlenme riski yüksektir. Ancak, antibiyotik ilavesi tek tek hücre fizyolojisi değiştirir ve bu nedenle deri eşdeğerleri kalitesini azaltır.
Genel olarak, tümör küresel oluşumu neredeyse her türlü tümör hücre satırları ve aynı zamanda taze hasta malzemeden izole tümör hücreleri mümkündür. En iyi küresel boyutlar kazanıyor için ilk cep numarası ve/veya yetiştirme zaman kullanılan hücre türüne bağlı olarak değişebilir. 150-200 µm boyutuna kadar bir küresel içinde bulunan tüm hücreleri hala yeterince besin basit difüzyon yolu ile temin edilebilir. Sadece pulcuklarının boyutları ≥500 µm ile hücresel başkalaşım yüksek derecede göstermek ve sigara skarların tümör doku22tipik özelliklerini temsil eder.
Organotypic Melanom-küresel-cilt-burada geliştirilen model tümör-ana etkileşimler incelemek özellikle uygundur ve melanom uyuşturucu vivo içindealtında testi için-tarihlerde koşullar15. Yine de, melanom in vivo ortamda ilişkili tümör hücre tipleri bağışıklık hücreleri ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere, çeşitli barındıran daha karmaşıktır. Uygun birincil bağışıklık hücreleri ilavesi MHC sorunları yüzler beri bu modellerin henüz yeterli bağışıklık tedavi yaklaşımları izlemek mümkün değildir.
Yine de, melanom pulcuklarının taze izole hasta malzemeden üretilen ve tam cilt yeniden yapılandırma dahil bir kez bireysel uyuşturucu olarak hizmet eleme platformlar. Bile entegrasyon Melanom metastazı adet cilt yeniden yapılandırır özel bir tedavi yaklaşımı içinde uyuşturucu kombinasyonları test etmek için akla yatkın. Preklinik testi organotypic 3D Deride Melanom modeli dahil olmak üzere yalnızca en umut verici yeni tedavi kavramları ileri klinik test içine böylece aşınma oranı bunun için potansiyel yeni tedavilerin azaltarak alınır sağlamak olasıdır hastalık ve klinik çalışmalarda tedavi başarı oranı artan.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Hanna Voersmann 3D organotypic Melanom-küresel-cilt-model kurma ve mükemmel iletişim kuralları sağlamak için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca Silke Busch değerli teknik destek için teşekkür ederiz. İş BMBF e tarafından desteklenmiştir: Med programı "Melanom duyarlılığı" 031A423A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
| Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
| Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
| 24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
| cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
| Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
| Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
| Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
| juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
| juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
| DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
| Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
| EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
| Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
| Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
| Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
| dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
| L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
| anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
| anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
| anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
| anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
| secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
| secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |
References
- Boulais, N., Misery, L. The epidermis: a sensory tissue. Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).
- Shain, A. H., Bastian, B. C. From melanocytes to melanomas. Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).
- Clark, W. H. Jr Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer. Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).
- Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host. Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).
- Miller, A. J., Mihm, M. C. Jr Melanoma. N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).
- Balch, C. M., et al. Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification. J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).
- Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials. Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).
- Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma. Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).
- Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
- Flaherty, K. T., et al. Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).
- Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. Systemic therapy of metastatic melanoma. J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing. Cell Death. Dis. 4, e719 (2013).
- Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation. J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).
- Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).
- Sinnberg, T., et al. Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide. J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).
- Niessner, H., et al. The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells. J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).
- Foty, R. A. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
