Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57500
Automatic Translation
1, 1
1Experimental Dermatology, Medical Faculty, TU-Dresden

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء أورجانوتيبيك 3D الميلانوما جلد كروي نموذج الذي يلخص كل بنية وتعقيد متعددة الخلايا من الجهاز/ورم في الجسم الحي ولكن وفي الوقت نفسه يلائم المنهجية التجريبية التدخل.

Abstract

التحول الخبيث من الخلايا الصباغية، الخلايا الصبغية لجلد الإنسان، يسبب تشكيل لسرطان الجلد، سرطان عدوانية شديدة مع زيادة إمكانات المنتشر. في الآونة الأخيرة، مونو-تشيموثيرابيس مواصلة تحسين بسرطان الجلد تركيبة معينة العلاج بمثبطات كيناز المستهدفة. سرطان الجلد المنتشر لا يزال مرض يهدد الحياة نظراً لأن الأورام يحمل المقاومة الأولية أو تطوير المقاومة للعلاجات الرواية، وبالتالي استعادة القدرات الورمية. ضروري من أجل تحسين نجاح العلاج من سرطان الجلد الخبيث، تحديد الآليات الجزيئية التي تمنح المقاومة ضد نهج العلاج التقليدي؛ ومع ذلك، فإنه يتطلب نماذج مبتكرة الخلوية في المختبر . هنا، نحن نقدم في المختبر أورجانوتيبيك ثلاثية الأبعاد (3D) سرطان الجلد كروي نموذجا يمكن تصور البنية في فيفو الميلانوما الخبيثة وقد تضمن أفكاراً جديدة في داخل الأورام فضلا عن التفاعلات المضيف الورم. النموذج يتضمن أرقام محددة من الماغنيسيوم الميلانوما ناضجة والمتفاوتة في نموذج تعمير 3D جلد الإنسان كامل تتألف من خلايا الجلد الأولية. مركز التكوين والتمايز الخلوي الماغنيسيوم الميلانوما جزءا لا يتجزأ مشابهة للواحدة من الميلانوما الجلدية ورم خبيث في فيفو. استخدام نموذج كروي سرطان الجلد أورجانوتيبيك هذا دواء فحص منصة دعم تحديد المستجيبين لتحديد مجموعة من طرق العلاج، بينما تدخر عبء العلاج غير الضروري لغير المستجيبين، مما يؤدي إلى زيادة الاستفادة من التدخلات العلاجية.

Introduction

جلد الإنسان يتكون من اثنين من الأجزاء الأخرى المتميزة التي تؤدي وظائف مختلفة في حماية الجسم من الآثار الضارة بالبيئة1. حجرة الجلد السفلي يتكون من النسيج الضام الليفي مطاطا. وهو يتألف من ألياف الكولاجين والايلاستين فضفاضة متصلة توليفها من قبل الخلايا الليفية، تخدم وظيفة حاجز ميكانيكية. الأدمة مفصولة من البشرة العليا الصفيحة القاعدية التي تنتج كمصفوفة خارج الخلية بسبب اتصال مستمر بين المقصورات الجلد على حد سواء. وعلى النقيض من باطن الجلد، البشرة ظهارة الحرشفية الذي يتكون أساسا من الخلايا الكيراتينيه ويمكن أن تكون متباينة في أربع طبقات. باسل الطبقة يتكون من غير متمايزة الكيراتينيه القاعدية التي تنبثق باستمرار من خلايا الجلد السلف تساوت خلال مراحل أنواع الطبقة و الطبقة الحبيبية في الطبقة القرنية حماية الجسم من الجفاف والالتهابات2. الخلايا الصباغية هي الانحياز في الغشاء القاعدي، والتواصل من خلال ملحقات الجذعية مع الخلايا الكيراتينيه متعددة. وهي تنتج صبغة الميلانين لحماية أنسجة الجلد من الآثار الضارة للأشعة فوق البنفسجية، مثل شيخوخة الجلد والكبت المناعي والتهاب واستحثاث سرطان الجلد غير الميلانوما. الأشعة فوق البنفسجية الإشعاعات مساهمة لتحويل الخلايا الصباغية إلى الميلانوما الخبيثة، غير ما زال قيد المناقشة3.

تطوير الميلانوما متباينة في مراحل تطور الورم المختلفة، وتتميز ببعض التغيرات الوراثية والسمات النسجية4. أنها تنشأ أما حيثياته ، أو من وحمة الفطرية أو المكتسبة بسبب محلي زيادة انتشار الخلايا الصباغية تسبب نيوبلسا حميدة. تحويل هذه الآفة السلائف في الأنسجة ديسبلاستيك تم التعديل الهيكلي التي تحتوي على خلايا أتيبيك، التي قد تستمر إلى المرحلة الخبيثة الأولى، في مرحلة النمو شعاعي (RGP). وتتسم هذه المرحلة المبكرة من تطور الورم بالخلايا إشعاعيا تنتشر داخل البشرة، تظهر بعض الخلايا الغازية محلياً داخل الأدمة الحليمية. أثناء سرطان الجلد (VGP) المرحلة اللاحقة من النمو الرأسي إظهار الخلايا فعلا النمط الظاهري المنتشر والغازية باختراق الصفيحة القاعدية لاختراق أعمق أجزاء الأدمة، فضلا عن النسيج تحت الجلد5. وأخيراً، سرطان الجلد المنتشر (مم) يمثل المرحلة التقدم الأكثر عدوانية مع خلايا المنتشر عناصره ينتشر في جميع أنحاء نظام الدم والليمفاوية لغزو ديستالي أجهزة مثل الكبد والرئة والدماغ6.

حتى الآن، لا يزال التشخيص المبكر تليها الجراحة العلاج الأكثر فاعلية لسرطان الجلد الخبيث. غير أن يظل التشخيص للمرضى الذين يعانون من ورم خبيث البعيدة،7، لا سيما الفقيرة نظراً لنظم العلاج الكيميائي الكلاسيكي يضفي إلا القليل بقاء المنفعة8،9. ومع ذلك، بعد عقود من الركود، التقدم الذي أحرز مؤخرا في العلاجات المستهدفة قد تحسنا التشخيص لسرطان الجلد الخبيث.

التقلبات الكبرى mitogen تنشيط مسارين ورأس-سلاح الجو الملكي البريطاني--مجاهدي خلق-إيرك ومسارات الإشارات PI3K-عكة-فتن، يقدم الدوافع الرئيسية لتطور سرطان الجلد، خصوصا عند تنشيط مؤثرا الطفرات نقطة من BRAFV600 وبروتو و يتم تجاوزها الحالي10. وبناء على ذلك، وعدت اختراع المستهدفة kinase مثبطات فائدة علاجية للمرضى الذين يعانون من سرطان الجلد المنتشر. العديد من التجارب السريرية التي أجريت على هذه النقطة لم تحقق فائدة كبيرة للمرضى الذين يعانون من سرطان الجلد المنتشر. ما يقرب من جميع الردود جزئية، مع يتدنى مرضى تظهر المقاومة الأولية. وعلاوة على ذلك، لوحظ اقتناء الثانوي المقاومة مما أدى إلى انتكاسة في أغلبية المرضى11،12.

يصبح من الواضح أن تحليل حالة الطفرة وحدها ليست كافية لوضع استراتيجية علاجية أقوى. أدوات تشخيصية جديدة سريعة وموثوق بها ضرورية لتسجيل بشكل منهجي وتحليل مدى استجابة الخلايا السرطانية الفردية. قد تم الحصول على الغالبية العظمى من البيانات المتاحة حاليا بشأن سرطان الجلد البشري من الثقافات الخلية الميلانوما ثنائي الأبعاد (2D). الخلايا السرطانية، مع ذلك، نمت في 3D يسمح الحديث المتبادل بين الخلايا بين السرطان متمايزة الجمهرات الفرعية الخلية، وكذلك بين الخلايا السرطانية والأنسجة غير حولت المضيفة المحيطة. ولذلك، سيكون من الأفضل لإعادة بناء البيئة ثلاثية الأبعاد التي وضعت سرطان الجلد، لاستخدامها كفحص السريري النموذجي13،14.

Protocol

تم إجراء جميع الأنسجة البشرية العمل باستخدام بروتوكولات المؤسسية المعتمدة.

1-الفصل بين الأدمة والبشرة من الجلد البشري (القلفة الأحداث من الختان)

  1. ضع القلفة (عادة 1-2 سم2) في طبق ثقافة خلية معقمة غير لاصقة (Ø 10 سم) وتغطية ذلك مع 10-12 مل من المحلول الملحي مخزنة فوسفات+ (برنامج تلفزيوني، 0.5 مم مجكل2، كاكل 0.9 مم2، الرقم الهيدروجيني 7.2 = برنامج تلفزيوني+). قم بإزالة جميع الأنسجة (الدهنية) الزائدة باستخدام مشرط معقم والملقط.
  2. قص الجلد إلى قطع 3 مم × 5 مم وغسلها ببرنامج تلفزيوني، ونقلها إلى طبق ثقافة خلية معقمة غير لاصقة (Ø 6 سم). وتغطي قطع الأنسجة مع 5-7 مل ديسباسي الحل (2 U/mL في برنامج تلفزيوني). ختم الطبق ثقافة الخلية مع الفيلم البارافين واحتضانها ح 16 عند 4 درجة مئوية.
  3. سحب البشرة من الجزء الجلدي مع ملقط معقم اثنين. نقل قطع الأنسجة تشريح للفرد غير لاصقة خلية ثقافة الأطباق (Ø 6 سم) وتغطي كل منها مع برنامج تلفزيوني+.

2-عزل الخلايا الكيراتينيه الأولية من البشرة

  1. بعناية إزالة برنامج تلفزيوني+ من طبق ثقافة الخلية باستخدام ماصة باستور ويغسل قطع أنسجة البشرة (القسم 1.3) مع برنامج تلفزيوني. قطع البشرة إلى أجزاء أصغر (1 مم2) وجمعها في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. إضافة 10 مل 1 × التربسين-يدتا (يسخن إلى 37 درجة مئوية)، واحتضان لمدة 5 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. دوامة تعليق الأنسجة كل 2 دقيقة.
  2. وقف رد الفعل الأنزيمي بإضافة 1 مل مصل العجل الجنين (FCS). ريسوسبيند الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع 10 مل ماصة بلاستيكية لدقيقة 4 في محاولة لتجنب فقاعات ورغوة تشكيل.
  3. بيبيت تعليق خلية في خلية مصفاة (المسام حجم 100 ميكرومتر)، وضعت على رأس أنبوب مخروطي طازجة 50 مل، وشطف x 3 مع 5 مل برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا في ز 200 x للحد الأدنى 5 ريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط الثقافة 2-6 مل المتضمن مع الجنتامايسين 1% (v/v). تحديد عدد الخلايا يدوياً بواسطة عد الخلايا في خلايا 6 × 105 هيموسيتوميتير والبذور في قارورة ثقافة الخليوي T75.

3-زراعة الخلايا الكيراتينيه الأولية

  1. احتضان الكيراتينيه الابتدائي معزول في الخطوة 2.3 في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية و 5% CO2 في المتوسط keratinocyte دون سفح المنحدر القاري، إلى 50-70% كونفلوينسي.
  2. لمرور الخلايا الكيراتينيه بعناية إزالة المتوسطة، وإضافة 5 مل برنامج تلفزيوني-يدتا، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق إذا كانت الخلايا قد بدأت فصل من قارورة الثقافة تحت مجهر خفيفة (4 X التكبير: الخلايا تظهر مستدير الزوايا بل هي لا تزال تعلق!). إذا لم يكن كذلك، استبدال القديم برنامج تلفزيوني-يدتا يدتا برنامج تلفزيوني جديد وإعادة احتضانها لآخر 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 5 مل 1 x التربسين-أدتا إلى خلايا دائرية لا تزال مغطاة 10 مل برنامج تلفزيوني-يدتا وإعادة احتضانها لهم لمدة 1-3 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وقف رد الفعل الأنزيمي بإضافة 1 مل FCS وجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي الخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند بيليه في المتوسط keratinocyte والبذور 6 × 105 خلايا في T75 خلية ثقافة قارورة جديدة.
    ملاحظة: لتوليد يعيد بناء البشرة أورجانوتيبيك، الكيراتينيه الأولية يجب استخدام لا بعد مرور 3-4.

4-عزل الخلايا الليفية الأولية من الأدمة

  1. قطع الأنسجة الجلدية (القسم 1.3) إلى قطع أصغر حجماً (1 مم2) وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل. إضافة 10 مل كولاجيناز-الحل (5 U/mL في برنامج تلفزيوني+) واحتضانها لمدة 45 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. الطرد المركزي الخليط من قطع الأنسجة والخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق.
  2. أغسل بيليه خلية مرتين مع 10 مل دميم تحتوي على 4.5 غرام/لتر جلوكوز ولام الجلوتامين، ولكن دون بيروفات L. وأخيراً ريسوسبيند قطع الأنسجة في 2 مل دميم الذي يحتوي على 1% (v/v) مع الجنتامايسين والسفح 10%. تحويلها إلى قارورة ثقافة الخليوي T25 واحتضانها لهم في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية و 5% CO2 بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: حجم صغير يسمح الليفية لترحيل من الأنسجة-تحت الأنقاض ويجبرهم على إرفاق قارورة الثقافة.
  3. في صباح اليوم التالي، إضافة آخر 6 مل دميم/مع الجنتامايسين/FCS واحتضان لمدة 2-3 أيام عند 37 درجة مئوية حتى وصلت إلى الخلايا كونفلوينسي 80-90%.

5-زراعة الخلايا الليفية الأولية

  1. للمرور الخلايا الليفية وإزالة المتوسطة ويغسل خلايا ملتصقة مع برنامج تلفزيوني. إضافة مل 5 1 × يدتا التربسين واحتضان لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية.
  2. وقف رد الفعل الأنزيمي بإضافة 5 مل دميم/FCS وجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي الخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند بيليه في المتوسط دميم، والبذور 6 × 105 خلايا في T75 خلية ثقافة قارورة جديدة.
    ملاحظة: لتوليد يعيد بناء البشرة أورجانوتيبيك، الخلايا الليفية الأولية يجب استخدام لا بعد مرور 4-6.

6-جيل من سرطان الجلد 3D الماغنيسيوم عبر أسلوب قطره معلقة

  1. الثقافة الميلانوما الخلايا (مثلاً، 451، لو، أو أي خط خلية سرطان الجلد من الفائدة) وفقا للبروتوكولات العامة، استخدام ربمي الذي يحتوي على 10% FCS15.
    1. لتوليد سرطان الجلد الماغنيسيوم من حجم ونوعية مماثلة، يغسل خلايا سرطان الجلد في برنامج تلفزيوني، إضافة 5 مل من 1 x يدتا التربسين في برنامج تلفزيوني للخلايا في T175 خلية قارورة الثقافة، واحتضان لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تحييد التربسين بإضافة 5 مل RPMI/10% FCS. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 200 x 5 كحد أدنى لإعادة تعليق بيليه الخلية في ربمي/FCS بتركيز نهائي من خلايا/مل 10,000 حسبما يقرره عد في هيموسيتوميتير.
  2. بقعة 40 × 25 ميليلتر (= خلايا 250) تعليق خلية على السطح الداخلي لغطاء صحن الثقافة معقمة غير لاصقة الخلية (Ø 10 سم) ماصة إلكترونية المتعددة باستخدام. بحركة سريعة ولكنها ناعمة، يستدير الغطاء ووضعه على الطبق الثقافة كل منهما الخلية التي تحتوي على 5 مل برنامج تلفزيوني.
    1. ثقافة "أطباق قطره معلقة" في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 10-14 يوما، تبعاً لنوع الخلية المستخدمة.
      ملاحظة: الخلايا مرحلة النمو ملم عادة تنمو بشكل أسرع وتشكل الماغنيسيوم أكثر صلابة في إسقاط معلقة بالمقارنة مع خلايا الميلانوما المستمدة من RGP أو VGP. للتقييم الفردي، ومراقبة النمو كروي تحت منظار أو تحت مجهر خفيفة (4 X التكبير). عادة، تصبح الماغنيسيوم يمكن اكتشافها بعد 48 ساعة تحت منظار أو تحت مجهر خفيفة (4 X التكبير). بعد 10-14 يوما، تكون مرئية دون أي جهاز التكبير.
  3. 5 أيام بعد اكتشاف قطره الأولية، إضافة 10 ميليلتر من جديد RPMI/10% FCS المتوسطة لكل قطره. وفي وقت لاحق، تبادل 10 ميليلتر في المتوسط كل يوم. استخدام عبوة الإلكترونية مفيدة جداً في هذه الخطوة.
  4. اعتماداً على نوع الخلية، حصاد الماغنيسيوم (انظر المادة 10 للحصول على تفاصيل) بعد 10-15 يوما قبل الشطف بلطف لهم قبالة غطاء صحن ثقافة الخلية مع برنامج تلفزيوني. جمع لهم في طبق ثقافة جديدة غير لاصقة خلية.
    ملاحظة: فترة زراعة تعتمد على مرحلة نمو ورم خلايا سرطان الجلد عند أنها استمدت في البداية، مثلاً، الماغنيسيوم المستمدة من الخلايا 451-لو تنمو إلى حوالي 500 ميكرومتر في القطر في غضون 12 يوما لاستزراع في إسقاط معلقة15 .

7-جيل المقصورة الجلد من الجلد كامل أورجانوتيبيك يعيد

  1. إنشاء نماذج الجلد باستخدام خلية 24-بئر microporous غشاء إدراجات (المسام حجم 8 ميكرومتر) توضع في لوحات 24-جيدا.
    ملاحظة: تأكد من عدم استخدام معلقة ولكن الدائمة إدراج، نظراً لأنها سوف توضع في لوحة 6-جيدا لزراعة الهواء السائل في مرحلة لاحقة.
  2. إعداد الحل (GNL) تحييد جل15، فضلا عن وسائط الإعلام الثقافة المشار إليها ملم ونمو غشائي وسائط الإعلام (EGM)16،17. لمنع تخثر الدم، تخزين الكولاجين النوع الأول (عادة ما تكون من ذيل الفئران، 3.5-4 مغ/مل في حمض الخليك N 0.02) على الجليد حتى الاستخدام، لأنه يبدأ بهلام في الرايت
  3. إعادة تعليق 1 × 105 الليفية لإدراج في GNL ومزيج تعليق خلية بسرعة مع الكولاجين بنسبة 1:3 في وحدة تخزين نهائي من 500 ميليلتر/إدراج. إعمار المزيج بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً لتجنب تشكيل فقاعة فقاعات قد يؤثر على نوعية الجلد.
  4. السماح للهلام الجلد الفردية تسوية بإبقائها دون المتوسط في RT لمدة 30 دقيقة في غطاء عقيمة. بعد ذلك تغطي كل جل مع دميم المحتوية على الجلوكوز 4.5 غرام/لتر، 1% ل الجلوتامين، FCS 10%، ودون L-بيروفات، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

8-جيل حجرة البشرة من الجلد كامل أورجانوتيبيك يعيد

  1. في اليوم التالي إزالة المتوسطة من المواد الهلامية الجلدي وحجته لهم مع وسائل الإعلام الغير عادية (FCS 10 ٪، 1 ٪ بينستريب، الجنتاميسين 10 ملغ/مل) ح 2 في 37 درجة مئوية. سحب المتوسطة والبذور 1 × 105 الكيراتينيه حراكه في 100 ميليلتر EGM على رأس جل الجلد بعناية.
  2. احتضان يعيد بناء ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية للسماح للخلايا الكيراتينيه على التمسك بحجرة عن طريق الجلد.
    ملاحظة: خلال هذه الفترة الحضانة، سوف تبدأ المواد الهلامية ليتقلص بسبب الانكماش الناجم عن تنتجها الخلايا الليفية، وهكذا، جزئيا على الأقل فصل من الجدران إدراج.
  3. تغطية مكافئات الجلد مع حوالي 800 ميليلتر EGM وعناية إزالة الجل المتبقي من الجدار إدراج مع تلميحه صغيرة ماصة (أبيض). الثقافة الجلد مكافئات غارقة في اجتماع فريق الخبراء لمدة 7 أيام في حاضنة خلية على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، وتغيير في المتوسط كل يوم.
    ملاحظة: أثناء هذا الوقت مكافئات الجلد سوف تتقلص إلى حد كبير.

9. يعيد زراعة الهواء السائل من الجلد كامل أورجانوتيبيك

  1. في يوم 8، إدراج نقل كل بئر فردية من لوحة 6-جيدا. فقط إضافة 1.2-1.4 مل متوسطة مم لكل بئر، حيث أن إعادة البناء البشرة تم توفيره مع متوسطة من أسفل البئر ولكن لا يغطي مع المتوسطة.
    ملاحظة: زراعة في واجهة الهواء السائل يسمح التكوين الطبقي لجزء البشرة وإنشاء كامل طبقة كورنيفيد (الطبقة القرنية).
  2. خلال الأيام القادمة 10-17، تغيير في المتوسط كما ورد في القسم 9.1 كل يوم. وخلال هذه الفترة، إضافة المخدرات أو المنبهات الأخرى حسب الحاجة إلى المتوسط. بعناية إزالة إعادة البناء الجلد الكامل من إدراج غشاء microporous استخدام الملقط منحنى لمزيد من التحليل، مثلالتحليل المناعي (الشكل 1).

10-توليد نماذج سرطان الجلد أورجانوتيبيك الجلد كروي

  1. لدمج الماغنيسيوم الميلانوما في المقصورة عن طريق الجلد ليعيد بناء البشرة الكامل أورجانوتيبيك، بعناية شطف الماغنيسيوم (بعد الخطوة 6، 4) قبالة غطاء الشنق إسقاط خلية الثقافة الطبق مع برنامج تلفزيوني. جمع 10-20 الماغنيسيوم/إدراج في صحن ثقافة معقمة غير لاصقة خلية. بعناية إزالة برنامج تلفزيوني المفرطة مع ماصة باستور.
  2. نضح الماغنيسيوم في أصغر حجم ممكن لاجتماع فريق الخبراء. عند هذه النقطة مراعاة والعد الماغنيسيوم بالعين المجردة، دون أي مزيد من التكبير الجهاز. أن الماغنيسيوم 10-20 كل الجلد النموذجي/هلام، كما ورد في خطوة 10.1.
  3. نقلها إلى وحدة التخزين المطلوبة من GNL التي تحتوي على الخلايا الليفية (خلال الخطوة 7، 3)، وخلط مع نوع الكولاجين أنا. من هذه الخطوة على المضي قدما كما هو موضح في المقاطع 7.3-9.1.
    ملاحظة: الماغنيسيوم الورم تصبح مرئية في جل الجلدية كالبقع البيضاء (الشكل 2)

Representative Results

نجاح العلاج من سرطان الجلد ورم خبيث يمكن أن يتأثر عبر الحديث بين الخلايا السرطانية، وكذلك بين الورم والخلايا المضيفة عدم تحويلها. والغرض من وضع نماذج أورجانوتيبيك للسرطان في المختبر هو توفير نظم مناسبة الاختبار السريري أن الخص منظمة ثلاثية الأبعاد والتعقيد من سرطان الجلد البشري المجراة في. يسمح هذا دراسة الأثر العلاجي على الورم داخل بيئة أورجانوتيبيك والآثار السلبية على الأنسجة الأساسية المحيطة بالتوازي.

وضع نماذج أورجانوتيبيك أفضل على الجلد، نوعية الخلايا الأولية بالغة الأهمية. أنها مفيدة لاستخدام الأحداث الرئيسية الليفية والخلايا الكيراتينيه، لأنهم عادة أقل تختلف بالمقارنة مع خلايا الجلد الأولية الكبار. الأحداث الجلد خلايا يمكن أما أن تكون معزولة من القلفة الأحداث كما هو موضح في المقاطع البروتوكول 1-5، لكن يمكن أيضا شراؤها من الشركات كالخلايا الليفية الأولية قبل الولادة والخلايا الكيراتينيه. في حالة شراء، من الضروري أن خلايا النظام من الجهات المانحة المختلفة لتجنب النتائج الخاصة بالجهات المانحة، مثلاً، لحساسية المخدرات. يتم عرض على البروتوكول كله كنظام في الشكل 3.

ويتطلب مراقبة الجودة 3D كامل الجلد معادلات التحليل المناعي. ويمكن الحصول على انطباع أولى الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ من البارافين تضمين المقاطع (3 ميكرومتر). تحليل مفصل لنوعية البشرة التمايز وتشكيل الصفيحة القاعدية بين الأدمة والبشرة يتطلب التحليل المناعي باستخدام أجسام مضادة محددة ضد علامة التكوين الطبقي البشرة. يسمح هذا التمييز بين خلايا غير متمايزة، التكاثري عالية تقع بالقرب من الغشاء القاعدي وعالية متباينة والكيراتينيه خلايا في الطبقة القرنية من خلال تشكيل طبقات البشرة المتميزة بين . كما هو موضح تلطيخ المناعي النسيجي (الشكل 4)، يمكن تحقيق تمايز الخلايا الكيراتينيه في جميع أنحاء البشرة مماثلة للجلد الطبيعي: أساسا الخلايا غير متمايزة من طبقات البشرة السفلي (الطبقة باسل و أنواع الطبقات) وصمة عار إيجابية بالنسبة الكراتين 14، بينما الخلايا أكثر تمايزاً من الطبقات القاعدية أعلاه (الطبقة الحبيبية و الطبقة القرنية) وصمة عار إيجابية بالنسبة الكراتين 10 وإينفولوكرين. وبناء على ذلك، تلطيخ filaggrin يمكن فقط ملاحظة في متباينة جداً من خلايا الطبقة القرنية. الأهم من ذلك، وتلطيخ laminin 5 يكشف أن قد تم إنشاؤها الصفيحة القاعدية لفسيولوجيا الاتصال البشرة مقصورة الجلد لإعادة البناء الجلد الاصطناعي. وهذا يثبت أن تم إنشاؤها المكروية أورجانوتيبيك اتصال المضيف خلايا سرطان الجلد أو الماغنيسيوم للتحليل الفسيولوجي وباثوفيسيولوجيك.

غرض فحص المخدرات سرطان الجلد، خلايا سرطان الجلد واحد يمكن أيضا إدماج الأدمة الجلد كامل معادلات للسماح حيثياته الميلانوما عش تشكيل18،19. ولذلك، جنبا إلى جنب مع الخلايا الليفية الأولية بنسبة 5:1، تثفيل معا في 200 غ س لمدة 5 دقائق وحراكه في GNL قبل الاختلاط مع الكولاجين خلايا سرطان الجلد. كنتيجة لذلك، ستشكل الاعشاش خلية سرطان الجلد تلقائياً في المقصورة عن طريق الجلد. ووفقا لخبرتنا، المرحلة فقط خلايا النمو المنتشر أعشاش النموذج المناسب، مقارنة بخلايا سرطان الجلد RGP أو VGP15. العيب الرئيسي لهذه الأنواع من النماذج هي حقيقة أن عدد وحجم أعشاش الميلانوما شكلت لا يمكن التنبؤ بها، وقد تختلف بين الجلد الفردية يعيد، مستقلة عن أي علاج. على سبيل المثال، قد كسب 1,000 الخلايا المصنفة في المقصورة الجلد 10 أعشاش تتألف من خلايا 100 أو 100 أعشاش المكونة من 10 خلايا كل (الشكل 5). هذه المتغيرات البيولوجية الحالية مع أوجه القصور ثلاثة: أولاً، عدد وحجم أعشاش الميلانوما شكلت لا يمكن التنبؤ بها؛ وثانيا، الانبثاث في فيفو تكون عادة أكبر من الاعشاش الميلانوما ويحمل تنوع داخل الأورام أكثر تعقيداً؛ وثالثاً، سبب محدودة-عمر نماذج عش الورم، العلاج يتم البدء في وقت مبكر، وبالتالي بدلاً من ذلك يحول دون نمو الورم بدلاً من التسبب في الانحدار القائمة الورم أعشاش.

للتغلب على هذه القيود أورجانوتيبيك الميلانوما كروي الجلد نماذج يمكن أن تتولد. بإسقاط الخلايا في شنقاً لمدة 14 يوما20تثقيف الميلانوما المنتشر 250، تتولد الماغنيسيوم تكاثر تتألف من سرطان الجلد قابلة للحياة فاسكولاريزيد خلايا عرض هيكل اتفاق نهائي قطرها حوالي 500 ميكرومتر محاكاة ورم العقد، ورم خبيث الجزئي، أو بين الشعرية الصغرى المناطق الأورام الصلبة،من21إلى22. وبصفة عامة، أي خط خلية سرطان الجلد مناسبة لتوليد الماغنيسيوم عبر الشنق إسقاط الأسلوب؛ ومع ذلك، الخلايا المستمدة من أكثر تقدما شكل مراحل الورم المنتشر الماغنيسيوم أكثر صلابة مقارنة بخطوط الخلايا المستمدة من أوائل مراحل التقدم، مثلاً، RGP.

لبعض الخلايا، فمن المفيد لتشكيل كروي السليم لتعزيز لزوجة الشنق إسقاط الثقافة المتوسطة. يمكن تحقيق ذلك بإضافة 10-50% الميثيل-السليلوز إلى متوسط الثقافة. الميثيل السليلوز الأسهم الحل، اﻷوتوكﻻف ز 1.2 الميثيل السليلوز جنبا إلى جنب مع شريط إثارة مغناطيسية في زجاجة زجاج 100 مل. إضافة 100 مل المتوسطة مسخن (60 درجة مئوية) وآثاره 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وآخر 1-2 ح في 4 درجات مئوية. الطرد المركزي حل الأسهم ح 2 في 5,000 س ز وتخزين المادة اللزجة طافية في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

التحقق من صحة السليم نماذج كروي الميلانوما الجلد الكامل شرط بحقيقة أن عدد محدد من سرطان الجلد الماغنيسيوم يمكن-على الأقل إحصائيا-تدمج تنتجها الخلايا الليفية الجلد/الكولاجين أنا سقالة في اليوم الأول لبناء نموذج الجلد، مما يتيح لهم لتطوير التعاون خلال تمايز البشرة لأيام 25-27. يمكن تحليل عائد الماغنيسيوم مباشرة بعد البذر، نظراً لظهور الماغنيسيوم جل البقع البيضاء داخل شفافية عن طريق الجلد ويمكن أن ينظر إليها دون أي جهاز التكبير (الشكل 2). كنتيجة لذلك، يتم إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد جلد أن المرافئ الميلانوما ناضجة الماغنيسيوم، الذي كان مثقف في المختبر لما مجموعة 42 يوما تقريبا، عرض أعلى مستوى من الأورام داخل الخلية التمايز15.

ح & ه تلطيخ نموذج كروي الميلانوما الجلد يكشف عن المظهر النسيجي والتوزيع الخلوية لسرطان الجلد الماغنيسيوم تكون مشابهة جداً لواحد من سرطان الجلد البشري غير vascularized الجلد الانبثاث في فيفو15 (رقم 6 ). الفئات السكانية الفرعية اثنين من خلايا سرطان الجلد يمكن تمييزها الواضح في ظل هذه الظروف: يتدنى المتكاثرة طرفية ويتدنى مركزية تتكون أساسا من تقلصت، أبوبتوتيك أو نخرية الخلايا، وتشكيل ما يسمى "نخرية" مركز. إيمونوهيستوتشيميكالي تعيش وتنتشر الفئات السكانية الفرعية يمكن الكشف عن استخدام الأجسام المضادة ضد انتشار العلامة كي-67، بينما يمكن تصور خلايا مركز نخرية TUNEL تلطيخ15. هناك ما يبرر هذا التوزيع خاصة للفئات السكانية الفرعية خلية ورم بحجم كروي (إيه فايف زيرو زيرو ميكرومتر)، الناتجة عن نقص العناصر الغذائية والأكسجين في الجزء المركزي حيث تتراكم النفايات تقويضي. يتبع البروتوكول شريطة هنا سوف تسمح لتوليد أورجانوتيبيك موثوقة واستنساخه تضمين نموذج الإنسان الكامل-سمك الجلد مع الماغنيسيوم الميلانوما البشرية التي تحاكي الإنسان الميلانوما الجلد ورم خبيث. فحص السموم، تطبيقات لهذا النموذج تشمل اختبار المخدرات، تؤثر مركبات التجميل أو العلاج على ثمرة سرطان الجلد، والعلاج بالليزر.

Figure 1
الشكل 1 : زراعة أورجانوتيبيك 3D الجلد يعيد بناء المغمورة بالمتوسطة وفي واجهة الهواء السائل- في يوم 0 الكيراتينيه الأولية هي المصنفة على رأس المقصورة الجلد تتكون من الخلايا الليفية الأولية جزءا لا يتجزأ في نوع الكولاجين أنا المصفوفة. يعيد بناء البشرة 3D البقاء المزروعة المغمورة مع اجتماع فريق الخبراء لمدة 7 أيام، فصل من الجدار إدراج، وتبدأ في التقلص. في يوم 8 إدراج نقل إلى 6-الآبار والمزروعة في واجهة الهواء السائل للسماح للطبقات البشرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تظهر الميلانوما الماغنيسيوم جزءا لا يتجزأ في المقصورة الجلدية كالبقع البيضاء- وفي حين يمكن إضافة إعداد المقصورة الجلد من الجلد 3D إعادة البناء، عدد محدد من الماغنيسيوم سرطان الجلد إلى نوع الكولاجين تنتجها الخلايا الليفية أنا مزيج. بمجرد انقشاع الجل عن طريق الجلد، تصبح مرئية كالبقع البيضاء الماغنيسيوم سرطان الجلد.

Figure 3
الشكل 3 : مخطط لبناء نموذج الجلد أورجانوتيبيك 3D- إزالة الأنسجة الدهنية من العينة الجلد وقطع إلى أجزاء أصغر. الحضانة مع الحل ديسباسي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية يسهل انفصال البشرة عن الأدمة. الليفية الأولية المعزولة والكيراتينيه ينبغي زراعتها بشكل منفصل واستخدامها بين سن 4-6 و 3-4، على التوالي. بعد ذلك، يمكن المضي في توليد نموذج ثلاثي الأبعاد من الجلد كما هو موضح في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : إظهار أورجانوتيبيك 3D الجلد يعيد بناء على مستوى تمايز مشابهة لجلد الإنسان العادي. البارافين المقاطع من مكافئات الجلد (A) جلد الإنسان مقارنة بالعادي (ب) كانت الملون للتعبير عن كراتين 14 (أحمر: λتحويله 554 نانومتر؛ λم 568 nm) و involucrin 10، (الأخضر: λت 490 نانومتر؛ λم 525 نانومتر )، filaggrin (الأخضر: λت 490 نانومتر؛ λم 525 نانومتر)، و laminin 5 (الأخضر: λت 490 نانومتر؛ λم 525 نانومتر)، وتحليلها مع مجهر الأسفار [كنفوكل]. كانت تصور نواة الخلية تلطيخ DAPI (الأزرق: λت 340 نانومتر؛ λم 488 نانومتر). الفحص المناعي للكامل 3D-سمك الجلد مكافئات كشفت السليم البشرة الطبقية تشكيل طبقات متميزة للبشرة كما رأينا في جلد الإنسان العادي. بينما الملون الخلايا من طبقات البشرة أقل إيجابية بالنسبة الكراتين 14، ميزت الأكثر خلايا من الطبقة القاعدية أعلاه تبين الكيراتين 10 وتلطيخ إينفولوكرين. وأعرب خلايا متباينة جداً قريبة من الطبقة القرنية filaggrin. تلوين Laminin 5 يظهر أن يتم إنشاؤها الصفيحة القاعدية لفسيولوجيا الاتصال البشرة مقصورة جلدي (لوحة أدنى). وقد أخذت هذا الرقم من فورسمان et al. 15 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : لا يمكن التنبؤ بعدد وحجم أعشاش الميلانوما شكلت عفويا. تشكيل عش الميلانوما حيثياته في المقصورة الجلد من الجلد كامل مكافئات يمكن أن يتحقق عن طريق خلط عدد محدد من سرطان الجلد الخلايا مع الخلايا الليفية الأولية لتضمين كل أنواع الخلايا في نوع الكولاجين أنا المصفوفة. يمكن فقط تحليل عدد وحجم أعشاش الميلانوما المشكلة تلقائياً من إعادة البناء جلد 3D ناضجة بعد حوالي 21 يوما. كما هو مبين من عينتين (أ) و (ب)، قد تختلف الأرقام والأحجام أعشاش الميلانوما بين يعيد بناء البشرة الفردية. نتيجة لذلك، من الصعب التحقق من صحة هذه النماذج والتنبؤ بالأثر العلاجي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : الماغنيسيوم الميلانوما دمج الجلد مكافئات إيجاز الملامح الرئيسية لورم خبيث الميلانوما الجلدية البشرية. ح & ه الملون مقاطع البارافين من الماغنيسيوم الورم مضمن إلى معادلاتها الجلد كشفت الماغنيسيوم لتقاسم الميزات الرئيسية مع الميلانوما الجلدية البشرية غير vascularized الانبثاث في فيفو. الفئات السكانية الفرعية اثنين من الخلايا بوضوح ملحوظ: يتدنى المعيشة المحيطية والمركزية يتدنى تتكون أساسا من تقلصت، أبوبتوتيك أو نخرية الخلايا، وتشكيل مركز "نخرية". هذا التوزيع للفئات السكانية الفرعية خلية الورم مكفولة بحجم كروي. وقد تم تعديل هذا الرقم من فورسمان et al. 15 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

كروي سرطان الجلد أورجانوتيبيك الجلد نموذج عرض هنا أوامر رؤى جديدة لفهم أعمق لمداواة البينية والتفاعل المضيف الورم، وقد توفر منصة فحص متقدمة لدراسة الآليات الجزيئية للتنمية الورم و مقاومة العلاج في المستقبل.

لضمان الأفضل الفسيولوجي و في فيفو محاكاة ظروف الجلد يعيد، ونوعية الخلايا الأولية ذات أهمية قصوى. كما ذكر أعلاه، خلايا الجلد الأحداث أو قبل الولادة تظهر على أدنى درجة التمايز وهي بالتالي أفضل مناسبة لتوليد شبه كامل-سمك الجلد. مراقبة الجودة الممكنة الأولى هو مدى انكماش الجلد في اليوم الثاني بعد زرع الخلايا الكيراتينيه واكويليبراتينج الهلام ل EGM (أقسام 8.2 و 8.3 من البروتوكول). سوف يتقلص الهلام الجلد الأكثر مع أفضل نوعية من الخلايا الليفية. أيضا، قد تنال من دمج الخلايا الليفية كثيرة جداً أو قليلة جداً انكماش الجلد ومن ثم تمسك البشرة بحجرة عن طريق الجلد. وهذا بدوره سوف خرق تمايز البشرة، نظراً لأن هذه العملية تتطلب محادثة عبر واسعة النطاق بين خلايا الجلد والبشرة.

وتتوقف نوعية الخلايا الأولية أيضا حاسمة على كونفلوينسي الخلية، فضلا عن مرور الخلايا. إذا كانت الخلايا الكيراتينيه وتزرع على إيه إيت زيرو % كونفلوينسي فورا وقف تكاثر والبدء في التفريق. ولذلك من المهم للثقافة منها إلى 40-70% كونفلوينسي خلال باساجينج واستخدامها لا يتجاوز سن 3-4. الليفية أقل حساسية ولكن لا ينبغي أن تستخدم بعد مرور 4-6. يرجى أيضا ملاحظة أن جميع الخلايا الأولية وخطوط الخلايا المستخدمة لإنشاء نماذج الجلد كروي الميلانوما أورجانوتيبيك تستزرع خالية من المضادات الحيوية، وذلك خطر تلوث عالية. بيد أن إضافة المضادات الحيوية يتغير فسيولوجيا الخلايا الفردية وذلك يقلل من جودة مكافئات الجلد.

وبصفة عامة، ورم كروي تشكيل الممكن من تقريبا جميع أنواع خطوط الخلايا السرطانية وأيضا الخلايا السرطانية معزولة طازجة من المواد المريض. قد تختلف الوقت عدد و/أو زراعة الخلية الأولى للحصول على أحجام كروي الأمثل اعتماداً على نوع الخلية المستخدمة. تصل إلى حجم من 150-200 ميكرون، كافة الخلايا المدرجة في كروي يمكن لا يزال بما فيه الكفاية توفيره مع المواد الغذائية عن طريق نشر بسيطة. إظهار درجة عالية من التمايز الخلوي فقط الماغنيسيوم مع أحجام إيه فايف زيرو زيرو ميكرومتر وتمثل الميزات النموذجية ل أنسجة الورم غير فاسكولاريزيد22.

أورجانوتيبيك سرطان الجلد-كروي-الجلد-الطراز وضعت هنا مناسبة خاصة لدراسة التفاعلات المضيف الورم واختبار إطار في فيفوالمخدرات سرطان الجلد-مثل الظروف15. لا يزال، البيئة من سرطان الجلد في فيفو حتى أكثر تعقيداً، وإيواء مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا السرطانية المرتبطة، بما في ذلك الخلايا المناعية، وخلايا بطانية. منذ إضافة الخلايا المناعية الأولية المناسبة تواجه مشاكل مع هيستوكومباتيبيليتي، هذه النماذج غير قادرة على رصد النهج المناعة العلاجية على نحو كاف.

على الرغم من ذلك، الماغنيسيوم سرطان الجلد يمكن أن تتولد من المواد الطازجة معزولة المريض ومجرد إدراج إعادة البناء الجلد الكامل، قد يخدم كالمخدرات فرادى فحص منصات. حتى إدماج قطعة من ورم خبيث سرطان الجلد في الجلد يعيد بناء المتصور لاختبار تركيبات العقاقير في نهج علاجية مصممة خصيصا. بما في ذلك نموذج الميلانوما الجلد 3D أورجانوتيبيك في التجارب السريرية من المرجح أن تساعد على ضمان إلا رواية العلاجية الواعدة المفاهيم أخذ قدما في التجارب السريرية، مما يقلل من معدل الاستنزاف لعلاجات جديدة محتملة لهذا المرض وزيادة معدل نجاح العلاج في التجارب السريرية.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون فورسمان حنا لإنشاء أورجانوتيبيك 3D الميلانوما-كروي-الجلد-النموذج وتوفير بروتوكولات ممتازة. كما يشكر المؤلفون بوسكه سيلك لقيمة الدعم التقني. وأيده العمل ه الألمانية: برنامج Med 031A423A "سرطان الجلد حساسية".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal serum albumin (FCS) Thermo Fisher Scientific 10270106 add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 1X dilute in PBS
RPMI Thermo Fisher Scientific 61870010 for cultivation of melanoma cell lines
DMEM  Thermo Fisher Scientific 41965062 for cultivation of primary fibroblasts
Dispase Gibco life technologies  17105041 2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I BD Biosciences 354249 usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon  Nunc 140629 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer BD Falcon 352360 yellow
Gentamycine Thermo Fisher Scientific 15750060 dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium Cell Systems do not add FCS or antibiotics
Collagenase SERVA 17454 NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes Cell Systems FC-0007 alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts Cell Systems FC-0001 alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM
[+] 4,5 g/l Glucose,
[+] L- Glutamine,
[-] L- Pyruvate		 Gibco life technologies 41965 mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine Gibco life technologies  21765-029 add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF  Gibco life technologies  13247-051 add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride Merck Chemicals 2381 add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid Alfa Aesar 18851 add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin Lilly HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine Sigma-Aldrich  E-0135 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine Sigma-Aldrich P-0503 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine Sigma-Aldrich  T-0665 add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine Sigma-Aldrich T-6397 add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-088816 add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone Sigma-Aldrich P-8783 add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes Sigma-Aldrich H-3784 add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine Sigma-Aldrich S-4311 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride Sigma-Aldrich  C-7017 add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS Sigma-Aldrich F-0392 Lot 086K0361 add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine Sigma-Aldrich  A-9795 add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine PromoCell C-42209 add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride Sigma-Aldrich 255521 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody Dako M7002 1:50
anti cytokeratin 14 antibody Santa Cruz sc-53253 1:200
 anti laminin 5 antibody Santa Cruz sc-32794 1:50
anti filaggrin antibody Thermo Fisher Scientific MA5-13440 1:50
anti involucrin antibody Acris Antibodies AM33368PU 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled LifeSpan Biosciences LS-C153907 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled Jackson Immuno Research 115-165-003 1:1000
DAPI Sigma-Aldrich 10236276001 1:100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boulais, N., Misery, L. The epidermis: a sensory tissue. Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).
  2. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).
  3. Shain, A. H., Bastian, B. C. From melanocytes to melanomas. Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).
  4. Clark, W. H. Jr Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer. Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).
  5. Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host. Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).
  6. Miller, A. J., Mihm, M. C. Jr Melanoma. N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).
  7. Balch, C. M., et al. Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification. J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).
  8. Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials. Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).
  9. Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma. Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).
  10. Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
  11. Flaherty, K. T., et al. Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).
  12. Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. Systemic therapy of metastatic melanoma. J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).
  13. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
  14. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  15. Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing. Cell Death. Dis. 4, e719 (2013).
  16. Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation. J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).
  17. Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).
  18. Sinnberg, T., et al. Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide. J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).
  19. Niessner, H., et al. The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells. J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).
  20. Foty, R. A. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  21. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  22. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).

Tags

أبحاث السرطان، 135 قضية، سرطان الجلد، الماغنيسيوم، أورجانوتيبيك، ونموذج كامل الجلد، الميلانوما 3D الفرز، وفحص النظام
نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, I., Kulms, D. A 3D… More

Müller, I., Kulms, D. A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model. J. Vis. Exp. (135), e57500, doi:10.3791/57500 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter