Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een sferoïde huidmodel voor 3D organotypic melanoom die zowel de architectuur recapituleert en meercellige complexiteit van een orgel/tumor in vivo maar tegelijkertijd herbergt systematische experimentele interventie.

Abstract

Kwaadaardige omzetting van melanocyten, de pigment cellen van menselijke huid, veroorzaakt de vorming van melanoom, een zeer agressieve kanker met toegenomen gemetastaseerde potentieel. Onlangs, mono-chemokuren blijven verbeteren door melanoom specifieke combinatie therapieën met gerichte kinase-remmers. Toch blijft gemetastaseerd melanoom een levensbedreigende ziekte omdat tumoren primaire weerstand vertonen of resistentie tegen nieuwe therapieën ontwikkelen, waardoor het herwinnen van tumorigene capaciteit. Ter verbetering van het therapeutische succes van maligne melanoom, is de bepaling van de moleculaire mechanismen die overdracht van resistentie tegen conventionele behandeling benaderingen noodzakelijk; Nochtans, vereist het innovatieve cellulaire in vitro modellen. Hier introduceren we een in vitro driedimensionale (3D) organotypic melanoom sferoïde model dat de architectuur in vivo van maligne melanoom kan portretteren en nieuwe inzichten in kan rechtvaardigen intra-tumoral evenals tumor-gastheer interacties. Het model bevat gedefinieerde aantallen volwassen en gedifferentieerde melanoom spheroïden in een 3D menselijke volledige huid wederopbouw model bestaande uit primaire huidcellen. De cellulaire samenstelling en differentiatie van de status van de ingesloten melanoom spheroïden is vergelijkbaar met die van cutaan melanoom metastase in vivo. Combinatie therapieën, met behulp van dit organotypic melanoom sferoïde model als een drug screening platform kan steun verlenen voor de identificatie van responders aan geselecteerd terwijl de geen onnodige behandeling lasten voor non-responders, waardoor het voordeel van sparen therapeutische interventies.

Introduction

De menselijke huid is samengesteld uit twee verschillende compartimenten die verschillende functies in het lichaam te beschermen tegen de nadelige milieueffecten¹vervullen. De lagere dermale compartiment bestaat uit een fibro-elastisch bindweefsel. Het is samengesteld uit losjes verbonden collageen en elastine vezels gesynthetiseerd door fibroblasten, een mechanische barrière-functie. De dermis wordt gescheiden van de bovenste epidermis door de basale lamina die wordt geproduceerd als een extracellulaire matrix als gevolg van een constante communicatie tussen beide compartimenten van de huid. In tegenstelling tot de dermis, de epidermis is een squamous epitheel, die voornamelijk uit keratinocyten bestaat en kan worden onderscheiden in vier lagen. De stratum basale bestaat uit ongedifferentieerde basale keratinocyten die voortdurend ontlenen huid voorlopercellen stratificatie door de stadia van de stratum spinosum en stratum granulosum in de hoornlaag van de aan het lichaam beschermen tegen uitdroging en infecties². Melanocyten wordt uitgelijnd op de basale membraan, en communiceren via dendritische extensies met meerdere keratinocyten. Ze produceren de pigment melanine ter bescherming van het huidweefsel tegen de schadelijke gevolgen van UV-straling, zoals huidveroudering, immunosuppressiva, ontsteking en inductie van niet-melanoom huidkanker. UV straling bijdrage tot de transformatie van melanocyten tot maligne melanoom, is echter nog steeds onder debat³.

Ontwikkeling van melanoom is onderscheid gemaakt tussen verschillende tumor progressie stadia en gekenmerkt door bepaalde histologische, genetische en morfologische veranderingen⁴. Zij afkomstig zijn van beide DOVO of van een aangeboren of verworven naevus als gevolg van een plaatselijke toename van melanocyt proliferatie veroorzaken goedaardige neoplasie. Deze voorloper laesie kan omzetten in structureel gemodificeerde dysplastische weefsel bevattende atypic cellen, die de eerste kwaadaardige fase, de radiale groeifase (RGP) mogen blijven. Deze vroege tumor progressie fase wordt gekenmerkt door cellen radiaal prolifererende binnen de epidermis, tonen enkele lokaal invasief cellen binnen de papillaire dermis. Tijdens de daaropvolgende verticale groei fase (VGP) melanoom tonen cellen al een metastatische en invasieve fenotype door het doorbreken van de basale lamina te infiltreren in de diepere delen van de dermis evenals het subcutane weefsel⁵. Tot slot vertegenwoordigt de gemetastaseerd melanoom (MM) de meest agressieve progressie fase met uitgezaaide cellen systemisch verspreiden in het bloed en lymfe systeem te vallen distally organen zoals lever, longen en hersenen⁶.

Tot op heden, steeds vroege diagnose, gevolgd door chirurgie nog de meest effectieve behandeling van maligne melanoom. De prognose voor patiënten met verre metastase, blijft echter bijzonder slecht⁷, omdat klassieke chemotherapie regimes slechts weinig overleving voordeel^{8,9 verlenen}. Echter na tientallen jaren van stagnatie, hebben recente vooruitgang in gerichte therapieën aanzienlijk verbeterd de prognose van maligne melanoom.

Disregulatie van twee grote mitogeen geactiveerd trajecten, de RAS-RAF-MEK-ERK en de signaalroutes PI3K-AKT-PTEN, presenteren belangrijke bestuurders van melanoom progressie, vooral bij het constitutively activeren van puntmutaties van de proto-oncogenes BRAFV600 en NRI's zijn huidige¹⁰. Dienovereenkomstig, de uitvinding van gerichte kinase remmers beloofde therapeutisch nut hebben voor patiënten met gemetastaseerd melanoom. Een veelheid van klinische proeven uitgevoerd op dit punt geboekt niet significante voordelen voor patiënten met gemetastaseerd melanoom. Bijna alle antwoorden zijn gedeeltelijke, met een subpopulatie van patiënten met primaire weerstand. Bovendien, de verwerving van secundaire weerstand leiden tot terugvalpreventie werd waargenomen in de meerderheid van de patiënten^11,12.

Wordt duidelijk dat de analyse van de mutatie status alleen is niet voldoende om de meest potente therapeutische strategie te ontwikkelen. Nieuwe snelle en betrouwbare diagnostische hulpprogramma's zijn nodig om systematisch registreren en analyseren van het reactievermogen van individuele kankercellen. De overgrote meerderheid van de momenteel beschikbare gegevens over menselijke melanoom hebben verkregen van tweedimensionale (2D) melanoom celculturen. Tumorcellen, echter gekweekt in 3D kunnen intercellulaire Overspraak tussen gedifferentieerde kanker cel subpopulaties zo goed tussen kankercellen en het niet-getransformeerd omringende gastheer weefsel. Daarom zou het beste voor de wederopbouw van de 3D-omgeving waarin het melanoom ontwikkeld, om te worden gebruikt als een preklinische screening model^13,14.

Protocol

Alle menselijk weefsel werk werd uitgevoerd met behulp van goedgekeurde institutionele protocollen.

1. scheiding van Dermis en Epidermis van menselijke huid (juveniele voorhuid van besnijdenis)

1. Plaats van de voorhuid (meestal 1-2 cm²) in een niet-klevende steriele cel cultuur schotel (Ø 10 cm) en bedek het met 10-12 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing⁺ (0,5 mM MgCl₂, 0,9 mM CaCl₂, PBS, pH 7,2 PBS⁺=). Verwijder alle overtollige (obesitas) weefsel met steriel scalpel en pincet.
2. De huid in 3 x 5 mm stukken snijden, wassen met PBS en overbrengen naar een niet-klevende steriele cel cultuur schotel (Ø 6 cm). Dekking van de stukjes weefsel met 5-7 mL dispase oplossing (2 U/mL in PBS). Zegel van de cel cultuur schotel met paraffine film en incubeer gedurende 16 uur bij 4 ° C.
3. De epidermale uit de dermale deel met twee steriel pincet intrekken. De ontleed weefsel stukken overbrengen in afzonderlijke niet-klevende cel cultuur gerechten (Ø 6 cm) en bedek elk van hen met PBS⁺.

2. isolatie van primaire keratinocyten van de Epidermis

1. Verwijder de PBS⁺ van de cel cultuur schotel met behulp van een precisiepipet Pasteur voorzichtig en wassen van de epidermale weefsel stukken (sectie 1.3) met PBS. Snijd de epidermis in kleinere stukken (1 mm²) en verzamelen ze in een conische buis van 50 mL. Voeg vervolgens 10 mL 1 x trypsine-EDTA (voorverwarmd tot 37 ° C) en incubeer gedurende 5 minuten in een waterbad bij 37 ° C. Vortex de weefsel schorsing elke 2 min.
2. Stop de enzymatische reactie door toevoeging van 1 mL foetaal kalfsserum (FCS). Resuspendeer de cellen door pipetteren op en neer met een pipet 10 mL kunststof gedurende 4 minuten proberen te voorkomen van zeepbellen en schuim vorming.
3. Pipetteer de celsuspensie in een cel zeef (porie grootte 100 µm), geplaatst op de top van een verse 50 mL conische buis, en spoel 3 x met 5 mL PBS. Centrifugeer de cellen bij 200 x g voor 5 min. resuspendeer de pellet cel in 2-6 mL kweekmedium dat 1% (v/v) gentamycine. Bepalen het celaantal handmatig door tellen cellen in een hemocytometer en zaad 6 x 10⁵ cellen in een T75 maatkolf voor de cultuur van de cel.

3. teelt van primaire keratinocyten

1. Incubeer primaire keratinocyten geïsoleerd in stap 2.3 in een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO₂ in Keratinocyt medium zonder FCS, aan 50-70% confluentie.
2. Aan de passage van de keratinocyten zorgvuldig verwijderen van het medium, voeg 5 mL PBS-EDTA en Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Controleer als cellen zijn begonnen met het losmaken van de kolf van de cultuur onder een lichte Microscoop (4 X vergroting: cellen worden weergegeven afgeronde maar nog steeds zijn aangesloten!). Als dit niet het geval is, oude PBS-EDTA vervangen door verse PBS-EDTA en opnieuw Incubeer gedurende een ander 10 minuten bij 37 ° C.
3. Voeg 5 mL 1 x trypsine-EDTA aan de afgeronde cellen nog steeds bedekt met 10 mL PBS-EDTA en hen opnieuw Incubeer gedurende 1-3 minuten bij 37 ° C. Stop de enzymatische reactie door toevoeging van 1 mL FCS en verzamelen de vrijstaande cellen in een conische buis van 50 mL. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 min, resuspendeer de pellet in Keratinocyt medium, en zaad 6 x 10⁵ cellen in een maatkolf van de verse T75 cel cultuur.
   Opmerking: Voor het genereren van organotypic huid reconstrueert, de primaire keratinocyten dient uiterlijk passage 3-4.

4. isolatie van primaire fibroblasten van de Dermis

1. Snijd de dermale weefsel (sectie 1.3) in kleinere stukken (1 mm²) en ze vervolgens overbrengen naar een conische buis van 50 mL. Voeg 10 mL collagenase-oplossing (5 U/mL in PBS⁺) en incubeer gedurende 45 min. in een waterbad bij 37 ° C. Centrifugeer het mengsel van stukken van de weefsels en cellen bij 200 x g gedurende 5 min.
2. Wassen van de cel pellet tweemaal met 10 mL DMEM met 4,5 g/L glucose en L-Glutamine, maar zonder L-pyruvaat. Ten slotte resuspendeer de stukjes weefsel in 2 mL zuiver DMEM met 1% (v/v) gentamycine en 10% FCS. Overbrengen in een maatkolf van T25 cel cultuur en hen in een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO₂ na een nacht bebroeden.
   Opmerking: Het kleine volume kunt de fibroblasten om te migreren uit het weefsel-puin en dwingt hen te hechten aan de cultuur-kolf.
3. De volgende ochtend, voeg een ander 6 mL DMEM/gentamycine/FCS en incubeer gedurende 2-3 dagen bij 37 ° C, totdat de cellen confluentie van 80-90% hebben bereikt.

5. teelt van primaire fibroblasten

1. Passage van de fibroblasten, verwijder het medium en wassen Adherente cellen met PBS. Voeg 5 mL 1 x trypsine-EDTA en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C.
2. Stop de enzymatische reactie door toevoeging van 5 mL DMEM/FCS en verzamelen de vrijstaande cellen in een conische buis van 50 mL. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 min, resuspendeer de pellet in DMEM medium en zaad van 6 x 10⁵ cellen in een maatkolf van de verse T75 cel cultuur.
   Opmerking: Voor het genereren van organotypic huid reconstrueert, de primaire fibroblasten dient uiterlijk passage van 4-6.

6. generatie van 3D melanoom spheroïden Via de hangende Drop, methode

1. Cultuur melanoom cellen (bijvoorbeeld, 451-LU of een melanoom cellijn van belang) volgens algemene protocollen, met behulp van RPMI met 10% FCS¹⁵.
   1. Voor het genereren van melanoom spheroïden van vergelijkbare grootte en kwaliteit, wassen van melanoom cellen in PBS, voeg 5 mL 1 x trypsine-EDTA in PBS op de cellen in een T175 cel cultuur kolf en incubeer gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur (RT). De trypsine neutraliseren door toevoeging van 5 mL RPMI/10% FCS. Oogst die de cellen door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 min. resuspendeer de pellet cel in RPMI/FCS op een eindconcentratie van 10.000 cellen/mL zoals bepaald door te tellen in een hemocytometer.
2. Ter plaatse 40 x 25 µL (= 250 cellen) van de celsuspensie op de binnenzijde van de deksel van een steriele niet-klevende cel cultuur schotel (Ø 10 cm) met behulp van een elektronische multi precisiepipet. Met een snelle, maar vloeiende beweging, het deksel omdraaien en plaats deze op de respectieve cel cultuur schotel met 5 mL PBS.
   1. Cultuur "opknoping drop gerechten" in een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO₂ voor 10-14 dagen, afhankelijk van het celtype gebruikt.
      Opmerking: Cellen uit de groeifase MM doorgaans sneller groeien en meer solide spheroïden vormen in de hangende daling ten opzichte van melanoom cellen afgeleid van het RGP of VGP. Voor individuele beoordeling, observeren sferoïde groei onder een paar van verrekijkers of onder een lichte Microscoop (4 X vergroting). Spheroïden worden meestal detecteerbare na 48u onder een paar van verrekijkers of onder een lichte Microscoop (4 X vergroting). Na 10-14 dagen zijn ze zichtbaar zonder enig ander apparaat vergroting.
3. 5 dagen na de eerste druppel spotting, voeg 10 µL van verse RPMI/10% FCS medium toe aan elke daling. Vervolgens exchange 10 µL van medium om de andere dag. Het gebruik van een digitale loket is zeer nuttig in deze stap.
4. Afhankelijk van het celtype, oogsten de spheroïden (zie hoofdstuk 10 voor details) na 10-15 dagen door ze voorzichtig spoelen uit de cel cultuur schotel deksel met PBS. Ze verzamelen in een verse niet-klevende cel cultuur schotel.
   Opmerking: De teeltduur hangt af van de groeifase van de tumor van het melanoom cellen wanneer zij aanvankelijk werden afgeleid, b.v.spheroïden afgeleid van 451-LU cellen groeien tot ongeveer 500 µm in diameter binnen 12 dagen van het kweken in de daling van de hangende¹⁵ .

7. generatie van de dermale afdeling van Organotypic volledig huid reconstrueert

1. Genereren van modellen van de huid met behulp van 24-well cel microporeuze membraan inserts (porie maat 8 µm) in 24-Wells-platen geplaatst.
   Opmerking: Zorg dat je niet gebruikt opknoping maar permanent inzetstukken, omdat ze zullen worden geplaatst in een 6-well plaat voor lucht-liquid teelt in een later stadium.
2. Voorbereiding van het gel neutralisatie oplossing (GNL)¹⁵, evenals de voedingsbodems MM en endotheel groei media (BAVA)^16,17genoemd. Om te voorkomen dat coagulatie, winkel de collageen controletype I (meestal uit de staart van de rat, 3.5-4 mg/mL in 0,02 N azijnzuur) op ijs tot gebruik, omdat het begint gel op RT.
3. Resuspendeer 1 x 10⁵ fibroblasten per invoegen in GNL en meng snel de celsuspensie met collageen bij een verhouding van 1:3 in een eindvolume van 500 µL/invoegen. Meng door zachtjes pipetteren omhoog en omlaag om te voorkomen dat bubble vorming zoals bubbels kunnen afbreuk doen aan de kwaliteit van de huid reconstrueren.
4. De individuele dermale gels te regelen door hen te houden zonder medium op RT gedurende 30 min. in een steriele kap toestaan. Bedek vervolgens elke gel met DMEM met 4,5 g/L glucose, 1% L-glutamine, 10% FCS, en zonder L-pyruvaat, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.

8. generatie van de epidermale afdeling van Organotypic volledig huid reconstrueert

1. De volgende dag het medium verwijderen uit de dermale gels en equilibreer hen met BAVA media (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/mL gentamicine) gedurende 2 uur bij 37 ° C. Trekken van het medium en zorgvuldig zaad 1 x 10⁵ keratinocyten geresuspendeerde in 100 µL BAVA bovenop de dermale gel.
2. Incubeer de reconstrueert gedurende 1,5 uur bij 37 ° C om de keratinocyten vast te houden aan de dermale compartiment.
   Opmerking: Tijdens deze incubatietijd, de gels zal beginnen te krimpen als gevolg van de fibroblast-geïnduceerde contractie, en dus op zijn minst gedeeltelijk loskoppelen van de muren invoegen.
3. Dekking van de huid-equivalenten met ongeveer 800 µL BAVA en verwijder voorzichtig de residuele gel uit de muur invoegen met een kleine (witte) pipette uiteinde. Cultuur van de huid-equivalenten ondergedompeld in BAVA voor 7 dagen in een cel incubator bij 37 ° C, 5% CO₂, en wijzig het medium om de andere dag.
   Opmerking: In deze tijd de huid-equivalenten zal krimpen aanzienlijk.

9. lucht-vloeistof teelt van Organotypic volledig huid reconstrueert

1. Op dag 8, overdracht, elke invoegen in een individuele putje van de plaat van een 6-well. Alleen 1.2-1.4 MM medium milliliters toevoegen aan elk putje, zodat het reconstrueren van de huid wordt geleverd met een medium van de bodem van de put, maar niet met medium gedekt wordt.
   Opmerking: Teelt op de lucht-vloeistof-interface maakt het mogelijk stratificatie van de epidermale deel en de totstandbrenging van een volledige cornified laag (stratum corneum).
2. Tijdens de komende dagen van 10-17, door het medium te wijzigen zoals aangegeven in hoofdstuk 9.1 om de andere dag. Tijdens deze periode toevoegen drugs of andere stimuli desgewenst aan het medium. Verwijder voorzichtig de volledige huid reconstrueren van de microporeuze membraan invoegen met behulp van gebogen pincet voor verdere analyse, bijvoorbeeldimmunohistochemische analyse (Figuur 1).

10. generatie van de Organotypic melanoom sferoïde huid modellen

1. Om de spheroïden melanoom te integreren in de dermale compartiment van het organotypic reconstrueert u volledige huid, spoel zorgvuldig de spheroïden (na stap 6.4) uit de deksel van de opknoping drop cel cultuur schotel met PBS. Het verzamelen van 10-20 spheroïden/invoegen in een steriele niet-klevende cel cultuur schotel. Verwijder voorzichtig de buitensporige PBS met een pipet van Pasteur.
2. De spheroïden in de kleinste volume mogelijk BAVA gecombineerd. Op dit punt observeren en tellen van de spheroïden met het blote oog, zonder verdere vergroting apparaat. Neem 10-20 spheroïden per huid model/gel, zoals in stap 10.1.
3. Overbrengen naar de gewenste hoeveelheid GNL met fibroblasten (tijdens stap 7.3), en meng met het collageen type I. Ga verder zoals beschreven in de punten 7.3-9.1 van deze stap op.
   Opmerking: Spheroïden van de Tumor zichtbaar worden in de dermale gel als witte vlekken (Figuur 2)

Representative Results

Succesvolle behandeling van melanoom metastase kan worden beïnvloed door de cross-talk tussen tumorcellen alsmede tussen tumor en niet-getransformeerd gastheer cellen. Het doel van de ontwikkeling van de organotypic modellen van kanker in vitro is bedoeld als geschikt preklinische testsystemen die de 3D organisatie en de complexiteit van de menselijke melanoom recapituleren in vivo. Hierdoor is de studie van het therapeutisch effect op de tumor in een organotypic omgeving en de negatieve gevolgen voor de omliggende primaire weefsel in parallel.

Ontwikkeling van de beste modellen van de huid van de organotypic, is de kwaliteit van de primaire cellen cruciaal. Is het voordelig om jonge primaire fibroblasten en keratinocyten, te gebruiken omdat ze meestal minder gedifferentieerd ten opzichte van volwassen primaire huidcellen. Jonge huid cellen kunnen ofwel worden geïsoleerd van jonge voorhuid zoals beschreven in het protocol secties 1-5, maar kan ook worden gekocht van bedrijven als pre-natale primaire fibroblasten en keratinocyten. Als inkoop, moet er orde cellen van verschillende donoren om te voorkomen dat de donor-specifieke resultaten, bijvoorbeeldvoor drug gevoeligheid. Het gehele protocol wordt weergegeven als een schema in Figuur 3.

Kwaliteitscontrole van 3D full-huid equivalenten vereist immunohistochemische analyse. Een eerste indruk kan worden verkregen door de Haematoxyline-eosine (H & E) kleuring van paraffine ingesloten secties (3 µm). Gedetailleerde analyse van de kwaliteit van de epidermale differentiatie en vorming van de basale lamina tussen de dermis en de epidermis vereist immunohistochemische analyse met behulp van specifieke antilichamen tegen een epidermale stratificatie marker. Hierdoor onderscheid te maken tussen ongedifferentieerde, zeer proliferatieve cellen ligt dicht bij de basale membraan en zeer gedifferentieerd en keratinized cellen in het stratum corneum door de vorming van verschillende epidermale lagen tussen . Zoals blijkt uit het immuun-histologische kleuring (Figuur 4), differentiatie van keratinocyten gedurende de epidermis vergelijkbaar met normale huid zou kunnen worden bereikt: voornamelijk de ongedifferentieerde cellen van de onderste epidermale lagen (stratum basale en stratum spinosum) vlek positief voor keratine 14, terwijl de meer gedifferentieerde cellen uit de supra-basale lagen (stratum granulosum en hoornlaag) vlek positief voor keratine 10 en involucrin. Dienovereenkomstig, Filaggrine kleuring kan alleen worden waargenomen in zeer gedifferentieerde cellen van de stratum corneum. Bovenal blijkt laminin 5 kleuring dat een basale lamina fysiologisch de epidermale om aan te sluiten de dermale compartiment van de kunstmatige huid reconstrueren is gegenereerd. Dit bewijst dat een communicerende organotypic communicatie naar host melanoom cellen of spheroïden voor fysiologische en pathofysiologische analyse is gegenereerd.

Met het oog op melanoom drug screening, kunnen één melanoom cellen ook worden geïntegreerd in de dermis van volledige huid equivalenten toe DOVO melanoom nest vorming^18,19. Daarom, melanoom cellen worden gecombineerd met primaire fibroblasten in een verhouding van 5:1, gecentrifugeerde samen bij 200 x g gedurende 5 min en geresuspendeerde in GNL voorafgaand aan vermenging met collageen. Dientengevolge, zal het melanoom cel nesten spontaan vormen in de dermale compartiment. Volgens onze ervaring, alleen de cellen van de metastatische groei fase vorm juiste nesten, ten opzichte van melanoom cellen van de RGP of VGP¹⁵. Een groot nadeel van dit soort modellen het feit dat het aantal en de grootte van melanoom nesten gevormd niet kan worden voorspeld is, en tussen individuele huid variëren kunnen reconstrueert, onafhankelijk van elke behandeling. Bijvoorbeeld kunnen 1000 cellen zaadjes in de dermale compartiment krijgen 10 nesten, bestaande uit 100 cellen of 100 nesten, bestaande uit de 10 cellen (Figuur 5). Deze biologische variabelen presenteren met drie gebreken: ten eerste, het aantal en de grootte van melanoom nesten gevormd zijn onvoorspelbare; Ten tweede, de metastasen in vivo zijn meestal groter dan melanoom nesten en vertonen een meer complexe intra-tumoral diversiteit; en ten derde, als gevolg van de beperkte levensduur van tumor-nest modellen, behandeling wordt geïnitieerd vroeg en bijgevolg eerder remt tumor uitgroei in plaats van het veroorzaken van regressie van bestaande tumor nesten.

Om te overwinnen deze beperkingen organotypic melanoom sferoïde huid modellen kan worden gegenereerd. Door kweken 250 gemetastaseerd melanoom cellen in een hangende drop voor 14 dagen²⁰, worden spheroïden reproducibly gegenereerd uit levensvatbare melanoom cellen presenteert een compacte structuur met een definitieve diameter van ongeveer 500 µm nabootsen niet gevacuoliseerd tumor knooppunten, micro-uitzaaiing of inter capillaire micro regio's van solide tumoren^21,22. In het algemeen, een cellijn van melanoom is geschikt voor de generatie van spheroïden via de ophanging drop methode; echter cellen afgeleid van meer geavanceerde uitgezaaide tumor stadia vorm meer solide spheroïden in vergelijking met cellijnen die zijn afgeleid van vroege progressie stadia, bijvoorbeeldde RGP.

Voor sommige cellen, is het voordelig voor juiste sferoïde vorming ter verbetering van de viscositeit van de opknoping drop kweekmedium. Dit kan worden bereikt door de toevoeging van 10-50%-methylcellulose aan het kweekmedium. Voor de methylcellulose stockoplossing, autoclaaf 1.2 g-methylcellulose samen met een magnetische roer-bar in een 100 mL glazen fles. Voeg 100 mL voorverwarmde (60 ° C) middellange en roer voor 20 min bij kamertemperatuur, en een ander 1-2 h bij 4 ° C. De stockoplossing voor 2 h bij 5.000 x g centrifugeren en bewaren van de viskeuze supernatant bij 4 ° C tot gebruik.

Goede validatie van volledige huid melanoom sferoïde modellen is op voorwaarde dat door het feit dat een bepaald aantal van melanoom spheroïden kan - op zijn minst statistisch - worden geïntegreerd in de dermale fibroblast/collageen steigerwerk ik op dag 1 van de huid modelbouw, waardoor zij kunnen samen ontwikkelen tijdens de epidermale differentiatie voor meer dagen van 25-27. Het rendement van spheroïden kan worden geanalyseerd direct na het zaaien, omdat spheroïden worden weergegeven als witte vlekken in de transparante dermale gel en kunnen worden gezien zonder enig ander apparaat vergroting (Figuur 2). Dientengevolge, is een 3D huidmodel gegenereerd dat havens volwassen melanoom spheroïden, dat was gekweekt in vitro voor een totaal van ongeveer 42 dagen, met het hoogste niveau van intra-tumoral cel differentiatie¹⁵.

H & E kleuring van de huid melanoom sferoïde model onthult de histologische verschijning en cellulaire distributie van melanoom spheroïden zeer gelijkaardig aan één van de niet-gevacuoliseerd menselijke melanoom huid metastasen in vivo¹⁵ (Figuur 6 ). Twee subpopulaties van melanoom cellen zijn duidelijk te onderscheiden onder deze omstandigheden: een perifere delende subpopulatie en een centrale populaties, voornamelijk bestaande uit ineengekrompen, apoptotic of necrotische cellen, vormen de zogenaamde "necrotische" centrum. Immunohistochemisch wonen en prolifererende subpopulaties kan worden opgespoord met behulp van antilichamen tegen de proliferatie markering KI-67, overwegende dat de cellen van het necrotische center kunnen worden gevisualiseerd door TUNEL-kleuring¹⁵. Deze bijzondere verdeling van tumor cel subpopulaties is gerechtvaardigd door de sferoïde grootte (≥500 µm), als gevolg van een gebrek aan voedingsstoffen en zuurstof in het middengedeelte waar katabole afval ophoopt. Volgens het protocol, mits hier zal toestaan de generatie van een betrouwbare en reproduceerbare organotypic menselijke full-dikte huidmodel met ingesloten menselijke melanoom spheroïden die menselijke melanoom huid metastase na te bootsen. Toepassingen van dit model inclusief drug testen, screening van toxines, invloed van cosmetische verbindingen of laser therapie op melanoom uitgroei, en behandeling.

Figuur 1 : Teelt van 3D organotypic huid reconstrueert ondergedompeld met medium en op het raakvlak van air-liquide. Op dag ingebed 0 primaire keratinocyten worden overgeënt bovenop de dermale compartiment bestaande uit primaire fibroblasten in een collageen type ik matrix. 3D huid reconstrueert blijven gecultiveerde ondergedompeld met BAVA voor 7 dagen, loskoppelen van de muur invoegen en starten krimpen. Op dag 8 zijn de inserts overgedragen aan 6-putjes en gecultiveerd op het raakvlak van de lucht-vloeistof toe epidermale stratificatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Melanoom spheroïden ingebed in de dermale compartiment weergegeven als witte vlekken. Terwijl de voorbereiding van de dermale compartiment van de 3D huid reconstrueren, een bepaald aantal melanoom spheroïden kan worden toegevoegd aan de fibroblast collageen type meng ik. Zodra de dermale gel heeft geregeld, zichtbaar melanoom spheroïden als witte vlekken.

Figuur 3 : Regeling van 3D organotypic huid modelbouw. Verwijder adipeus weefsel uit de steekproef van de huid en snijd het in kleinere stukken. Incubatie met dispase oplossing bij 4 ° C's nachts vergemakkelijkt de scheiding van de epidermis van de dermis. Geïsoleerde primaire fibroblasten en keratinocyten moet afzonderlijk worden gecultiveerd en gebruikt tussen passage 4-6 en 3-4, respectievelijk. Vervolgens kan de generatie van de 3D huidmodel gaat u verder zoals beschreven in het protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : 3D organotypic huid reconstrueert tonen een differentiatie niveau vergelijkbaar met normale menselijke huid. Paraffine secties van huid equivalenten (A) in vergelijking met normale menselijke huid (B) voor de expressie van keratines 14 werden gekleurd (rood: λ_ex 554 nm; λ_em 568 nm) en 10, involucrin (groene: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm ), Filaggrine (groene: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm), en laminin 5 (groene: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm), en geanalyseerd met een confocal fluorescentie Microscoop. Celkernen waren gevisualiseerd door DAPI kleuring (blauwe: λ_ex 340 nm; λ_em 488 nm). Immunohistochemische onderzoek van de 3D full-dikte van de huid equivalenten geopenbaarde juiste epidermale stratificatie vormen verschillende lagen van de opperhuid, zoals te zien in normale menselijke huid. Terwijl de cellen uit de onderste epidermale lagen gekleurd positief voor keratine 14, onderscheiden de meer cellen van de supra-basale laag toonde keratine 10 en involucrin vlekken. Zeer gedifferentieerde cellen dicht bij de Filaggrine van de hoornlaag uitgedrukt. Laminin 5 kleuring toont dat een basale lamina wordt gegenereerd om te fysiologisch verbinden met de epidermale de dermale compartiment (laagste panel). Dit cijfer is ontleend aan Voersmann et al. ¹⁵ met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Het aantal en de grootte van spontaan gevormde melanoom nesten niet kan worden voorspeld. DOVO melanoom nest vorming in de dermale compartiment van volledige huid equivalenten kunnen worden bereikt door het mengen van een bepaald aantal melanoom cellen met primaire fibroblasten beide celtypen insluiten in het collageen type ik matrix. Het aantal en de grootte van spontaan gevormde melanoom nesten kunnen alleen van een volwassen huid van 3D reconstrueren na ongeveer 21 dagen worden geanalyseerd. Zoals afgebeeld van twee monsters (A) en (B), de aantallen en de grootte van de nesten van melanoom kunnen variëren tussen individuele huid reconstrueert. Dientengevolge, is het moeilijk om deze modellen te valideren en te voorspellen het therapeutische effect. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6 : Melanoom spheroïden geïntegreerd in de huid equivalenten recapituleren toonsoort wezenstrek van menselijke cutaan melanoom metastase. H & E gekleurd paraffine secties van tumor spheroïden ingebed in de huid equivalenten bleek spheroïden belangrijkste kenmerken delen met niet-gevacuoliseerd menselijke cutaan melanoom metastasen in vivo. Twee subpopulaties van cellen zijn duidelijk te onderscheiden: een perifere levende populaties en centrale populaties, voornamelijk bestaande uit ineengekrompen, apoptotic of necrotische cellen, vormen het "necrotische" center. Deze verdeling van tumor cel subpopulaties wordt gegarandeerd door de sferoïde grootte. Dit cijfer is gewijzigd van Voersmann et al. ¹⁵ met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De organotypic melanoom sferoïde huidmodel geïntroduceerd hier nieuwe inzichten voor een dieper begrip van intra-tumoral garandeert en tumor-gastheer interactie, en een geavanceerde screening platform om te bestuderen van de moleculaire mechanismen van ontwikkeling van de tumor kan bieden en therapie resistentie in de toekomst.

Gegarandeerd de beste fysiologische en reconstrueert in vivo nabootsen van de voorwaarden van de huid, de kwaliteit van de primaire cellen is van het allergrootste belang. Zoals hierboven vermeld, jonge of pre-natale huidcellen Toon de laagste graad van differentiatie en zijn daarom best geschikt voor het genereren van full-dikte huid equivalenten. De eerste mogelijke kwaliteitscontrole is de mate van dermale contractie op dag 2 na het zaaien de keratinocyten en zo van de gel op de BAVA (Protocol artikelen 8.2 en 8.3). Dermale gels zal het meest met de beste kwaliteit van fibroblasten krimpen. Ook kan de integratie van te weinig of teveel fibroblasten schaden dermale contractie en bijgevolg de gehechtheid van de epidermale aan de dermale compartiment. Dit zal op zijn beurt compromitteren epidermale differentiatie, omdat dit proces een uitgebreide cross-talk tussen dermale en epidermale cellen vereist.

De kwaliteit van primaire cellen is ook kritisch afhankelijk van de cel confluentie evenals de passage van de cellen. Als de keratinocyten worden verbouwd tot ≥80% confluentie ze onmiddellijk stoppen prolifererende en beginnen te onderscheiden. Daarom is het belangrijk om hen om 40-70% confluentie cultuur tijdens passaging en gebruik ze niet later dan passage 3-4. Fibroblasten zijn minder gevoelig maar dient niet later dan 4-6 passage. Let ook op: dat alle primaire cellen en cellijnen die worden gebruikt voor het genereren van de modellen van de huid van de organotypic melanoom sferoïde worden gekweekt zonder antibiotica, en dus het risico op besmetting is hoog. Echter, de toevoeging van antibiotica verandert de Fysiologie van de afzonderlijke cellen en dus vermindert de kwaliteit van de huid-equivalenten.

In het algemeen, is tumor sferoïde vorming mogelijk van bijna alle soorten cellijnen van de tumor en ook van tumorcellen vers geïsoleerd van patiënt materiaal. De eerste cel nummer en/of teelt tijd voor het verkrijgen van optimale sferoïde maten variëren afhankelijk van het celtype gebruikt. Tot een grootte van 150-200 µm, alle cellen opgenomen in een sferoïde nog voldoende leverbaar met voedingsstoffen via eenvoudige verspreiding. Alleen spheroïden met maten ≥500 µm tonen een hoge mate van celdifferentiatie en typische kenmerken van niet-gevacuoliseerd tumor weefsel²²vertegenwoordigen.

De organotypic melanoom-sferoïde-huid-model ontwikkeld hier is bijzonder geschikt om te studeren van tumor-gastheer interacties en voor melanoom drug testende kader van in-vivo-graag voorwaarden¹⁵. De omgeving van melanoom in vivo is echter nog complexer, herbergen een verscheidenheid van tumor verbonden celtypen, met inbegrip van immuuncellen en endotheliale cellen. Aangezien de toevoeging van goede primaire immune cellen kampt met problemen met comptabiliteit, zijn deze modellen nog niet kundig voor adequaat toezicht kunnen houden immuun-therapeutische benaderingen.

Niettemin, melanoom spheroïden kunnen worden gegenereerd vanuit vers geïsoleerde patiënten materiaal en zijn opgenomen in de volledige huid reconstrueren, kan dienen als individuele drug screening platformen. Zelfs de integratie van stukken van melanoom metastase in de huid reconstrueert is denkbaar drug combinaties testen in een op maat gemaakte therapeutische aanpak. Met inbegrip van het organotypic 3D-huid-melanoom model in preklinische testen is waarschijnlijk om ervoor te zorgen dat alleen de meest veelbelovende nieuwe therapeutische concepten zijn gezet in klinische tests, dus het verloop afremmen van potentiële nieuwe behandelingen voor dit ziekte en optrekken van het steunpercentage van therapeutische succes in klinische proeven.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
fetal serum albumin (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X dilute in PBS
RPMI	Thermo Fisher Scientific	61870010	for cultivation of melanoma cell lines
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	for cultivation of primary fibroblasts
Dispase	Gibco life technologies	17105041	2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I	BD Biosciences	354249	usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon	Nunc	140629	8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer	BD Falcon	352360	yellow
Gentamycine	Thermo Fisher Scientific	15750060	dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium	Cell Systems		do not add FCS or antibiotics
Collagenase	SERVA	17454	NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes	Cell Systems	FC-0007	alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts	Cell Systems	FC-0001	alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate	Gibco life technologies	41965	mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine	Gibco life technologies	21765-029	add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF	Gibco life technologies	13247-051	add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride	Merck Chemicals	2381	add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid	Alfa Aesar	18851	add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E-0135	add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine	Sigma-Aldrich	P-0503	add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine	Sigma-Aldrich	T-0665	add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine	Sigma-Aldrich	T-6397	add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-088816	add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine	Sigma-Aldrich	S-4311	add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride	Sigma-Aldrich	C-7017	add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lot 086K0361	add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine	Sigma-Aldrich	A-9795	add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine	PromoCell	C-42209	add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride	Sigma-Aldrich	255521	add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody	Dako	M7002	1:50
anti cytokeratin 14 antibody	Santa Cruz	sc-53253	1:200
anti laminin 5 antibody	Santa Cruz	sc-32794	1:50
anti filaggrin antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-13440	1:50
anti involucrin antibody	Acris Antibodies	AM33368PU	1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled	LifeSpan Biosciences	LS-C153907	1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled	Jackson Immuno Research	115-165-003	1:1000
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	1:100