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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un modèle de peau 3D organotypique mélanome sphéroïde

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57500
Automatic Translation
1, 1
1Experimental Dermatology, Medical Faculty, TU-Dresden

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour générer un modèle 3D organotypique mélanome sphéroïde de peau qui reprend l’architecture et complexité multicellulaire d’un orgue/tumeurs in vivo , mais en même temps peut accueillir systématique expérimentale intervention.

Abstract

La transformation maligne des mélanocytes, les cellules pigmentaires de la peau humaine, provoque la formation d’un mélanome, un cancer très agressif avec l’accroissement du potentiel métastatique. Récemment, les mono-chimiothérapies continuent à améliorer en thérapies de combinaison spécifique de mélanome avec inhibiteurs de la kinase ciblée. Mélanome métastatique reste une maladie mortelle car les tumeurs présentent une résistance primaire ou développent une résistance aux traitements novateurs, ainsi recouvré capacité tumorigène. Afin d’améliorer le succès thérapeutique du mélanome malin, la détermination des mécanismes moléculaires qui confère la résistance contre les méthodes classiques de traitement est nécessaire ; Cependant, elle nécessite innovatrice cellulaire in vitro des modèles. Ici, nous introduisons un in vitro en trois dimensions (3D) organotypique mélanome sphéroïde modèle qui peut représenter l’architecture in vivo du mélanome malin et peut-être justifier de nouvelles connaissances sur intra-tumorale ainsi que de l’interaction hôte-tumeur. Le modèle intègre des nombres définis des sphéroïdes mélanome matures et différenciées dans un modèle de reconstruction 3D humaine pleine peau composée de cellules primaires de la peau. L’état de composition et de la différenciation cellulaire des sphéroïdes mélanome embarqué est semblable à celui du mélanome métastase in vivo. À l’aide de ce modèle de sphéroïde de mélanome organotypique comme une drogue, dépistage de plate-forme peut prendre en charge l’identification des intervenants à sélectionné des combinaisons thérapeutiques, tout en épargnant la charge de traitement inutile pour les non-répondants, augmentant ainsi l’avantage de interventions thérapeutiques.

Introduction

La peau humaine se compose de deux compartiments distincts qui ont des fonctions différentes en protégeant le corps contre les effets environnementaux négatifs1. Le compartiment inférieur cutané se compose d’un fibro-élastiques du tissu conjonctif. Il est composé de fibres de collagène et d’élastine vaguement liés, synthétisés par les fibroblastes, qui dessert une fonction de barrière mécanique. Le derme est séparé de l’épiderme supérieur de la lame basale qui est produite comme une matrice extracellulaire grâce à une communication constante entre les deux compartiments de la peau. Par contraste avec le derme, l’épiderme est un épithélium pavimenteux qui se compose principalement de kératinocytes et peut être différenciée en quatre couches. La strate basale se compose de kératinocytes basales indifférenciées constamment dérivent de cellules progénitrices de peau stratification à travers les étapes du stratum spinosum et couche granuleuse dans la couche cornée de pour protéger le corps contre les infections et la déshydratation2. Mélanocytes sont alignés au niveau de la membrane basale et communiquent par le biais des extensions dendritiques avec plusieurs kératinocytes. Ils produisent la mélanine pigment afin de protéger les tissus de la peau contre les effets néfastes des rayons UV, comme le vieillissement de la peau, immunosuppression, l’inflammation et l’induction de cancers cutanés non mélanocytaires. Contribution de rayonnements UV à la transformation des mélanocytes au mélanome malin, cependant, est encore en débat3.

Développement de mélanome est différencié en étapes de progression tumorale différente et caractérisé par certaines modifications génétiques, morphologiques et histologiques4. Ils proviennent soit de novo ou d’un naevus innée ou acquise en raison d’un local augmentent de la prolifération de mélanocytes provoquant une néoplasie bénigne. Cette lésion précurseur peut convertir en dysplasiques structurellement modifiée contenant des cellules atypique, qui peuvent continuer à la première étape maligne, la phase de croissance radiale (RGP). Cette phase de progression tumorale précoce est caractérisée par les cellules prolifèrent radialement dans l’épiderme, montrant peu de cellules localement envahissante dans le derme papillaire. Pendant le mélanome de phase (VGP) croissance verticale subséquente des cellules montrent déjà un phénotype métastatique et envahissant par effraction à travers la lame basale d’infiltrer les parties plus profondes du derme, mais aussi le tissu sous-cutané5. Enfin, le mélanome métastatique a (MM) représente l’étape de progression plus agressif avec des cellules métastatiques systémiquement répand à travers le système sanguin et lymphatique à envahir dans la partie distale des organes comme le foie, le poumon et cerveau6.

A ce jour, diagnostic précoce, suivi par la chirurgie reste le traitement le plus efficace du mélanome malin. Le pronostic des patients atteints de métastases à distance, reste toutefois particulièrement pauvre7, car les chimiothérapies classiques confèrent seulement peu survie avantage8,9. Toutefois, après des décennies de stagnation, les progrès récents dans les thérapies ciblées ont considérablement amélioré le pronostic du mélanome malin.

Dysregulation de deux voies principales mitogène activé, le RAS-RAF-MEK-ERK et les voies de signalisation PI3K-AKT-PTEN, présentent les principaux moteurs de progression de mélanome, surtout lors de l’activation constitutive des mutations ponctuelles de le BRAFV600 de proto-oncogènes et ARN est présents à10. En conséquence, l’invention des inhibiteurs de la kinase ciblée a promis un bénéfice thérapeutique pour les patients souffrant de mélanome métastatique. Une multitude d’essais cliniques menés à ce point n’a pas atteint un avantage important pour les patients atteints de mélanomes métastatiques. Presque toutes les réponses sont partielles, avec une sous-population de patients présentant une résistance primaire. En outre, l’acquisition de résistance secondaire menant à une rechute a été observée dans la majorité des patients11,12.

Il devient clair qu’analyse de l’état de mutation seul ne suffit pas d’élaborer la stratégie thérapeutique plus puissante. Nouveaux outils diagnostiques rapides et fiables sont nécessaires pour enregistrer et analyser la sensibilité des cellules cancéreuses individuels systématiquement. La grande majorité des données actuellement disponibles sur le mélanome humain ont été obtenue à partir de cultures cellulaires à deux dimensions (2D) mélanome. Cellules de tumeur, cependant, cultivées en 3D permettent de diaphonie intercellulaire entre cancer différencié sous-populations de cellules aussi bien qu’entre les cellules cancéreuses et les tissus environnants non transformées à hôte. Par conséquent, il serait préférable de reconstruire l’environnement 3D où le mélanome développée pour être utilisée comme une projection préclinique modèle13,14.

Protocol

Tous les tissus humains travaux ont été réalisés à l’aide de protocoles institutionnels approuvés.

1. séparation du derme et l’épiderme de la peau humaine (prépuce juvénile de la circoncision)

  1. Placez le prépuce (généralement 1 à 2 cm2) dans une boîte de Petri de cellule stérile non adhésif (Ø 10 cm) et couvrir de 10 à 12 mL de solution saline tamponnée au phosphate+ (PBS, 0,5 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, pH 7,2 = PBS+). Enlever tous les tissus (tissu adipeux) en excès à l’aide de forceps et bistouri stérile.
  2. Couper la peau en morceaux de 3 x 5 mm, lavez-les avec du PBS et transférez-les sur un plat de la culture de cellule stérile non adhésif (Ø 6 cm). Couvrir les morceaux de tissus avec 5 à 7 mL de solution a (2 U/mL dans du PBS). Sceller la boîte de Petri de cellule avec film de paraffine et incuber pendant 16 h à 4 ° C.
  3. Rétracter l’épiderme de la partie cutanée avec deux pinces stériles. Transférer les morceaux de tissus disséqués pour récipients de culture de cellule non adhésif (Ø 6 cm) et couvrir chacun d’eux avec du PBS+.

2. isolement des primaires kératinocytes de l’épiderme

  1. Retirez délicatement le PBS+ de la boîte de Petri de cellule à l’aide d’une pipette Pasteur et laver les morceaux de tissu épidermique (section 1.3) avec du PBS. Couper l’épiderme en petits morceaux (1 mm2) et à leur rassemblement dans un tube conique de 50 mL. Ajouter 10 mL 1 x trypsine-EDTA (chauffé à 37 ° C) et laisser incuber pendant 5 min dans un bain d’eau à 37 ° C. Vortex la suspension tissu toutes les 2 min.
  2. Bloquer la réaction enzymatique en ajoutant 1 mL de sérum de veau foetal (FCS). Remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas avec une pipette en plastique de 10 mL pour 4 min. essayez d’éviter les bulles et la formation de mousse.
  3. Pipette de la suspension cellulaire dans une crépine de cellule (pores de taille 100 µm), placé au dessus d’un tube conique frais 50 mL et rincer 3 x 5 ml de PBS. Centrifuger les cellules à x 200 g pour 5 min. Resuspendre le culot dans le milieu de culture de 2 à 6 mL contenant 1 % (v/v) de gentamycine. Déterminer le nombre de cellules manuellement par comptage de cellules dans les cellules de 6 x 105 un hémocytomètre et graines dans un flacon de culture cellulaire T75.

3. culture de kératinocytes primaires

  1. Incuber les kératinocytes primaires isolés à l’étape 2.3 dans un incubateur à cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 dans le milieu des kératinocytes sans FCS, à la confluence de 50 à 70 %.
  2. Au passage les kératinocytes soigneusement retirer le milieu, ajouter 5 mL de PBS-EDTA et incuber les cellules pendant 10 min à 37 ° C. Vérifier si les cellules ont commencé à se détacher de la fiole de la culture sous un microscope photonique (4 X grossissement : cellules apparaîtra arrondies mais sont encore attachés !). Si ce n’est pas le cas, remplacer les vieux PBS-EDTA avec frais de PBS-EDTA et ré-incuber pendant 10 min à 37 ° C.
  3. Ajouter 5 mL 1 x trypsine-EDTA aux cellules arrondies encore recouverte de 10 mL de PBS-EDTA et re-les incuber pendant 1-3 min à 37 ° C. Bloquer la réaction enzymatique en ajoutant 1 mL FCS et de recueillir les cellules individuelles dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min, resuspendre le culot dans le milieu des kératinocytes et semences 6 x 105 cellules dans un flacon de culture cellulaire T75 fraîche.
    NOTE : Pour générer organotypique peau reconstruit, les kératinocytes primaires doivent être utilisés pas plus tard que le passage de 3-4.

4. isolement des fibroblastes primaires du derme

  1. Couper le tissu cutané (section 1.3) en petits morceaux (1 mm2) et de les transférer dans un tube conique de 50 mL. Ajouter 10 mL de collagènase-solution (5 U/mL dans du PBS+) et incuber pendant 45 min dans un bain d’eau à 37 ° C. Centrifuger le mélange de morceaux de tissus et de cellules à 200 x g pendant 5 min.
  2. Laver le culot cellulaire deux fois avec 10 mL DMEM contenant 4,5 g/L de glucose et de la L-Glutamine, mais sans L-Pyruvate. Enfin remettre en suspension les morceaux de tissus dans 2 mL de DMEM contenant 1 % (v/v) de gentamycine et 10 % FCS. Transférer dans un flacon de culture cellulaire T25 et les incuber dans un incubateur à cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant la nuit.
    Remarque : Le faible volume permet les fibroblastes migrer hors les débris tissulaires et oblige à fixer sur le flacon de culture.
  3. Le lendemain matin, ajouter un autre 6 mL DMEM/gentamicine/FCS et incuber pendant 2 ou 3 jours à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules ont atteint 80 à 90 % confluence.

5. culture de fibroblastes primaires

  1. Passage les fibroblastes, retirez le support et laver les cellules adhérentes avec du PBS. Ajouter 5 mL 1 x trypsine-EDTA et incuber pendant 3 min à 37 ° C.
  2. Bloquer la réaction enzymatique en ajoutant 5 mL DMEM/FCS et de recueillir les cellules individuelles dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min, resuspendre le culot dans un milieu DMEM et 6 x 105 cellules des graines dans un flacon de culture cellulaire T75 fraîche.
    NOTE : Pour générer organotypique peau reconstruit, les fibroblastes primaires doivent être utilisés pas plus tard que le passage de 4 à 6.

6. génération de mélanome 3D sphéroïdes Via la méthode Drop de pendaison

  1. Cellules de mélanome culture (p. ex., 451-LU ou n’importe quelle ligne de cellules de mélanome d’intérêt) selon des protocoles généraux, à l’aide de RPMI contenant 10 % FCS15.
    1. Pour générer des sphéroïdes de mélanome de taille et de qualité similaires, laver les cellules de mélanome dans du PBS, ajouter 5 mL de 1 x trypsine-EDTA dans du PBS aux cellules dans un T175 flacon de culture de cellules et incuber pendant 3 à 5 min à température ambiante (RT). Neutraliser la trypsine en ajoutant 5 mL RPMI/10% FCS. Récolte que les cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min. Resuspendre le culot dans RPMI/FCS à une concentration finale de 10 000 cellules/mL, telle que déterminée en comptant dans un hémocytomètre.
  2. Spot 40 x 25 µL (= 250 cellules) de la suspension cellulaire sur la surface intérieure du couvercle d’une boîte de Petri stérile non adhésif cellulaire (Ø 10 cm) à l’aide d’une multi-pipette Electronique. Avec un mouvement rapide, mais lisse, tournez le couvercle et placez-le sur le plat de culture cellulaires respectives contenant 5 mL de PBS.
    1. Culture « goutte plats suspendu » dans un incubateur à cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 10 à 14 jours, selon le type de cellule utilisé.
      NOTE : Les cellules de la phase de croissance MM généralement croissent plus vite et forment des sphéroïdes plus solides dans la goutte de suspension par rapport aux cellules de mélanome dérivés du RGP ou VGP. Pour une évaluation individuelle, observer la croissance de sphéroïde sous une paire de jumelles ou sous un microscope photonique (grossissement de X 4). Généralement, les sphéroïdes deviennent détectables après 48 h sous une paire de jumelles ou sous un microscope photonique (grossissement de X 4). Après 10-14 jours, ils sont visibles sans n’importe quel dispositif de grossissement.
  3. 5 jours après avoir repéré la baisse initiale, ajouter 10 µL de milieu FCS RPMI/10% frais dans chaque goutte. Par la suite, échanger 10 µL de milieu tous les deux jours. L’utilisation d’un distributeur électronique est très utile dans cette étape.
  4. Selon le type de cellule, récolter les sphéroïdes (voir section 10 pour plus de détails) après 10-15 jours en les rinçant doucement glisser le couvercle de plat de culture cellulaire avec du PBS. Les recueillir dans un récipient de culture cellulaires non-adhésifs fraîches.
    Remarque : La période de culture dépend de la phase de croissance de la tumeur des cellules mélanome lorsqu’ils ont été initialement dérivées, par exemple, sphéroïdes dérivées de cellules 451-LU croître d’environ 500 µm de diamètre dans les 12 jours de culture dans la goutte de suspension15 .

7. génération du compartiment cutanée d’organotypique pleine peau reconstruit

  1. Générer des modèles de peau à l’aide de la cellule de 24 puits microporeux membrane insertions (taille 8 µm de porosité) placées en plaques 24 puits.
    Remarque : Assurez-vous de ne pas faire usage de pendaison, mais debout, insertions, parce qu’ils seront placés dans une plaque de 6 puits pour air liquide de culture à un stade ultérieur.
  2. Préparer la solution (GNL) de neutralisation du gel15, ainsi que les milieux de culture dénommé MM et croissance endothéliale médias (EGM)16,17. Pour éviter la coagulation, magasin le collagène de type I (généralement de queue de rat, 3,5 à 4 mg/mL dans l’acide acétique 0,02 N) sur la glace jusqu'à l’utilisation, car il commence au gel à température ambiante.
  3. Remettre en suspension les fibroblastes5 1 x 10 par plaquette en GNL et mélanger rapidement la suspension cellulaire avec le collagène à un ratio de 1:3 dans un volume final de 500 µL/insert. Mix de pipetage doucement up et down pour éviter la formation de bulles car bulles pourraient altérer la qualité de la peau de reconstituer.
  4. Laissez les gels cutanées individuels de s’installer en les gardant sans moyen à ta pendant 30 min dans une hotte stérile. Par la suite recouvrir chaque gel DMEM contenant 4,5 g/L de glucose, 1 % L-glutamine, 10 % FCS et sans L-pyruvate et incuber une nuit à 37 ° C.

8. génération du compartiment épidermique d’organotypique pleine peau reconstruit

  1. Le lendemain retirer le support de gels cutanées et les équilibrer avec les médias d’EGM (FCS de 10 %, 1 % PenStrep, gentamicine 10 mg/mL) pendant 2 h à 37 ° C. Retirer le milieu et des graines soigneusement 1 x 105 kératinocytes resuspendues dans 100 µL EGM surface du gel par voie cutanée.
  2. Incuber le reconstruit pendant 1,5 h à 37 ° C pour permettre les kératinocytes d’adhérer au compartiment par voie cutanée.
    Remarque : Pendant cette période d’incubation, les gels commenceront à rétrécir en raison de la contraction induite par des fibroblastes et donc, au moins partiellement en détacher les parois de l’insert.
  3. Couvrir les équivalents de peau avec quelque 800 µL EGM et retirer délicatement le gel résiduel de la paroi de l’insert avec un petit bout de pipette (blanc). Les équivalents de peau submergés en EGM pendant 7 jours dans un incubateur à cellules à 37 ° C, 5 % de CO2, de la culture et de changer le support de tous les autres jours.
    Remarque : Pendant ce temps les équivalents de peau vont diminuer considérablement.

9. air-liquide culture organotypique pleine peau reconstruit

  1. Au jour 8, transfert chaque insérer dans un puits individuel d’une plaque de 6 puits. Seulement ajouter 1,2-1,4 mL MM Medium dans chaque puits, afin que la reconstruction de la peau est fournie avec le support du fond du puits, mais n’est pas recouvert de médium.
    Remarque : La culture à l’interface air-liquide permet de stratification de la partie épidermique et la mise en place d’une couche cornéocytaire complète (stratum corneum).
  2. Durant les prochains jours 10-17, changer le support comme indiqué dans la section 9,1 tous les deux jours. Durant cette période, ajouter des médicaments ou autres stimuli au besoin au milieu. Retirer délicatement la peau pleine de reconstruire de l’insert de membrane microporeuse à l’aide de brucelles courbée pour approfondir l’analyse, par exemple, analyse immunohistochimique (Figure 1).

10. génération des modèles de peau mélanome organotypique sphéroïde

  1. Pour intégrer les sphéroïdes de mélanome dans le compartiment dermique de l’organotypique pleine peau reconstruit, Rincez soigneusement les sphéroïdes (après l’étape 6.4) glisser le couvercle de la pendaison drop cell Pétri avec du PBS. Collecter 10-20 sphéroïdes/insert dans une boîte de Petri stérile non adhésif cellulaire. Retirez soigneusement les PBS excessive avec une pipette Pasteur.
  2. Aspirer les sphéroïdes dans la plus petite possible volume d’EGM. À ce stade, observer et compter les sphéroïdes à le œil nu, sans autre dispositif de grossissement. Prendre des sphéroïdes de 10 à 20 par modèle/gel de la peau, comme indiqué dans l’étape 10.1.
  3. Transférez-les sur le volume souhaité de GNL contenant des fibroblastes (pendant l’étape de 7,3) et mélanger avec le collagène de type I. De cette étape sur procéder tel que décrit dans les sections 7.3-9.1.
    Remarque : Les sphéroïdes de tumeur deviennent visibles dans le gel par voie cutanée sous forme de taches blanches (Figure 2)

Representative Results

Succès du traitement des métastases de mélanome peut être influencé par la diaphonie entre les cellules tumorales ainsi qu’entre tumeur et les cellules de l’hôte non transformées. Le but de développer des modèles organotypique de cancer in vitro est de fournir des systèmes de test précliniques appropriés qui récapitulent l’organisation 3D et la complexité de mélanome humain in vivo. Ceci permet l’étude des effets thérapeutiques sur la tumeur au sein d’un environnement organotypique et les effets néfastes sur les tissus environnants primaire en parallèle.

Pour développer les meilleurs modèles de peau organotypique, la qualité des cellules primaires est cruciale. Il est avantageux d’utiliser juvéniles primaires fibroblastes et des kératinocytes, parce qu’ils sont en général moins différenciés par rapport aux cellules adultes primaire de la peau. La peau juvénile cellules peuvent soit être isolé du prépuce pour mineurs tel que décrit dans les sections du protocole 1-5, mais peut aussi être acheté provenant des compagnies pré-natal primaires fibroblastes et des kératinocytes. Si vous achetez, il est nécessaire aux cellules de l’ordre des différents donateurs afin d’éviter les donateurs axée sur les résultats, par exemple, pour la sensibilité aux médicaments. Le protocole entier s’affiche sous forme de modèle à la Figure 3.

Contrôle de la qualité de 3D pleine-peau équivalents nécessite l’analyse immunohistochimique. Une première impression peut être obtenue par l’hématoxyline-éosine (H & E) souillant de paraffine intégrée des sections (3 µm). Une analyse détaillée de la qualité de la différenciation épidermique et de la formation de la couche basale entre le derme et l’épiderme nécessitent analyse immunohistochimiques utilisant des anticorps spécifiques contre un marqueur de stratification épidermique. Cela permet de faire la distinction entre les cellules indifférenciées, hautement proliférantes situé à proximité de la membrane basale et hautement différenciées et kératinisées de cellules de la couche cornée par le biais de la formation des couches épidermiques distinctes entre les deux . Comme en témoigne la coloration histologique immunitaire (Figure 4), la différenciation des kératinocytes tout au long de l’épiderme était possible similaire à la peau normale : principalement les cellules indifférenciées des couches épidermiques inférieures (strate basale et stratum spinosum) tache positive pour la kératine 14, tandis que les cellules plus différenciées provenant des couches précité-basale (couche granuleuse et la couche cornée) tachent positive pour la kératine 10 et involucrin. En conséquence, le filaggrine coloration pourrait seulement être observée dans des cellules hautement différenciées du stratum corneum. Plus important encore, laminine 5 coloration révèle qu’une lame basale a été générée pour connecter physiologiquement l’épiderme au compartiment dermique de la reconstruction de la peau artificielle. Ce qui prouve qu’un micro-environnement organotypique communicant a été généré pour héberger les cellules de mélanome ou sphéroïdes analyse physiologiques et physiopathologiques.

Aux fins de dépistage des drogues mélanome, cellules du mélanome unique peuvent également être intégrés dans le derme des équivalents pleine peau pour permettre de novo mélanome nid formation18,19. Par conséquent, cellules du mélanome sont combinés avec des fibroblastes primaires à un ratio de 5:1, centrifugé ensemble à 200 x g pendant 5 min et resuspendues dans le GNL avant de mélanger avec le collagène. En conséquence, les nids de cellules de mélanome formeront spontanément dans le compartiment par voie cutanée. Selon notre expérience, seules les cellules de la croissance métastatique phase nids de bonne forme, par rapport aux cellules de mélanome du RGP ou VGP15. Un inconvénient majeur de ces types de modèles est le fait que le nombre et la taille des nids de mélanome formé ne peuvent être prédit et peuvent varier entre chaque peau reconstruit, indépendamment de tout traitement. Par exemple, 1 000 cellules ensemencées dans le compartiment par voie cutanée peuvent gagner 10 nids composé de 100 cellules ou 100 nids composé de 10 cellules chaque (Figure 5). Ces variables biologiques présentent trois défauts : tout d’abord, le nombre et la taille des nids de mélanome formé sont imprévisibles ; Deuxièmement, les métastases in vivo sont généralement plus grandes que les nids de mélanome et présentent une diversité intra-tumorale plus complexe ; et Troisièmement, en raison de la durée de vie limitée des modèles de tumeur-nid, traitement est initiée très tôt et par conséquent plutôt inhibe l’excroissance des tumeurs au lieu de provoquer la régression des nids de tumeur existante.

Pour surmonter ces modèles limites organotypique mélanome sphéroïde peau peut être généré. Par culture 250 mélanome métastatique des cellules dans un accrochage déposer pendant 14 jours20, sphéroïdes sont générés reproductible consistant en mélanome viable des cellules présentant une structure compacte avec un diamètre final d’environ 500 µm imiter non vascularisés nœuds, micro-métastase ou inter capillaire micro régions de la tumeur de tumeurs solides21,22. En général, une lignée de cellules de mélanome est adaptée pour la génération des sphéroïdes via la pendaison drop méthode ; Cependant, les cellules dérivées de forme de tumeur métastatique stades les plus avancés sphéroïdes plus solides par rapport aux lignées cellulaires dérivées de progression stades précoces, par exemple, le RGP.

Pour certaines cellules, il est avantageux pour la formation de sphéroïde appropriée améliorer la viscosité de la pendaison drop de milieu de culture. Ceci peut être réalisé par l’addition de 10 à 50 %-cellulose méthylique au milieu de culture. Pour la solution mère de méthyl-cellulose, cellulose-méthylique de 1,2 g d’autoclave avec une barre magnétique mélanger dans un flacon de verre de 100 mL. Ajouter 100 mL de milieu de préchauffé (60 ° C) et remuez pendant 20 min à température ambiante et un autre 1-2 h à 4 ° C. Centrifuger la solution pendant 2 heures à 5 000 x g et conserver le surnageant visqueux à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.

Bonne validation de modèles de sphéroïde pleine peau mélanome est fournie par le fait qu’un nombre défini de mélanome sphéroïdes peut - au moins statistiquement - être intégrés dans le fibroblastes/collagène dermique j’ai échafaudage au jour 1 de la construction de modèle de peau, ce qui permet eux pour co-développer au cours de la différenciation épidermique pour plus de 25 à 27 jours. Le rendement des sphéroïdes peut être analysé directement après le semis, car les sphéroïdes apparaissent comme des taches blanches dans le transparent dermiques, gel et peuvent être vu sans n’importe quel dispositif de grossissement (Figure 2). Ainsi, un modèle 3D de la peau est généré que sphéroïdes de mélanome mature de ports, qui avaient été cultivées in vitro pour un total d’environ 42 jours, montrant au plus haut niveau intra tumoraux cellulaire différenciation15.

La coloration H & E du modèle peau mélanome sphéroïde révèle l’aspect histologique et la distribution cellulaire des sphéroïdes de mélanome est très semblable à celui de mélanome humain non vascularisé métastases in vivode la peau15 (Figure 6 ). Deux sous-populations de cellules de mélanome sont distingue clairement dans ces conditions : une sous-population périphérique proliférant et une sous-population centrale composé majoritairement de ratatinée, apoptose ou cellules nécrotiques, formant ce qu’on appelle « nécrosées » Centre. Immunohistochimique vivant et multiplient les sous-populations peut être détecté en utilisant des anticorps contre le marqueur de prolifération KI-67, alors que les cellules du centre nécrotique peuvent être visualisés par coloration TUNEL15. Cette répartition particulière des sous-populations de cellules de tumeur est justifiée par la taille de sphéroïde (≥500 µm), résultant d’un manque de nutriments et d’oxygène dans la partie centrale où s’accumulent les déchets catabolique. Selon le protocole fourni ici permettra à la génération d’un organotypique fiable et reproductible modèle de peau humaine de pleine épaisseur avec incorporé des sphéroïdes de mélanome humain qui imitent les métastases de mélanome humain peau. Les applications de ce modèle inclure épreuves, dépistage des toxines, influencent des cosmétiques composés ou thérapie sur l’excroissance des mélanomes et le traitement au laser.

Figure 1
Figure 1 : Culture organotypique 3D peau reconstruit submergé avec support et à l’interface air-liquide. Au jour 0 kératinocytes primaires sont ensemencées au-dessus du compartiment cutané consistant en des fibroblastes primaires intégrés dans un collagène de type j’ai matrice. Reconstruit de peau 3D rester cultivés submergés avec EGM pendant 7 jours, se détacher de la paroi de l’insert et début de rétrécissement. Au jour 8 les inserts sont transférés au 6-puits et cultivés à l’interface air-liquide pour permettre de stratification épidermique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Sphéroïdes mélanome incorporés dans le compartiment dermique apparaissent comme des taches blanches. Tout en préparant le compartiment dermique de la reconstruction de peau 3D, un nombre défini de sphéroïdes mélanome peut être ajouté au type fibroblastes collagène que je mélange. Une fois le gel dermique est retombée, sphéroïdes mélanome deviennent visibles sous forme de taches blanches.

Figure 3
Figure 3 : Schéma de construction de modèle de peau 3D organotypique. Éliminer le tissu adipeux de l’échantillon de peau et le couper en petits morceaux. L’incubation avec une solution a toute la nuit à 4 ° C facilite la séparation de l’épiderme du derme. Kératinocytes et des fibroblastes primaires isolés devraient être cultivées séparément et utilisées entre passage 4-6 et 3 et 4, respectivement. Par la suite, la génération du modèle 3D de la peau peut procéder comme décrit dans le protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : 3D organotypique peau reconstruit montrent un niveau de différenciation similaire à la peau humaine normale. Sections d’équivalents de peau de paraffine (A) (B) par rapport à la normale sur la peau de l’homme ont été colorés pour l’expression de la kératine 14 (rouge : λex 554 nm, λem 568 nm) et 10, involucrin (vert : λex 490 nm, λem 525 nm ), filaggrine (vert : λex 490 nm, λem 525 nm) et à la laminine 5 (vert : λex 490 nm, λem 525 nm) et analysées avec un microscope confocal fluorescence. Noyaux cellulaires ont été visualisées par coloration au DAPI (bleu : λex 340 nm, λem 488 nm). Examen immunohistochimique de la 3D pleine épaisseur de la peau équivalents révélée correcte épidermiques stratification formant des couches distinctes de l’épiderme, comme on le voit dans la peau humaine normale. Alors que les cellules des couches épidermiques inférieures teint positifs pour la kératine 14, plus des cellules différenciées de la couche basale précité a montré la kératine 10 et involucrin coloration. Cellules hautement différenciées à proximité de la filaggrine stratum corneum exprimé. Coloration de la laminine 5 montre qu’une lame basale est générée pour connecter physiologiquement l’épiderme au compartiment par voie cutanée (panneau le plus bas). Ce chiffre a été pris de Voersmann et al. 15 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Le nombre et la taille des nids de mélanome spontanément formé ne peut pas être prédite. Formation de nid de mélanome de novo dans le compartiment cutanée de pleine peau équivalents peuvent être réalisés en mélangeant un nombre défini de mélanome cellules avec des fibroblastes primaires pour incorporer les deux types de cellules dans le collagène de type I matrice. Le nombre et la taille des nids de mélanome spontanément formé peuvent seulement être analysés d’a reconstruire la peau 3D mature après environ 21 jours. Tel que représenté de deux échantillons (A) et (B), le nombre et la taille de la niche du mélanome peut varier entre chaque peau reconstruit. En conséquence, il est difficile de valider ces modèles et de prédire l’impact thérapeutique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Sphéroïdes mélanome intégrés équivalents peau récapitulent les caractéristiques principales de la métastase de mélanome humain. H & E paraffine coupes des sphéroïdes de tumeur incorporés en équivalents de peau colorées ont révélé des sphéroïdes à partager les caractéristiques principales avec métastases non vascularisé de mélanome cutané humain in vivo. Deux sous-populations de cellules sont clairement perceptibles : une sous-population de vie périphérique et centrale sous-population composé majoritairement de ratatinée, apoptose ou cellules nécrotiques, formant le centre « nécrosé ». Cette répartition des sous-populations de cellules de tumeur est garantie par la taille de sphéroïde. Ce chiffre a été modifié par Voersmann et al. 15 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le modèle de peau de sphéroïde mélanome d’organotypique introduit ici garantit des nouvelles perspectives pour une meilleure compréhension de l’intra-tumorale et l’interaction hôte-tumeur et peut fournir une plate-forme avancée de dépistage afin d’étudier les mécanismes moléculaires du développement de la tumeur et résistance à la thérapie à l’avenir.

Pour garantir le meilleur physiologique et en vivo imitant les conditions de peau reconstruit, la qualité des cellules primaires est d’une importance capitale. Comme indiqué ci-dessus, les cellules de peau juvénile ou pré-natal montrent le grade le plus bas de la différenciation et sont donc mieux adaptés générer des équivalents de pleine épaisseur de peau. Le premier contrôle de qualité possible est l’ampleur de la contraction dermique à jour 2 après l’ensemencement les kératinocytes et d’équilibration du gel d’EGM (sections 8.2 et 8.3 de protocole). Gel dermique se contractera le plus avec la meilleure qualité des fibroblastes. En outre, l’intégration des fibroblastes trop peu ou trop de risqueraient de contraction cutanée et, par conséquent, l’attachement de l’épiderme au compartiment par voie cutanée. Cela sera à son tour compromettre la différenciation épidermique, parce que ce processus exige une vaste Diaphonie entre les cellules dermiques et épidermiques.

La qualité des cellules primaires également critique dépend de la confluence de la cellule ainsi que le passage des cellules. Si les kératinocytes sont cultivés à ≥80 % confluence ils immédiatement arrêter la prolifération et commencent à se différencier. Il est donc important pour leur culture à la confluence de 40 à 70 % pendant le passage et les utiliser pas plus tard que le passage de 3-4. Les fibroblastes sont moins sensibles, mais ne doivent pas être utilisés plus tard que le passage de 4 à 6. Notez également que toutes les piles et les lignées cellulaires utilisées pour générer des modèles de peau sphéroïde organotypique mélanome sont cultivées sans antibiotiques, et par conséquent le risque de contamination est élevé. Toutefois, l’ajout d’antibiotiques modifie la physiologie des cellules individuelles et donc réduit la qualité de l’équivalent de la peau.

En général, la formation de tumeurs sphéroïde est possible de presque toutes les sortes de lignées cellulaires tumorales et de cellules tumorales fraîchement isolées de patient matériel. Le temps de nombre et/ou de culture cellulaire initial pour obtenir les tailles de sphéroïde optimale peut varier selon le type de cellule utilisé. Jusqu'à une taille de 150 à 200 µm, toutes les cellules incluses dans un sphéroïde peuvent encore être suffisamment fournis avec nutriments par simple diffusion. Seulement les sphéroïdes avec tailles ≥500 µm montrent un fort degré de différenciation cellulaire et représentent des caractéristiques typiques de tissu de tumeur non vascularisé22.

L’organotypique mélanome-ellipsoïde-peau-modèle développé ici est particulièrement adapté pour l’étude des interactions hôte-tumeur et mélanome dépistage des drogues sous in vivo-comme des conditions15. Pourtant, l’environnement de mélanome in vivo est encore plus complexe, comportant une variété de types de cellules tumorales associées, y compris les cellules immunitaires et les cellules endothéliales. Étant donné que l’ajout de cellules immunitaires primaires adéquats fait face à des problèmes avec l’histocompatibilité, ces modèles ne sont pas encore en mesure de surveiller adéquatement les approches thérapeutiques immunitaire.

Néanmoins, sphéroïdes mélanome peuvent être générés de matériel fraîchement isolée de patients et une fois que fut intégrée à la reconstruction de la pleine peau, peut servir de médicament dépistage plates-formes. Même l’intégration des pièces de la métastase de mélanome peau reconstruit est concevable pour tester les combinaisons de médicaments dans une approche thérapeutique adaptée. Y compris le modèle organotypique de la peau sans mélanome 3D en essais précliniques sont susceptible d’aider à assurer que seulement les nouveaux concepts thérapeutiques plus prometteurs soient prises vers l’avant en essais cliniques, réduisant ainsi le taux d’attrition des nouveaux traitements potentiels pour cette maladie et en augmentant le taux de succès thérapeutique dans les essais cliniques.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Hanna Voersmann pour établir le mélanome sphéroïde-peau-modèle organotypique 3D et fournissant les protocoles excellents. Les auteurs remercient également Silke Busch pour le précieux soutien technique. Le travaux ont été subventionnés par le BMBF e : programme Med « Sensibilité de mélanome » 031A423A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal serum albumin (FCS) Thermo Fisher Scientific 10270106 add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 1X dilute in PBS
RPMI Thermo Fisher Scientific 61870010 for cultivation of melanoma cell lines
DMEM  Thermo Fisher Scientific 41965062 for cultivation of primary fibroblasts
Dispase Gibco life technologies  17105041 2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I BD Biosciences 354249 usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon  Nunc 140629 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer BD Falcon 352360 yellow
Gentamycine Thermo Fisher Scientific 15750060 dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium Cell Systems do not add FCS or antibiotics
Collagenase SERVA 17454 NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes Cell Systems FC-0007 alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts Cell Systems FC-0001 alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM
[+] 4,5 g/l Glucose,
[+] L- Glutamine,
[-] L- Pyruvate		 Gibco life technologies 41965 mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine Gibco life technologies  21765-029 add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF  Gibco life technologies  13247-051 add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride Merck Chemicals 2381 add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid Alfa Aesar 18851 add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin Lilly HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine Sigma-Aldrich  E-0135 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine Sigma-Aldrich P-0503 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine Sigma-Aldrich  T-0665 add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine Sigma-Aldrich T-6397 add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-088816 add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone Sigma-Aldrich P-8783 add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes Sigma-Aldrich H-3784 add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine Sigma-Aldrich S-4311 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride Sigma-Aldrich  C-7017 add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS Sigma-Aldrich F-0392 Lot 086K0361 add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine Sigma-Aldrich  A-9795 add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine PromoCell C-42209 add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride Sigma-Aldrich 255521 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody Dako M7002 1:50
anti cytokeratin 14 antibody Santa Cruz sc-53253 1:200
 anti laminin 5 antibody Santa Cruz sc-32794 1:50
anti filaggrin antibody Thermo Fisher Scientific MA5-13440 1:50
anti involucrin antibody Acris Antibodies AM33368PU 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled LifeSpan Biosciences LS-C153907 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled Jackson Immuno Research 115-165-003 1:1000
DAPI Sigma-Aldrich 10236276001 1:100

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Un modèle de peau 3D organotypique mélanome sphéroïde
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Müller, I., Kulms, D. A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model. J. Vis. Exp. (135), e57500, doi:10.3791/57500 (2018).

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