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Cancer Research

एक ३डी Organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति स्किन मॉडेल

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57500
Automatic Translation
1, 1
1Experimental Dermatology, Medical Faculty, TU-Dresden

Summary

यहां, हम एक 3 डी organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति त्वचा मॉडल है कि recapitulates वास्तुकला और एक अंग की कोशिकीय जटिलता/ vivo में एक ही समय में व्यवस्थित प्रयोगात्मक समायोजित करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश हस्तक्षेप.

Abstract

melanocytes के घातक परिवर्तन, मानव त्वचा की वर्णक कोशिकाओं, मेलेनोमा के गठन का कारण बनता है, वृद्धि हुई मेटास्टेटिक क्षमता के साथ एक अत्यधिक आक्रामक कैंसर. हाल ही में, मोनो chemotherapies लक्षित कळेनासे अवरोधकों के साथ मेलेनोमा विशिष्ट संयोजन चिकित्सा द्वारा सुधार करने के लिए जारी. फिर भी, मेटास्टेटिक मेलेनोमा एक जीवन खतरा रोग रहता है, क्योंकि ट्यूमर प्राथमिक प्रतिरोध प्रदर्शन या उपंयास चिकित्सा के लिए प्रतिरोध का विकास, जिससे tumorigenic क्षमता पुनः प्राप्त । आदेश में घातक मेलेनोमा की चिकित्सीय सफलता में सुधार करने के लिए, पारंपरिक उपचार दृष्टिकोण के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान आणविक तंत्र का निर्धारण आवश्यक है; हालांकि, इसके लिए इन विट्रो मॉडल में इनोवेटिव सेलुलर की आवश्यकता है । यहां, हम एक इन विट्रो तीन आयामी (3 डी) organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति मॉडल है कि घातक मेलेनोमा के vivo में वास्तुकला चित्रित कर सकते है और अंतर ट्यूमर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर मेजबान बातचीत में नई अंतर्दृष्टि वारंट हो सकता है परिचय । मॉडल एक 3 डी मानव पूर्ण त्वचा पुनर्निर्माण प्राथमिक त्वचा कोशिकाओं से मिलकर मॉडल में परिपक्व और विभेदित मेलेनोमा spheroids की संख्या निर्धारित शामिल हैं । सेलुलर संरचना और एंबेडेड मेलेनोमा spheroids के भेदभाव की स्थिति में त्वचा के मेलेनोमा मेटास्टेसिस में से एक के समान है vivo। एक दवा स्क्रीनिंग मंच के रूप में इस organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति मॉडल का उपयोग कर चयनित संयोजन चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया करने वालों की पहचान का समर्थन कर सकते हैं, जबकि गैर के लिए अनावश्यक उपचार बोझ बख्शते-प्रतिक्रिया, जिससे लाभ में वृद्धि चिकित्सीय हस्तक्षेप ।

Introduction

मानव त्वचा दो अलग डिब्बों कि प्रतिकूल पर्यावरणीय प्रभाव1से शरीर की रक्षा में विभिंन कार्यों की सेवा से बना है । कम चमड़े का डिब्बा एक fibro-लोचदार संयोजी ऊतक के होते हैं । यह ढीला जुड़ा कोलेजन और elastin fibroblasts द्वारा संश्लेषित फाइबर से बना है, एक यांत्रिक बाधा समारोह की सेवा । dermis ऊपरी एपिडर्मिस से बेसल लेमिना जो दोनों त्वचा डिब्बों के बीच एक निरंतर संचार के कारण एक extracellular मैट्रिक्स के रूप में उत्पादित है द्वारा अलग है । dermis के विपरीत, एपिडर्मिस एक स्क्वैमस उपकला है जो मुख्य रूप से keratinocytes के होते हैं और चार परतों में विभेदित किया जा सकता है. परत बेसल विभेदक बेसल keratinocytes जो लगातार परत spinosum और परत granulosum में परत corneum के चरणों के माध्यम से त्वचा जनक कोशिकाओं से प्राप्त stratifying के होते हैं निर्जलीकरण और संक्रमण से शरीर को बचाने के लिए2। Melanocytes बेसल झिल्ली पर गठबंधन कर रहे हैं, और कई keratinocytes के साथ वृक्ष एक्सटेंशन के माध्यम से संवाद । वे त्वचा मेलेनिन का उत्पादन पराबैंगनी विकिरण के प्रतिकूल प्रभाव से त्वचा के ऊतकों की रक्षा, उंर बढ़ने, प्रतिरक्षादमन, सूजन, और गैर की प्रेरण-मेलेनोमा त्वचा कैंसर की तरह । यूवी विकिरण घातक मेलेनोमा को melanocytes के परिवर्तन के लिए योगदान है, तथापि, अभी भी बहस के अंतर्गत है3।

मेलेनोमा विकास अलग ट्यूमर प्रगति चरणों में विभेदित है, और कुछ आनुवंशिक, सुघड़ द्वारा विशेषता है, और histologic परिवर्तन4। वे या तो de नोवो या एक जंमजात या प्राप्त nevus melanocyte प्रसार के एक स्थानीय वृद्धि के कारण सौम्य neoplasia पैदा करने से उत्पंन । यह अग्रदूत घाव संरचनात्मक रूप से संशोधित dysplastic ऊतक atypic कोशिकाओं है, जो पहले घातक चरण, रेडियल विकास चरण (RGP) के लिए जारी रख सकते हैं युक्त में बदल सकते हैं । इस प्रारंभिक ट्यूमर प्रगति चरण एपिडर्मिस के भीतर रेडियल proliferating कोशिकाओं की विशेषता है, इल्लों dermis के भीतर कुछ स्थानीय रूप से इनवेसिव कोशिकाओं दिखा । बाद ऊर्ध्वाधर वृद्धि चरण (वीजीपी) मेलेनोमा कोशिकाओं के दौरान पहले से ही एक मेटास्टेटिक और इनवेसिव phenotype बेसल लेमिना के माध्यम से तोड़ने के लिए dermis के गहरे भागों के रूप में अच्छी तरह से चमड़े के नीचे ऊतक5घुसपैठ के द्वारा दिखा । अंत में, मेटास्टेटिक मेलेनोमा (मिमी) मेटास्टेटिक कोशिकाओं के साथ सबसे आक्रामक प्रगति चरण का प्रतिनिधित्व करता है प्रणालीबद्ध रक्त और लिम्फ प्रणाली में फैल जिगर, फेफड़े, और मस्तिष्क की तरह लंबे अंगों पर आक्रमण करने के लिए6।

तारीख करने के लिए, जल्दी निदान सर्जरी के बाद अभी भी घातक मेलेनोमा की सबसे प्रभावी चिकित्सा बनी हुई है । दूर मेटास्टेसिस के साथ रोगियों के लिए पूर्वानुमान, तथापि, विशेष रूप से गरीब7रहता है, क्योंकि शास्त्रीय रसायन चिकित्सा परहेजों केवल थोड़ा उत्तरजीविता लाभ8,9प्रदान करते हैं । हालांकि, ठहराव के दशकों के बाद, लक्षित चिकित्सा में हाल के अग्रिमों काफी घातक मेलेनोमा के पूर्वानुमान में सुधार हुआ है ।

Dysregulation के दो प्रमुख mitogen सक्रिय मार्ग, रास-आरएएफ-खल्क-ERK और PI3K-एकेटी-PTEN सिग्नलिंग मार्ग, वर्तमान प्रमुख ड्राइवरों की मेलेनोमा प्रगति, विशेष रूप से जब constitutively आद्य oncogenes BRAFV600 के बिंदु उत्परिवर्तन को सक्रिय करने और NRAS१०उपस्थित होते. तदनुसार, लक्षित कळेनासे अवरोधकों के आविष्कार मेटास्टेटिक मेलेनोमा से पीड़ित रोगियों के लिए चिकित्सीय लाभ का वादा किया । इस बिंदु के लिए आयोजित नैदानिक परीक्षणों के एक भीड़ मेटास्टेटिक मेलेनोमा के साथ रोगियों के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्राप्त नहीं किया है । लगभग सभी प्रतिक्रियाओं प्राथमिक प्रतिरोध दिखा रोगियों की एक उपजनसंख्या के साथ आंशिक, कर रहे हैं । इसके अलावा, माध्यमिक पतन के लिए अग्रणी प्रतिरोध के अधिग्रहण रोगियों के बहुमत में मनाया गया था11,12।

यह स्पष्ट हो जाता है कि उत्परिवर्तन स्थिति का विश्लेषण अकेले सबसे शक्तिशाली चिकित्सीय रणनीति विकसित करने के लिए पर्याप्त नहीं है । नई तेजी से और विश्वसनीय नैदानिक उपकरण व्यवस्थित रिकॉर्ड और व्यक्तिगत कैंसर कोशिकाओं की जवाबदेही का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हैं । मानव मेलेनोमा पर वर्तमान में उपलब्ध डेटा के विशाल बहुमत दो आयामी (2d) मेलेनोमा सेल संस्कृतियों से प्राप्त किया गया है । ट्यूमर कोशिकाओं, तथापि, 3 डी में हो विभेदित कैंसर कोशिका उपआबादी के बीच और साथ ही कैंसर की कोशिकाओं और गैर के बीच सेलुलर crosstalk की अनुमति के आसपास के मेजबान ऊतक बदल दिया । इसलिए, यह 3 डी वातावरण में विकसित मेलेनोमा, एक नैदानिक स्क्रीनिंग मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए13,14का पुनर्निर्माण करने के लिए सबसे अच्छा होगा ।

Protocol

सभी मानव ऊतक काम अनुमोदित संस्थागत प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था ।

1. Dermis और एपिडर्मिस की मानव त्वचा से जुदाई (किशोर चमड़ी खतना से)

  1. चमड़ी (आम तौर पर 1-2cm2) एक गैर चिपकने वाले बाँझ सेल संस्कृति पकवान (Ø 10 सेमी) में प्लेस और यह फॉस्फेट बफर खारा के 10-12 मिलीलीटरके साथ कवर + (पंजाब, ०.५ मिमी MgCl2, ०.९ मिमी CaCl2, पीएच ७.२ = पंजाब+). बाँझ स्केलपेल और संदंश का उपयोग कर सभी अतिरिक्त (वसा) ऊतक निकालें.
  2. 3 मिमी x 5 मिमी टुकड़ों में त्वचा कट, उंहें पंजाबियों के साथ धोने, और उंहें एक गैर चिपकने वाला बाँझ सेल संस्कृति पकवान (Ø 6 सेमी) के लिए स्थानांतरण । dispase समाधान के 5-7 मिलीलीटर के साथ ऊतक के टुकड़ों को कवर (2 यू/ 4 ° c पर 16 घंटे के लिए आयल फिल्म और मशीन के साथ सेल संस्कृति डिश सील ।
  3. अधययन के भाग से एपिडर्मल को दो बाँझ संदंश के साथ वापस लेना । अलग गैर चिपकने वाला सेल संस्कृति व्यंजन (Ø 6 सेमी) के लिए विच्छेदित ऊतक टुकड़े हस्तांतरण और पंजाबियों के साथ उनमें से प्रत्येक को कवर+।

2. एपिडर्मिस से प्राथमिक Keratinocytes का अलगाव

  1. ध्यान से पंजाब+ एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर सेल संस्कृति पकवान से हटा दें और एपिडर्मल ऊतक टुकड़े (धारा १.३) पंजाबियों के साथ धोने । एपिडर्मिस को छोटे टुकड़ों (1 mm2) में काटें और उंहें ५०-mL शंकु ट्यूब में एकत्र करें । 10 मिलीलीटर 1x Trypsin-EDTA जोड़ें (३७ डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में 5 मिनट के लिए मशीन । भंवर ऊतक निलंबन हर 2 मिनट ।
  2. 1 मिलीलीटर भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) जोड़कर एंजाइमी प्रतिक्रिया बंद करो । एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक पिपेट के साथ 4 मिनट के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं reसस्पेंड. बुलबुले और फोम गठन से बचने के लिए प्रयास करें ।
  3. प्लास्टिक एक सेल छलनी में सेल निलंबन (ताकना आकार १०० µm), एक ताजा ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के शीर्ष पर रखा, और 5 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ 3x कुल्ला । 5 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । 1% (v/v) गेन्तमयसीं से युक्त 2-6 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में सेल गोली reसस्पेंड । कक्ष संख्या मैन्युअल रूप से एक hemocytometer और बीज 6 x 105 कक्षों में एक T75 कक्ष संस्कृति कुप्पी में कक्षों की गणना करके निर्धारित करें ।

3. प्राथमिक Keratinocytes की खेती

  1. एक सेल मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 में FCS के बिना keratinocyte माध्यम में चरण २.३ में पृथक प्राथमिक keratinocytes, ५०-७०% प्रवाह ।
  2. keratinocytes ध्यान से पारित करने के लिए मध्यम, 5 मिलीलीटर पंजाबियों-EDTA जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । अगर कोशिकाओं को संस्कृति कुप्पी से एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अलग करने के लिए शुरू कर दिया है की जाँच करें (4x बढ़ाई: कोशिकाओं गोल दिखाई देगा, लेकिन अभी भी संलग्न हैं!). यदि नहीं, तो पुराने पंजाबियों-EDTA के साथ ताजा पंजाब-EDTA और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक और 10 मिनट के लिए फिर से गर्मी की जगह ।
  3. अभी भी 10 मिलीलीटर पंजाब-EDTA और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1-3 मिनट के लिए उन्हें फिर से गर्मी के साथ कवर किया गोल कोशिकाओं के लिए 5 मिलीलीटर 1x Trypsin-EDTA जोड़ें । 1 मिलीलीटर FCS जोड़कर एंजाइमी प्रतिक्रिया रोकें और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अलग कोशिकाओं को इकट्ठा । 5 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, keratinocyte माध्यम में गोली reसस्पेंड, और बीज 6 x 10 एक ताजा T75 सेल संस्कृति कुप्पी में5 कोशिकाओं ।
    नोट: organotypic त्वचा को खंगाला उत्पंन करने के लिए, प्राथमिक keratinocytes कोई बाद में पारित 3-4 से इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

4. Dermis से प्राथमिक Fibroblasts का अलगाव

  1. चमड़े के ऊतकों (धारा १.३) को छोटे टुकड़ों (1 mm2) में काटें और उंहें ५०-एमएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें । 10 मिलीलीटर collagenase-समाधान जोड़ें (5/पंजाब में एमएल+) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ४५ मिनट के लिए मशीन । 5 मिनट के लिए २०० x g पर ऊतक टुकड़े और कोशिकाओं के मिश्रण केंद्रापसारक ।
  2. ४.५ g/l ग्लूकोज और l-Glutamine युक्त 10 मिलीलीटर DMEM के साथ दो बार सेल गोली धो लें, लेकिन एल-पाइरूवेट के बिना । अंत में 1% (v/v) गेन्तमयसीं और 10% FCS युक्त DMEM के 2 मिलीलीटर में ऊतक टुकड़े reसस्पेंड । उंहें एक T25 सेल संस्कृति कुप्पी में स्थानांतरण और उंहें एक सेल मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 रातोंरात में गर्मी ।
    नोट: छोटी मात्रा fibroblasts ऊतक-मलबे से बाहर माइग्रेट करने के लिए अनुमति देता है और उन्हें संस्कृति कुप्पी करने के लिए संलग्न करने के लिए बाध्य करता है.
  3. अगली सुबह, एक और 6 मिलीलीटर DMEM/गेन्तमयसीं/FCS और 2-3 दिनों के लिए गर्मी ३७ डिग्री सेल्सियस पर जब तक कोशिकाओं ८०-९०% तक पहुंच गया है जोड़ें ।

5. प्राथमिक Fibroblasts की खेती

  1. fibroblasts को बीतने के लिए, मध् यम को निकालें और पंजाबियों के साथ अनुयाई कोशिकाओं को धोएं । 5 एमएल 1x Trypsin जोड़ें-EDTA और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए मशीन ।
  2. 5 मिलीलीटर DMEM/FCS जोड़कर एंजाइमी प्रतिक्रिया रोकें और एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में अलग कोशिकाओं को इकट्ठा । 5 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, DMEM माध्यम में गोली reसस्पेंड, और बीज 6 x 10 एक ताजा T75 सेल संस्कृति कुप्पी में5 कोशिकाओं ।
    नोट: organotypic त्वचा को खंगाला उत्पंन करने के लिए, प्राथमिक fibroblasts कोई बाद में पारित 4-6 से इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

6. फांसी छोड़ विधि के माध्यम से 3d मेलेनोमा Spheroids की जनरेशन

  1. संस्कृति मेलेनोमा कोशिकाओं (जैसे, ४५१-LU, या ब्याज की किसी भी मेलेनोमा सेल लाइन) सामान्य प्रोटोकॉल के अनुसार, RPMI का उपयोग कर 10% FCS15.
    1. इसी तरह के आकार और गुणवत्ता के मेलेनोमा spheroids उत्पंन करने के लिए, पंजाब में मेलेनोमा कोशिकाओं को धो, एक EDTA सेल संस्कृति कुप्पी में कोशिकाओं को पंजाब में 1x Trypsin-T175 के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और कमरे के तापमान (आरटी) में 3-5 मिनट के लिए मशीन । 5 मिलीलीटर RPMI/10% FCS जोड़कर Trypsin बेअसर । फसल २०० में 5 मिनट के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं RPMI/FCS में सेल गोली निलंबित १०,००० कोशिकाओं के एक अंतिम एकाग्रता/एमएल के रूप में एक hemocytometer में गिनती द्वारा निर्धारित ।
  2. स्पॉट ४० x 25 µ एल (= २५० कोशिकाओं) एक बाँझ गैर चिपकने वाला कोशिका संस्कृति पकवान (Ø 10 सेमी) एक इलेक्ट्रॉनिक बहु-पिपेट का उपयोग कर के ढक्कन की भीतरी सतह पर सेल निलंबन की. एक तेजी से लेकिन चिकनी आंदोलन के साथ, चारों ओर ढक्कन बारी और 5 मिलीलीटर पंजाबियों से युक्त संबंधित सेल संस्कृति पकवान पर जगह है ।
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सेल मशीन में संस्कृति "फांसी छोड़ व्यंजन" और 5% सह2 10-14 दिनों के लिए, उपयोग किए गए कक्ष प्रकार पर निर्भर करता है ।
      नोट: मिमी वृद्धि चरण से कोशिकाओं को आम तौर पर तेजी से बढ़ने और RGP या वीजीपी से व्युत्पंन मेलेनोमा कोशिकाओं की तुलना में हैंगिंग ड्रॉप में और अधिक ठोस spheroids के रूप में । व्यक्तिगत मूल्यांकन के लिए, दूरबीन की एक जोड़ी के तहत या एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (4x बढ़ाई) के तहत अंडाकार आकृति विकास का निरीक्षण । आमतौर पर, spheroids दूरबीन की एक जोड़ी के तहत या एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (4x इज़ाफ़ा) के तहत ४८ ज के बाद detectable हो जाते हैं । 10-14 दिनों के बाद, वे किसी भी इज़ाफ़ा डिवाइस के बिना दिखाई दे रहे हैं ।
  3. 5 दिन बाद आरंभिक ड्रॉप खोलना, प्रत्येक ड्रॉप करने के लिए 10% FCS माध्यम ताजा RPMI/10% के µ एल जोड़ें । बाद में, विनिमय 10 µ हर दूसरे दिन के एल । एक इलेक्ट्रॉनिक मशीन का उपयोग इस कदम में बहुत उपयोगी है ।
  4. सेल के प्रकार पर निर्भर करता है, फसल spheroids (विवरण के लिए धारा 10 देखें) के बाद धीरे से उंहें बंद कर पंजाब के साथ सेल संस्कृति पकवान ढक्कन धोने द्वारा 10-15 दिन । उंहें एक ताजा गैर चिपकने वाला सेल संस्कृति पकवान में ले लीजिए ।
    नोट: खेती की अवधि मेलेनोमा कोशिकाओं के ट्यूमर के विकास के चरण पर निर्भर करता है जब वे शुरू में व्युत्पंन थे, जैसे, spheroids ४५१-LU कोशिकाओं से व्युत्पंन में संवर्धन के 12 दिनों के भीतर व्यास में लगभग ५०० µm को बढ़ने छोड़15 .

7. Organotypic पूर्ण त्वचा के चमड़े के डिब्बे के उत्पादन को खंगाला

  1. 24-खैर सेल सूक्ष्मदर्शी झिल्ली आवेषण (ताकना आकार 8 µm) 24 अच्छी तरह से प्लेटों में रखा का उपयोग कर त्वचा मॉडल उत्पन्न करें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि फांसी का इस्तेमाल नहीं बल्कि आवेषण खड़े, क्योंकि वे एक बाद में मंच पर हवा तरल की खेती के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली में रखा जाएगा ।
  2. जेल बेअसर समाधान (GNL)15तैयार है, साथ ही संस्कृति मीडिया मिमी और endothelial विकास मीडिया (ईजीएम)16,17के रूप में करने के लिए भेजा । जमावट को रोकने के लिए, की दुकान कोलेजन प्रकार मैं (आमतौर पर चूहे की पूंछ से, ३.५-4 मिलीग्राम/एमएल में ०.०२ एन एसिटिक एसिड) बर्फ पर उपयोग तक, क्योंकि यह आर टी पर जेल के लिए शुरू होता है ।
  3. फिर से निलंबित 1 एक्स 105 fibroblasts में डालने के प्रति GNL और जल्दी से ५०० µ एल के एक अंतिम मात्रा में 1:3 के अनुपात में कोलेजन के साथ सेल निलंबन मिश्रण/ मिश्रण धीरे pipetting ऊपर और नीचे बुलबुले के गठन से बचने के लिए के रूप में बुलबुला त्वचा की गुणवत्ता ख़राब हो सकता है पुनर्निर्माण ।
  4. एक बाँझ डाकू में 30 मिनट के लिए आर टी पर मध्यम के बिना उन्हें रखने के द्वारा व्यवस्थित करने के लिए व्यक्तिगत चमड़े का जैल अनुमति दें । बाद में ४.५ g/L ग्लूकोज, 1% l-glutamine, 10% FCS, और बिना l-पाइरूवेट युक्त DMEM के साथ प्रत्येक जेल कवर, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।

8. Organotypic पूर्ण त्वचा के एपिडर्मल डिब्बे की पीढ़ी को खंगाला

  1. अगले दिन चमड़े का जैल से मध्यम निकालें और उंहें ईजीएम मीडिया (10% FCS, 1% PenStrep, 10 मिलीग्राम/एमएल gentamicin) के साथ 2 एच ३७ डिग्री सेल्सियस पर equilibrate । मध्यम और सावधानीपूर्वक बीज को वापस लें 1 x 105 keratinocytes को १०० µ l ईजीएम में रिसस्पेंड कर द अधययन जेल के ऊपर ।
  2. keratinocytes को चमड़े का डिब्बा का पालन करने की अनुमति देने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर १.५ ज के लिए पुनर्निर्माण की मशीन ।
    नोट: इस मशीन समय के दौरान, जैल fibroblast प्रेरित संकुचन के कारण हटना करने के लिए शुरू कर देंगे, और इस प्रकार, कम से आंशिक रूप से डालने की दीवारों से अलग.
  3. कवर त्वचा के समकक्ष के साथ लगभग ८०० µ l ईजीएम और ध्यान से हटाने की दीवार से अवशिष्ट जेल के साथ एक छोटी (सफेद) पिपेट टिप । संस्कृति त्वचा समकक्ष ईजीएम में 7 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2पर एक सेल मशीन में डूबे, और मध्यम हर दूसरे दिन बदल जाते हैं ।
    नोट: इस समय के दौरान त्वचा समकक्ष काफी सिकुड़ जाएगा ।

9. Organotypic पूर्ण त्वचा की वायु-तरल खेती को खंगाला

  1. 8 दिन में, एक 6-अच्छी तरह से थाली के एक व्यक्ति में प्रत्येक डालने स्थानांतरण । केवल एक अच्छी तरह से मिमी मध्यम के १.२-१.४ मिलीलीटर जोड़ें, ताकि त्वचा के पुनर्निर्माण के माध्यम से अच्छी तरह से नीचे से आपूर्ति की है, लेकिन मध्यम के साथ कवर नहीं है ।
    नोट: हवा में खेती-तरल अंतरफलक एपिडर्मल भाग और एक पूर्ण cornified परत की स्थापना की स्तरीकरण की अनुमति देता है (परतcorneum) ।
  2. अगले 10-17 दिनों के दौरान, हर दूसरे दिन धारा ९.१ में कहा गया के रूप में माध्यम बदल जाते हैं । इस अवधि के दौरान, दवाओं या अंय उत्तेजनाओं को मध्यम से आवश्यकतानुसार जोड़ें । ध्यान से पूरी त्वचा को दूर सूक्ष्मदर्शी झिल्ली डालने से पुनर्निर्माण आगे विश्लेषण के लिए घुमावदार चिमटी का प्रयोग, उदा, immunohistochemical विश्लेषण (चित्रा 1) ।

10. Organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति त्वचा मॉडल की जनरेशन

  1. organotypic पूर्ण त्वचा के चमड़े का डिब्बा में मेलेनोमा spheroids को एकीकृत करने के लिए, ध्यान से spheroids (कदम ६.४ के बाद) पंजाबियों के साथ छोड़ सेल संस्कृति पकवान फांसी के ढक्कन से कुल्ला । इकट्ठा 10-20 spheroids/एक बाँझ गैर चिपकने वाला सेल संस्कृति पकवान में डालें । ध्यान से एक पाश्चर पिपेट के साथ अत्यधिक पंजाबियों को हटा दें ।
  2. महाप्राण में spheroids को ईजीएम की सबसे छोटी मात्रा में संभव है । इस बिंदु पर निरीक्षण और नग्न आंखों के साथ spheroids गिनती, किसी भी आगे इज़ाफ़ा डिवाइस के बिना । लो 10-20 spheroids प्रति त्वचा मॉडल/जेल, जैसा कि चरण १०.१ में कहा गया है ।
  3. fibroblasts युक्त GNL की इच्छित मात्रा के लिए उंहें स्थानांतरण (७.३ कदम के दौरान), और कोलेजन प्रकार मैं के साथ मिश्रण । ७.३-९.१ अनुभागों में वर्णित के रूप में आगे बढ़ने पर इस चरण से ।
    नोट: ट्यूमर spheroids सफेद धब्बे (चित्रा 2) के रूप में चमड़े का जेल में दिखाई बन

Representative Results

मेलेनोमा मेटास्टेसिस के सफल उपचार ट्यूमर कोशिकाओं के बीच पार बात के साथ ही ट्यूमर और गैर बदल मेजबान कोशिकाओं के बीच से प्रभावित किया जा सकता है । इन विट्रो में कैंसर के organotypic मॉडल विकसित करने के उद्देश्य से vivo में 3 डी संगठन और मानव मेलेनोमा की जटिलता दोहराऊंगा कि उपयुक्त नैदानिक परीक्षण प्रणालियों प्रदान करना है । यह एक organotypic वातावरण के भीतर ट्यूमर पर उपचारात्मक प्रभाव के अध्ययन और समानांतर में आसपास के प्राथमिक ऊतक पर प्रतिकूल प्रभाव की अनुमति देता है ।

सबसे अच्छा organotypic त्वचा मॉडल विकसित करने के लिए, प्राथमिक कोशिकाओं की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है । यह किशोर प्राथमिक fibroblasts और keratinocytes का उपयोग करने के लिए लाभप्रद है, क्योंकि वे आम तौर पर वयस्क प्राथमिक त्वचा कोशिकाओं की तुलना में कम विभेदित कर रहे हैं । किशोर त्वचा कोशिकाओं या तो किशोर चमड़ी से अलग किया जा सकता है के रूप में प्रोटोकॉल 1-5 वर्गों में वर्णित है, लेकिन यह भी पूर्व प्रसव के प्राथमिक fibroblasts और keratinocytes के रूप में कंपनियों से खरीदा जा सकता है । यदि क्रय, यह विभिंन दाताओं से कोशिकाओं के आदेश के लिए दाता-विशिष्ट परिणामों से बचने के लिए आवश्यक है, जैसे, दवा संवेदनशीलता के लिए । पूरे प्रोटोकॉल चित्रा 3में एक योजना के रूप में प्रदर्शित किया जाता है ।

3 डी पूर्ण त्वचा समकक्ष के गुणवत्ता नियंत्रण immunohistochemical विश्लेषण की आवश्यकता है । एक पहली छाप Hematoxylin-Eosin (एच एंड ई) आयल एंबेडेड वर्गों के धुंधला (3 µm) द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । एपिडर्मल विभेद और dermis और एपिडर्मिस के बीच बेसल लेमिना के गठन की गुणवत्ता का विस्तृत विश्लेषण immunohistochemical एपिडर्मल मार्कर के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर विश्लेषण की आवश्यकता है । यह अंतर के बीच अंतर की अनुमति देता है, उच्च प्रफलन बेसल झिल्ली के करीब स्थित कोशिकाओं और उच्च विभेदित और keratinized कोशिकाओं के बीच में अलग एपिडर्मल परतों के गठन के माध्यम से परत corneum . के रूप में प्रतिरक्षा-ऊतकवैज्ञानिक धुंधला ( चित्रा 4) द्वारा दिखाया गया है, एपिडर्मिस भर keratinocytes के भेदभाव सामांय त्वचा के समान प्राप्त किया जा सकता है: मुख्य रूप से कम एपिडर्मल परतों से विभेदक कोशिकाओं (परत बेसल और परत spinosum) 14 केरातिन के लिए सकारात्मक दाग है, जबकि ऊपर अर्थ का उपसर्ग से अधिक विभेदित कोशिकाओं-बेसल परतों (परत granulosum और परत corneum) केरातिन 10 और involucrin के लिए सकारात्मक दाग । तदनुसार, filaggrin धुंधला ही परत corneumके उच्च विभेदित कोशिकाओं में देखा जा सकता है । सबसे महत्वपूर्ण बात, laminin 5 धुंधला पता चलता है कि एक बेसल लेमिना के लिए शारीरिक रूप से कृत्रिम त्वचा के चमड़े के डिब्बे को एपिडर्मल से कनेक्ट उत्पंन किया गया था पुनर्निर्माण । यह साबित करता है कि एक संवाद organotypic microenvironment मेलेनोमा कोशिकाओं या शारीरिक और pathophysiologic विश्लेषण के लिए spheroids होस्ट करने के लिए उत्पंन किया गया है ।

मेलेनोमा दवा स्क्रीनिंग के प्रयोजन के लिए, एकल मेलेनोमा कोशिकाओं को भी पूर्ण त्वचा समकक्ष के dermis में एकीकृत किया जा सकता है de नोवो मेलेनोमा घोंसला गठन18,19अनुमति देते हैं । इसलिए, मेलेनोमा कोशिकाओं 5:1 के अनुपात में प्राथमिक fibroblasts के साथ संयुक्त कर रहे हैं, 5 मिनट के लिए २०० एक्स जी में एक साथ केंद्रापसारक और GNL में reसस्पैंड करने से पहले कोलेजन के साथ मिश्रण करने के लिए । नतीजतन, मेलेनोमा सेल घोंसले सहज रूप से चमड़े के डिब्बे में फार्म का होगा । हमारे अनुभव के अनुसार, केवल मेटास्टेटिक वृद्धि चरण के कोशिकाओं को उचित घोंसले फार्म, RGP या वीजीपी के मेलेनोमा कोशिकाओं की तुलना में15। मॉडल के इन प्रकार के एक प्रमुख दोष तथ्य यह है कि संख्या और मेलेनोमा का गठन घोंसले के आकार की भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है, और व्यक्तिगत त्वचा के बीच भिंन हो सकते है reconstructs, स्वतंत्र रूप से किसी भी उपचार । उदाहरण के लिए, १,००० कोशिकाओं चमड़े का डिब्बा में वरीयता प्राप्त 10 १०० कोशिकाओं या १०० 10 कोशिकाओं प्रत्येक (चित्रा 5) से मिलकर घोंसले से मिलकर घोंसले का लाभ हो सकता है । इन जीवविज्ञान तीन कमियों के साथ मौजूद चर: पहले, संख्या और मेलेनोमा घोंसले का गठन की आकार अप्रत्याशित हैं; दूसरा, vivo में मेटास्टेसिस आमतौर पर मेलेनोमा घोंसले से बड़े होते हैं और एक अधिक जटिल अंतर ट्यूमर विविधता का प्रदर्शन; और तीसरा, सीमित जीवन के कारण-ट्यूमर-घोंसला मॉडल की अवधि, उपचार जल्दी शुरू की है, और फलस्वरूप बजाय मौजूदा ट्यूमर घोंसले के प्रतिगमन के कारण ट्यूमर के विकास को रोकता है ।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति स्किन मॉडल तैयार किया जा सकता है । द्वारा संवर्धन २५० 14 दिनों के लिए एक फांसी ड्रॉप में मेटास्टेटिक मेलेनोमा कोशिकाओं को20, spheroids व्यवहार्य reproducibly लगभग ५०० मेलेनोमा नकल उतार गैर संवहनी की एक अंतिम व्यास के साथ एक कॉंपैक्ट संरचना पेश कोशिकाओं से मिलकर उत्पंन µm हैं ट्यूमर नोड्स, सूक्ष्म मेटास्टेसिस, या ठोस ट्यूमर के अंतर-केशिका माइक्रो क्षेत्र21,22। सामान्य तौर पर, किसी भी मेलेनोमा सेल लाइन हैंगिंग ड्रॉप विधि के माध्यम से spheroids की पीढ़ी के लिए उपयुक्त है; हालांकि, अधिक उन्नत मेटास्टेटिक ट्यूमर चरणों से व्युत्पन्न कोशिकाओं जल्दी प्रगति चरणों से व्युत्पंन सेल लाइनों की तुलना में अधिक ठोस spheroids फार्म, जैसे, RGP.

कुछ कोशिकाओं के लिए, यह उचित अंडाकार आकृति गठन के लिए लाभप्रद है फांसी छोड़ संस्कृति माध्यम की चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए । यह संस्कृति माध्यम के लिए 10-50% मिथाइल-फाइबर के अलावा द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । मिथाइल-फाइबर स्टॉक समाधान के लिए, आटोक्लेव १.२ g मिथाइल-फाइबर एक साथ १०० मिलीलीटर कांच की बोतल में एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ । १०० मिलीलीटर गरम (६० ° c) मध्यम जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए हलचल, और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक और 1-2 एच । ५,००० x जी में 2 एच के लिए स्टॉक समाधान केंद्रापसारक और 4 डिग्री सेल्सियस पर चिपचिपा supernatant स्टोर का उपयोग करें जब तक ।

पूर्ण त्वचा मेलेनोमा अंडाकार आकृति मॉडल का उचित सत्यापन तथ्य यह है कि मेलेनोमा spheroids की एक परिभाषित संख्या-कम से सांख्यिकीय कर सकते है द्वारा प्रदान की जाती है-चमड़े का fibroblast में एकीकृत किया जा/त्वचा मॉडल निर्माण के दिन 1 पर मैं पाड़ उंहें 25-27 अधिक दिनों के लिए एपिडर्मल भेदभाव के दौरान सह विकसित करने के लिए । spheroids की उपज सीधे बोने के बाद विश्लेषण किया जा सकता है, क्योंकि spheroids पारदर्शी चमड़े का जेल के भीतर सफेद धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं और किसी भी इज़ाफ़ा डिवाइस (चित्रा 2) के बिना देखा जा सकता है । एक परिणाम के रूप में, एक 3 डी त्वचा मॉडल उत्पन्न होता है कि बंदरगाहों परिपक्व मेलेनोमा spheroids, जो लगभग ४२ दिनों की कुल के लिए इन विट्रो में संस्कृति गया था, अंतर के उच्चतम स्तर ट्यूमर कोशिका भेदभाव15दिखा रहा है.

एच एंड ई त्वचा का धुंधला मेलेनोमा अंडाकार आकृति मॉडल मेलेनोमा spheroids के ऊतकवैज्ञानिक रूप और सेलुलर वितरण पता चलता है बहुत गैर के एक-संवहनी मानव मेलेनोमा त्वचा के समान हो मेटास्टेसिस vivoमें 15 ( चित्रा 6 ). मेलेनोमा कोशिकाओं के दो उपजनसंख्या स्पष्ट रूप से इन शर्तों के तहत भेद कर रहे हैं: एक परिधीय proliferating उपजनसंख्या और एक केंद्रीय उपजनसंख्या मुख्य रूप से सिकुड़ा, अपोप्तोटिक या गल कोशिकाओं से मिलकर, तथाकथित "गल" गठन केंद्र. Immunohistochemically रहने और proliferating उपजनसंख्या प्रसार मार्कर KI-६७ के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है, जबकि गल केंद्र की कोशिकाओं TUNEL-दाग15द्वारा visualized किया जा सकता है । ट्यूमर कोशिका उपआबादी के इस विशेष वितरण अंडाकार आकृति आकार (≥ ५०० µm), पोषक तत्वों और केंद्रीय भाग में ऑक्सीजन की कमी से जिसके परिणामस्वरूप catabolic अपशिष्ट जमा द्वारा वारंट है । यहां दिए गए प्रोटोकॉल के बाद एक विश्वसनीय और reproducible organotypic मानव पूर्ण-मोटाई एंबेडेड मानव मेलेनोमा spheroids के साथ त्वचा मॉडल है कि मानव मेलेनोमा त्वचा मेटास्टेसिस नकल की पीढ़ी की अनुमति होगी । इस मॉडल के आवेदन दवा परीक्षण, विषाक्त पदार्थों की स्क्रीनिंग, कॉस्मेटिक यौगिकों या मेलेनोमा वृद्धि पर लेजर थेरेपी के प्रभाव, और उपचार शामिल हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : 3 डी organotypic त्वचा की खेती मध्यम और हवा तरल इंटरफेस पर जलमग्न के साथ खंगाला । दिन में 0 प्राथमिक keratinocytes चमड़े के प्राथमिक fibroblasts से मिलकर एक कोलेजन प्रकार मैं मैट्रिक्स में एंबेडेड डिब्बे के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । 3 डी त्वचा को खंगाला रहने 7 दिनों के लिए ईजीएम के साथ जलमग्न खेती, डालने दीवार से अलग है, और सिकुड़ना शुरू करते हैं । 8 दिन में आवेषण 6 कुओं को हस्तांतरित कर रहे है और हवा में खेती-तरल अंतरफलक एपिडर्मल स्तरीकरण अनुमति देते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : मेलेनोमा spheroids चमड़े के डिब्बे में एंबेडेड सफेद धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं । जबकि 3d त्वचा पुनर्निर्माण के चमड़े के डिब्बे की तैयारी, मेलेनोमा spheroids की एक परिभाषित संख्या fibroblast कोलेजन प्रकार मैं मिश्रण करने के लिए जोड़ा जा सकता है । एक बार चमड़े का जेल बस गया है, मेलेनोमा spheroids सफेद धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं ।

Figure 3
चित्र 3 : 3 डी organotypic त्वचा मॉडल निर्माण की योजना । त्वचा के नमूने से वसा ऊतक निकालें और इसे छोटे टुकड़ों में काट । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर dispase समाधान के साथ मशीन dermis से एपिडर्मिस की जुदाई की सुविधा । पृथक प्राथमिक fibroblasts और keratinocytes अलग से खेती की जानी चाहिए और मार्ग 4-6 और 3-4, क्रमशः के बीच प्रयोग किया जाता है । बाद में, 3 डी त्वचा मॉडल की पीढ़ी के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित आगे बढ़ना कर सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : 3d organotypic त्वचा को खंगाला एक भिंनता सामांय मानव त्वचा के समान स्तर दिखाते हैं । त्वचा के बराबर (एक) सामांय मानव त्वचा (बी) की तुलना में तेल वर्गों 14 keratins की अभिव्यक्ति के लिए दाग थे (लाल: λex ५५४ एनएम; λem ५६८ एनएम) और 10, involucrin (हरा: λपूर्व ४९० एनएम; λem ५२५ एनएम ), filaggrin (हरा: λपूर्व ४९० एनएम; λem ५२५ एनएम), और laminin 5 (ग्रीन: λपूर्व ४९० एनएम; λem ५२५ एनएम), और एक फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ विश्लेषण किया । सेल नाभिक DAPI धुंधला (नीला: λex ३४० एनएम; λem ४८८ एनएम) द्वारा visualized थे । 3 डी पूर्ण-त्वचा समकक्ष की मोटाई की Immunohistochemical परीक्षा उचित एपिडर्मल स्तरीकरण के रूप में सामांय मानव त्वचा में देखा एपिडर्मिस के विशिष्ट परतों के गठन से पता चला । जबकि कम एपिडर्मल परतों से कोशिकाओं केरातिन 14 के लिए सकारात्मक दाग, ऊपर अर्थ का उपसर्ग से अधिक विभेदित कोशिकाओं-बेसल परत दिखाया केरातिन 10 और involucrin धुंधला । उच्च विभेदित कोशिकाओं परत corneum के करीब filaggrin व्यक्त की है । Laminin 5 दाग से पता चलता है कि एक बेसल लेमिना शारीरिक रूप से चमड़े का डिब्बा (ंयूनतम पैनल) को एपिडर्मल कनेक्ट उत्पंन होता है । यह आंकड़ा Voersmann एट अल से लिया गया है । 15 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : अनायास गठित मेलेनोमा घोंसलों की संख्या और आकार की भविष्यवाणी नहीं की जा सकती. पूर्ण त्वचा समकक्ष के चमड़े के डिब्बे में De नोवो मेलेनोमा घोंसला गठन कोलेजन प्रकार मैं मैट्रिक्स में दोनों सेल प्रकार एंबेड करने के लिए प्राथमिक fibroblasts के साथ मेलेनोमा कोशिकाओं की एक निर्धारित संख्या मिश्रण से प्राप्त किया जा सकता है । संख्या और सहज गठन मेलेनोमा घोंसले का आकार केवल एक परिपक्व 3 डी त्वचा के बारे में 21 दिनों के बाद पुनर्निर्माण से विश्लेषण किया जा सकता है । के रूप में दो नमूनों (A) और (B) से दर्शाया गया है, मेलेनोमा नेस्ट की संख्याएं और आकार व्यक्तिगत त्वचा के पुनर्निर्माण के बीच भिंन हो सकते हैं । एक परिणाम के रूप में, यह इन मॉडलों को मांय करने के लिए और उपचारात्मक प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए मुश्किल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : मेलेनोमा spheroids त्वचा समकक्ष दोहराऊंगा मानव चर्म मेलेनोमा मेटास्टेसिस की प्रमुख विशेषताओं में एकीकृत । एच एंड ई ट्यूमर spheroids के सना हुआ आयल वर्गों त्वचा समकक्ष में एंबेडेड spheroids के साथ गैर-संवहनी मानव चमड़े का मेलेनोमा मेटास्टेसिस vivo मेंमुख्य सुविधाओं को साझा करने के लिए पता चला । कोशिकाओं के दो उपजनसंख्या स्पष्ट रूप से प्रत्यक्ष हैं: एक परिधीय रहने वाले उपआबादी और केंद्रीय उपआबादी मुख्य रूप से सिकुड़ा, अपोप्तोटिक या गल कोशिकाओं से मिलकर, "गल" केंद्र बनाने । ट्यूमर कोशिका उपआबादी का यह वितरण अंडाकार आकृति आकार की गारंटी है । यह आंकड़ा Voersmann एट अल से संशोधित किया गया है । 15 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति त्वचा मॉडल यहां शुरू की अंतर के एक गहरी समझ ट्यूमर और ट्यूमर मेजबान बातचीत के लिए नई अंतर्दृष्टि वारंट, और एक उंनत जांच मंच प्रदान करने के लिए ट्यूमर के विकास के आणविक तंत्र का अध्ययन कर सकते है और भविष्य में थेरेपी प्रतिरोध ।

सबसे अच्छा और शारीरिक गारंटी करने के लिए vivo में नकल उतार त्वचा की स्थिति को खंगाला, प्राथमिक कोशिकाओं की गुणवत्ता अत्यंत महत्वपूर्ण है । जैसा कि ऊपर कहा गया, किशोर या प्रसव पूर्व त्वचा कोशिकाओं को सबसे कम अंतर ग्रेड दिखाने के लिए और इसलिए सबसे अच्छा पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष उत्पंन करने के लिए उपयुक्त हैं । पहली संभव गुणवत्ता नियंत्रण keratinocytes बोने के बाद 2 दिन में चमड़े का संकुचन की हद तक है और ईजीएम को जेल equilibrating (प्रोटोकॉल वर्गों ८.२ और ८.३) । चमड़े का जैल fibroblasts की सबसे अच्छी गुणवत्ता के साथ सबसे हटना होगा । इसके अलावा, बहुत कम या बहुत अधिक fibroblasts के एकीकरण चमड़े का डिब्बा करने के लिए एपिडर्मल का अधययन संकुचन और फलस्वरूप लगाव ख़राब हो सकता है । यह बारी में एपिडर्मल भेदभाव समझौता होगा, क्योंकि इस प्रक्रिया को एक व्यापक पार अधययन और एपिडर्मल कोशिकाओं के बीच बात की आवश्यकता है ।

प्राथमिक कोशिकाओं की गुणवत्ता भी गंभीर कोशिका के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के पारित होने के रूप में प्रवाह पर निर्भर करता है । यदि keratinocytes ≥ करने के लिए बड़े हो रहे हैं ८०% प्रवाह वे तुरंत बंद करो proliferating और अंतर करने के लिए शुरू. यह इसलिए उंहें संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण है ४०-७०% passaging के दौरान प्रवाह और उंहें कोई बाद में 3-4 बीतने से उपयोग करें । Fibroblasts कम संवेदनशील हैं, लेकिन बाद में 4-6 बीतने से नहीं किया जाना चाहिए । कृपया यह भी ध्यान दें कि सभी प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति त्वचा मॉडल उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त कर रहे हैं, और इसलिए संदूषण जोखिम अधिक है । हालांकि, एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा व्यक्तिगत कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान में परिवर्तन और इसलिए त्वचा समकक्ष की गुणवत्ता कम कर देता है ।

सामान्य तौर पर, ट्यूमर अंडाकार आकृति गठन ट्यूमर सेल लाइनों के लगभग सभी प्रकार से और ताजा रोगी सामग्री से अलग ट्यूमर कोशिकाओं से भी संभव है. प्रारंभिक कक्ष संख्या और/या इष्टतम अंडाकार आकृति आकार प्राप्त करने के लिए खेती समय उपयोग किए गए कक्ष प्रकार के आधार पर भिंन हो सकते हैं । १५०-२०० µm के एक आकार तक, सभी कोशिकाओं को एक अंडाकार आकृति में शामिल अभी भी पर्याप्त रूप से सरल प्रसार के माध्यम से पोषक तत्वों के साथ आपूर्ति की जा सकती है । केवल आकार के साथ spheroids ≥ ५०० µm सेलुलर भेदभाव के एक उच्च डिग्री दिखाने के लिए और गैर-संवहनी ट्यूमर ऊतक के विशिष्ट सुविधाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं22.

organotypic मेलेनोमा-अंडाकार आकृति-त्वचा-मॉडल यहां विकसित ट्यूमर-मेजबान बातचीत का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है और मेलेनोमा दवा के तहत परीक्षण के लिए vivo की तरह स्थितियोंमें 15 । फिर भी, vivo में मेलेनोमा का वातावरण और भी अधिक जटिल है, ट्यूमर संबंधित कोशिका प्रकार की एक किस्म बंदरगाह, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं सहित. उचित प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलावा histocompatibility के साथ समस्याओं का सामना करने के बाद से, इन मॉडलों को पर्याप्त रूप से प्रतिरक्षा-चिकित्सीय दृष्टिकोण की निगरानी करने में सक्षम नहीं हैं ।

फिर भी, मेलेनोमा spheroids हौसले से अलग रोगी सामग्री से उत्पंन किया जा सकता है और एक बार पूर्ण त्वचा पुनर्निर्माण में शामिल, व्यक्तिगत दवा जांच प्लेटफार्मों के रूप में सेवा कर सकते हैं । यहां तक कि मेलेनोमा मेटास्टेसिस के टुकड़ों की त्वचा में एकीकरण के एक सिलवाया चिकित्सीय दृष्टिकोण में दवा संयोजन का परीक्षण करने के लिए कल्पना करना है । नैदानिक परीक्षण में organotypic 3d skin-मेलेनोमा मॉडल सहित, यह सुनिश्चित करने में मदद की संभावना है कि केवल सबसे होनहार उपंयास चिकित्सकीय अवधारणाओं आगे नैदानिक परीक्षण में लिया जाता है, इस प्रकार इस के लिए संभावित नए उपचार के उदासीनता दर को कम करने रोग और नैदानिक परीक्षणों में चिकित्सीय सफलता की दर में वृद्धि.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक 3 डी organotypic मेलेनोमा-अंडाकार आकृति-त्वचा मॉडल की स्थापना और उत्कृष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए हैना Voersmann धंयवाद । लेखकों ने बहुमूल्य तकनीकी सहायता के लिए सिल्क बश का भी शुक्रिया अदा किया । काम BMBF e:Med कार्यक्रम "मेलेनोमा संवेदनशीलता" 031A423A द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal serum albumin (FCS) Thermo Fisher Scientific 10270106 add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 1X dilute in PBS
RPMI Thermo Fisher Scientific 61870010 for cultivation of melanoma cell lines
DMEM  Thermo Fisher Scientific 41965062 for cultivation of primary fibroblasts
Dispase Gibco life technologies  17105041 2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I BD Biosciences 354249 usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon  Nunc 140629 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer BD Falcon 352360 yellow
Gentamycine Thermo Fisher Scientific 15750060 dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium Cell Systems do not add FCS or antibiotics
Collagenase SERVA 17454 NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes Cell Systems FC-0007 alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts Cell Systems FC-0001 alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM
[+] 4,5 g/l Glucose,
[+] L- Glutamine,
[-] L- Pyruvate		 Gibco life technologies 41965 mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine Gibco life technologies  21765-029 add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF  Gibco life technologies  13247-051 add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride Merck Chemicals 2381 add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid Alfa Aesar 18851 add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin Lilly HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine Sigma-Aldrich  E-0135 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine Sigma-Aldrich P-0503 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine Sigma-Aldrich  T-0665 add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine Sigma-Aldrich T-6397 add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-088816 add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone Sigma-Aldrich P-8783 add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes Sigma-Aldrich H-3784 add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine Sigma-Aldrich S-4311 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride Sigma-Aldrich  C-7017 add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS Sigma-Aldrich F-0392 Lot 086K0361 add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine Sigma-Aldrich  A-9795 add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine PromoCell C-42209 add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride Sigma-Aldrich 255521 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody Dako M7002 1:50
anti cytokeratin 14 antibody Santa Cruz sc-53253 1:200
 anti laminin 5 antibody Santa Cruz sc-32794 1:50
anti filaggrin antibody Thermo Fisher Scientific MA5-13440 1:50
anti involucrin antibody Acris Antibodies AM33368PU 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled LifeSpan Biosciences LS-C153907 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled Jackson Immuno Research 115-165-003 1:1000
DAPI Sigma-Aldrich 10236276001 1:100

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कैंसर रिसर्च इश्यू १३५ मेलेनोमा spheroids organotypic फुल स्किन मॉडल 3डी मेलेनोमा स्क्रीनिंग स्क्रीनिंग सिस्टम
एक ३डी Organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति स्किन मॉडेल
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Müller, I., Kulms, D. A 3D… More

Müller, I., Kulms, D. A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model. J. Vis. Exp. (135), e57500, doi:10.3791/57500 (2018).

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