Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

3D Organotypic melanom Spheroid huden modell

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57500
Automatic Translation
1, 1
1Experimental Dermatology, Medical Faculty, TU-Dresden

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å generere en 3D organotypic melanom spheroid huden modell som viser både arkitekturen og flercellet kompleksiteten av et orgel/svulst i vivo , men samtidig plass systematisk eksperimentell intervensjon.

Abstract

Malign transformasjon av melanocytter, pigment cellene i huden, forårsaker dannelsen av melanom, en svært aggressiv kreft med økt metastatisk potensial. Nylig, mono-chemotherapies fortsette å forbedre av melanom spesifikke kombinasjonen terapi med målrettede kinase hemmere. Metastatisk melanom gjenstår fortsatt, en livstruende sykdom fordi svulster utstillingen primær resistens eller utvikler resistens mot romanen terapi, og dermed gjenvinne tumorigenic kapasitet. For å bedre den terapeutiske suksessen til malignt melanom, er bestemmelse av molekylære mekanismer overdragelse motstand mot konvensjonelle behandlingsmetoder nødvendig; Imidlertid krever det nyskapende mobilnettet i vitro modeller. Her introduserer vi en i vitro tredimensjonale (3D) organotypic melanom spheroid modell som kan skildre arkitektur i vivo svulst og kan garanterer ny innsikt i intra-tumoral og svulst vert interaksjoner. Modellen har definert antall eldre og differensiert melanom spheroids i en 3D menneskehud full rekonstruksjon modell som består av primære hudceller. Innebygde melanom spheroids mobilnettet sammensetning og differensiering status er lik en av kutan melanom metastasering i vivo. Med denne organotypic melanom spheroid modellen som en narkotikarelaterte screening plattformen støtter identifikasjon av reagerer på valgt kombinasjon terapier, skåner unødvendige behandling byrden for ikke-respondere, og dermed øke fordelen av terapeutisk intervensjon.

Introduction

Den menneskelige huden består av to forskjellige avdelinger som serverer ulike funksjoner i å beskytte kroppen fra miljømessige bivirkninger1. Lavere dermal rommet består av en fibro-elastisk bindevev. Det består av løst koblet kollagen og elastin fibre syntetisert av fibroblaster, tjene en mekanisk barriere-funksjon. Dermis er separert fra øvre overhuden den basale lamina som er produsert som en ekstracellulær matrix på grunn av konstant kommunikasjon mellom begge hud avdelinger. I motsetning til dermis, overhuden er en plateepitel epitel som hovedsakelig består av keratinocytter og kan differensieres til fire lag. Stratum basale består av udifferensierte basale keratinocytter som stadig avledet fra huden progenitor celler stratifying gjennom stadier av stratum spinosum og stratum granulosum inn i stratum corneum å beskytte kroppen fra dehydrering og infeksjoner2. Melanocyttene er justert på basale membranen og kommunisere gjennom dendrittiske extensions med flere keratinocytter. De produserer pigmentet melanin å beskytte huden vev fra de negative effektene av UV-stråling, som aldring av huden, immunsuppresjon, betennelse og induksjon av ikke-melanom hudkreft. UV stråler bidrag til transformasjonen av melanocyttene til malignt melanom, men er fortsatt under debatten3.

Melanom utvikling er differensiert i forskjellige svulst progresjon stadier, og preget av visse genetisk morfologiske og histologic endringer4. De kommer enten de novo eller fra en medfødt eller ervervet nevus på grunn av en lokal øke melanocyte spredning forårsaker godartet neoplasi. Denne forløper lesjon kan konvertere til strukturelt endret dysplastic vev som inneholder atypic celler, som kan fortsette til første ondartet scenen, det radielle vekstfase (RGP). Denne tidlige svulst progresjon fasen er preget av celler radielt voksende i epidermis, viser noen lokalt invasiv celler innenfor papillary dermis. Under påfølgende vertikale veksten fase (VGP) melanom viser celler allerede en metastatisk og invasive fenotypen ved å bryte gjennom den basale lamina å infiltrere dypere deler av dermis samt subkutant vev5. Til slutt, i metastatisk melanom (MM) representerer mest aggressive progresjon scenen med metastatisk celler systemisk sprer seg i blod og lymfe systemet å invadere distally organer som lever, lunge og hjernen6.

Hittil fortsatt tidlig diagnose etterfulgt av kirurgi den mest effektive terapien til malignt melanom. Prognosen for pasienter med Fjern metastasering, imidlertid spesielt dårlig7, fordi klassisk kjemoterapi regimer tildele bare liten overlevelse fordel8,9. Imidlertid etter tiår med stagnasjon, har nylige fremskritt innen målrettet terapi betydelig bedre prognoser til malignt melanom.

Feilregulering to store mitogen aktivert veier, RAS-RAF-MEK-ERK og PI3K-AKT-PTEN-signalveier, presenterer viktige drivere av melanom progresjon, spesielt når aktivere constitutively punktet mutasjoner av proto-oncogenes BRAFV600 og NRAS er tilstede10. Følgelig lovet oppfinnelsen av målrettede kinase hemmere terapeutiske fordel for metastatisk melanom pasienter. En rekke kliniske studier utført til dette punktet oppnådd ikke betydelig fordel for pasienter med metastatisk melanom. Nesten alle reaksjoner er delvis, med en subpopulasjon av pasienter viser primær resistens. Videre ble oppkjøp av sekundær resistens fører til tilbakefall observert i fleste pasienter11,12.

Det blir klart at analyse av mutasjon statusen alene ikke er tilstrekkelig til å utvikle den mest potente terapeutiske strategien. Nye raske og pålitelige diagnostiske verktøy er nødvendig systematisk registrere og analysere responsen til enkelte kreftceller. Majoriteten av tilgjengelige data på menneskelig melanom er anskaffet fra todimensjonal (2D) melanom cellekulturer. Kreftceller, men dyrket i 3D tillate intercellulære crosstalk mellom differensiert kreft cellen subpopulasjoner også mellom kreftceller og de ikke-transformert omkringliggende vert vev. Derfor det ville være best å rekonstruere 3D-miljøet som melanom utviklet, som en prekliniske screening modell13,14.

Protocol

Alle menneskelig vev arbeidet ble utført ved hjelp av godkjente institusjonelle protokoller.

1. separasjon av Dermis og Epidermis fra menneskelig hud (Juvenile forhuden fra omskjæring)

  1. Plasser forhuden (vanligvis 1-2 cm2) i en ikke-klebende sterilt celle kultur parabol (Ø 10 cm) og dekke det med 10-12 mL fosfat-bufret saltoppløsning+ (PBS, 0,5 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, pH 7.2 = PBS+). Fjerne alle overflødig (adipose) vev sterilt skalpell og tang.
  2. Kutt huden i 3 x 5 mm biter, vaske dem med PBS og overføre dem til en ikke-klebende sterilt celle kultur parabol (Ø 6 cm). Dekk vev bitene med 5-7 mL dispase løsning (2 U/mL i PBS). Forsegle celle kultur parabol med parafin film og Inkuber 16 h på 4 ° C.
  3. Trekke epidermal fra dermal del med to sterile tang. Overføre dissekert vev brikkene ikke selvklebende enkeltcelle kultur retter (Ø 6 cm) og dekke hver av dem med PBS+.

2. isolering av primære keratinocytter fra overhuden

  1. Nøye fjerne PBS+ fra celle kultur parabol med en Pasteur pipette og vask epidermal vev brikkene (inndelingen 1.3) med PBS. Skjær overhuden i mindre biter (1 mm2) og samle dem i en 50-mL konisk rør. Legge til 10 mL 1 x Trypsin-EDTA (forvarmet til 37 ° C) og Inkuber i 5 min i et vannbad på 37 ° C. Vortex vev suspensjon hver 2 min.
  2. Stoppe enzymatiske reaksjonen ved å legge til 1 mL fosterets kalv serum (FCS). Resuspend cellene av pipettering opp og ned med en 10-mL plastikk pipe for 4 min. prøve å unngå bobler og skumdannelse.
  3. Pipetter celle suspensjon i en celle sil (pore størrelse 100 µm), plasseres over en fersk 50 mL konisk rør, og skyll 3 x med 5 mL PBS. Sentrifuge cellene på 200 x g for 5 min. Resuspend celle pellet i 2-6 mL kultur medium med 1% (v/v) gentamycin. Fastslå hvor cellen manuelt ved å telle celler i en hemocytometer og frø 6 x 105 cellene til en MT75 celle kultur kolbe.

3. dyrking av primære keratinocytter

  1. Inkuber primære keratinocytter isolert i trinn 2.3 i en celle inkubator på 37 ° C og 5% CO2 i keratinocyte medium uten FCS, til 50-70% confluency.
  2. Til passasje av keratinocytter nøye fjerne mediet, legge til 5 mL PBS-EDTA og ruge celler for 10 min på 37 ° C. Sjekk hvis cellene har begynt å koble fra kultur kolbe under lys mikroskop (4 X forstørrelse: celler vises som avrundet, men er fortsatt festet!). Hvis ikke, erstatte gamle PBS-EDTA med fersk PBS-EDTA og re ruge for en annen 10 min på 37 ° C.
  3. Legge til 5 mL 1 x Trypsin-EDTA til avrundet cellene fortsatt dekket med 10 mL PBS-EDTA og re ruge dem i 1-3 min på 37 ° C. Stoppe enzymatiske reaksjonen ved å legge til 1 mL FCS og samle frittliggende cellene i en 50-mL konisk rør. Sentrifuge cellene på 200 x g i 5 min, resuspend pellets i keratinocyte medium og frø 6 x 105 celler i en fersk MT75 celle kultur kolbe.
    Merk: For å generere organotypic huden rekonstruerer, den primære keratinocytter bør brukes senest passasje 3-4.

4. isolering av primære fibroblaster fra Dermis

  1. Kuttet dermal vev (inndelingen 1.3) i mindre biter (1 mm2) og overføre dem til en 50-mL konisk rør. Legge til 10 mL collagenase-løsning (5 U/mL i PBS+) og ruge for 45 min i et vannbad på 37 ° C. Sentrifuge blanding av vev stykker og cellene på 200 x g i 5 min.
  2. Vask celle pellet to ganger med 10 mL DMEM inneholder 4,5 finans glukose og L-glutamin, men uten L-Pyruvate. Endelig resuspend vev bitene i 2 mL DMEM som inneholder 1% (v/v) gentamycin og 10% FCS. Overføre dem i en T25 celle kultur kolbe og ruge dem i en celle inkubator på 37 ° C og 5% CO2 over natten.
    Merk: Liten volumet kan fibroblaster overføre av vev-rusk og tvinger dem til å knytte til kultur kolbe.
  3. Neste morgen, legger en annen 6 mL DMEM/Gentamycin/FCS og ruge for 2-3 dager på 37 ° C til cellene har nådd 80-90% confluency.

5. dyrking av primære fibroblaster

  1. Passasje av fibroblaster, fjerne mediet og vaske tilhenger celler med PBS. Legge til 5 mL 1 x Trypsin-EDTA og Inkuber i 3 minutter på 37 ° C.
  2. Stoppe enzymatiske reaksjonen ved å legge til 5 mL DMEM/FCS og samle frittliggende cellene i en 50-mL konisk rør. Sentrifuge cellene på 200 x g i 5 min resuspend pellet i DMEM medium og frø 6 x 105 celler i en fersk MT75 celle kultur kolbe.
    Merk: For å generere organotypic huden rekonstruerer, de primære fibroblaster bør brukes senest passasje 4-6.

6. generasjon av 3D Melanoma Spheroids Via hengende slipp-metoden

  1. Kultur melanom celler (f.eks, 451-LU eller noen melanom cellen linje rundt) i henhold til generelle protokoller, bruker RPMI som inneholder 10% FCS15.
    1. Vil generere melanom spheroids lignende størrelse og kvalitet, vask melanom cellene i PBS, legge til 5 mL 1 x Trypsin-EDTA i PBS til cellene i en T175 celle kultur kolbe og ruge for 3-5 minutter ved romtemperatur (RT). Nøytralisere Trypsin ved å legge til 5 mL RPMI/10% FCS. Innhøstingen cellene med sentrifugering 200 x g for 5 min. re suspendere celle pellet i RPMI/FCS i en siste konsentrasjon av 10.000 celler/mL som teller i en hemocytometer.
  2. Spot 40 x 25 µL (= 250 celler) i celle suspensjon på overflatebehandling av lokket av en steril ikke selvklebende celle kultur parabol (Ø 10 cm) bruker en elektronisk multi pipette. Med en rask men jevn bevegelse, snur lokket og plassere den på den respektive celle kultur parabolen med 5 mL PBS.
    1. Kultur "henger slipp retter" i en celle inkubator på 37 ° C og 5% CO2 for 10-14 dager, avhengig av hvilken celle brukes.
      Merk: Celler fra MM vekstfase vanligvis vokse raskere og mer solid spheroids i hengende drop sammenlignet med melanom cellene stammer fra RGP eller VGP. For personlige vurdering observere spheroid vekst under et par kikkert eller lys mikroskop (4 X forstørrelse). Vanligvis blir spheroids synlig etter 48 timer under et par kikkert eller lys mikroskop (4 X forstørrelse). Etter 10-14 dager er de synlige uten en forstørrelse enhet.
  3. fem dager etter den første slipp småblødninger, legge 10 µL av fersk RPMI/10% FCS medium til hver dråpe. Deretter exchange 10 µL av medium annenhver dag. Bruk av en elektronisk dispenser er svært nyttig i dette trinnet.
  4. Avhengig av hvilken celle, høste spheroids (se avsnitt 10 for detaljer) etter 10-15 dager ved å forsiktig rense dem av celle kultur parabol lokket med PBS. Samle dem i en fersk ikke selvklebende celle kultur parabol.
    Merk: Dyrking perioden er avhengig av tumor vekstfase av melanom cellene når de først er avledet, f.eksspheroids avledet fra 451-LU cellene vokse til ca 500 µm i diameter i 12 dager dyrking i hengende rullegardinmenyen15 .

7. generasjon av Dermal kupé Organotypic Full hud rekonstruerer

  1. Generere huden modeller med 24-og celle mikroporøs membran inserts (pore størrelse 8 µm) i 24-og plater.
    Merk: Sørg for ikke å bruke hengende men står inserts, fordi de vil bli plassert i en 6-vel plate for luft-flytende dyrking på et senere tidspunkt.
  2. Forberede gel nøytralisering løsning (GNL)15, samt kultur media kalt MM og endothelial vekst medier (EGF)16,17. For å hindre koagulering, kollagen lagertypen I (vanligvis fra rotte hale, 3,5-4 mg/mL i 0.02 N eddiksyre) på is til bruk, fordi den begynner å gel på RT.
  3. Nytt suspendere 1 x 105 fibroblaster per sett inn i GNL og raskt blande celle suspensjon med kollagen i forholdet 1:3 i et siste volum på 500 µL/insert. Blandingen av pipettering forsiktig opp og ned for å unngå boble formasjon som bobler kan forringe kvaliteten på huden rekonstruere.
  4. La personlige dermal geléer å avgjøre ved å holde dem uten mediet på RT for 30 min i sterilt hette. Deretter dekke hver gel med DMEM som inneholder 4,5 finans glukose, 1% L-glutamin, 10% FCS, og uten L-pyruvate, og ruge over natten på 37 ° C.

8. generasjon av Epidermal kupé Organotypic Full hud rekonstruerer

  1. Neste dag fjerne mediet fra dermal geléer og equilibrate dem med EGM media (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/mL gentamicin) 2 h på 37 ° C. Ta ut mediet og nøye frø 1 x 105 keratinocytter resuspended i 100 µL EGM over dermal gel.
  2. Inkuber rekonstruerer 1.5 h på 37 ° C tillate keratinocytter å overholde dermal rommet.
    Merk: Samtidig inkubasjon geléer vil begynne å krympe på grunn av fibroblast-indusert sammentrekning, og dermed delvis koble fra sett inn veggene.
  3. Dekker huden ekvivalenter med ca 800 µL EGM og forsiktig fjerne gjenværende gel mot sett inn en liten (hvit) pipette tips. Kultur huden ekvivalenter neddykket i EGM i 7 dager på en celle inkubator på 37 ° C, 5% CO2, og endre mediet annenhver dag.
    Merk: I denne perioden huden ekvivalenter krymper betydelig.

9. luft-flytende dyrking av Organotypic Full hud rekonstruerer

  1. På dag 8 transfer hver inn en personlige godt av en 6-vel plate. Bare legge 1.2-1.4 mL MM medium i hver brønn, slik at huden rekonstruere leveres med medium fra bunnen av brønnen men dekkes ikke med medium.
    Merk: Dyrking på luft-flytende grensesnittet tillater lagdeling av epidermal del og etablering av en fullt cornified lag (stratum corneum).
  2. I løpet av de neste 10-17 dagene, endre medium som beskrevet i delen 9.1 annenhver dag. Legge til narkotika eller andre stimuli som måtte mediet i denne perioden. Nøye fjerne hele huden rekonstruere fra mikroporøs membran innsatsen med buet pinsett for ytterligere analyse, f.eksimmunohistochemical analyse (figur 1).

10. generasjon av Organotypic melanom Spheroid huden modeller

  1. For å integrere melanom spheroids dermal rommet av organotypic full hud rekonstruerer, skyll nøye spheroids (etter trinn 6.4) av lokket av hengende slipp celle kultur parabol med PBS. Samle 10-20 spheroids/sette inn i et sterilt ikke selvklebende celle kultur parabol. Fjern forsiktig overdreven PBS med en Pasteur pipette.
  2. Sug opp spheroids i den minste volum mulig av EGM. På dette punktet observere og telle spheroids med det blotte øye, uten ytterligere forstørrelse enhet. Tar 10-20 spheroids per huden modell/gel, som nevnt i trinn 10.1.
  3. Overføre dem til ønsket volum av GNL som inneholder fibroblaster (under trinn 7.3), og blande med kollagen type jeg. Dette trinnet på fortsette som beskrevet i delene 7.3-9.1.
    Merk: Svulst spheroids blir synlige i dermal gel som hvite flekker (figur 2)

Representative Results

Vellykket behandling av melanom metastasering kan være påvirket av kryss-snakk mellom svulst cellene også mellom svulst og ikke-transformert vert. Hensikten med utviklingen organotypic modeller av kreft i vitro er å gi passende prekliniske testsystemer som recapitulate 3D organisasjon og kompleksiteten i menneskelig melanom i vivo. Dette muliggjør studiet av den terapeutiske effekten svulst i et organotypic miljø og de negative effektene på omkringliggende primære vev parallelt.

For å utvikle de beste organotypic hud modellene, er kvaliteten på primære cellene avgjørende. Det er en fordel å bruke juvenile primære fibroblaster og keratinocytter, fordi de er vanligvis mindre differensiert sammenlignet med voksen primære hudceller. Juvenile hud celler kan enten være isolert fra juvenile foreskin som beskrevet i delene protokollen 1-5, men kan også kjøpes fra selskaper som pre-Natal primære fibroblaster og keratinocytter. Hvis kjøper, er det nødvendig å bestille celler fra ulike givere å unngå donor-spesifikke resultater, f.eksfor narkotika følsomhet. Hele protokollen vises som et oppsett på Figur 3.

Kvalitetskontroll av 3D full-hud-ekvivalenter krever immunohistochemical analyse. Et førsteinntrykk kan fås ved Hematoxylin-Eosin (H & E) flekker av parafin innebygd deler (3 µm). Detaljert analyse av kvaliteten på epidermal differensiering og dannelsen av den basale lamina mellom dermis og epidermis krever immunohistochemical analyse med spesifikke antistoffer mot en epidermal lagdeling markør. Dette gjør at skille mellom udifferensierte, svært proliferativ celler ligger nær basale membranen og svært differensiert og keratinized cellene på i stratum corneum gjennom dannelsen av forskjellige epidermal lag mellom . Som vist av immun-histologiske flekker (Figur 4), differensiering av keratinocytter gjennom overhuden kan oppnås lik normal hud: hovedsakelig udifferensierte celler fra lavere epidermal lag (stratum basale og stratum spinosum) flekken positivt for keratin 14, mens de mer differensierte cellene fra supra basale lag (stratum granulosum og stratum corneum) flekken positivt for keratin 10 og involucrin. Følgelig kan filaggrin flekker bare være observert i svært differensierte celler i stratum corneum. Viktigst, avslører laminin 5 flekker at en basal lamina ble generert for å koble fysiologisk i epidermal dermal rommet kunstig huden rekonstruere. Dette beviser at en kommunikasjon organotypic microenvironment har blitt generert vert melanom celler eller spheroids for fysiologiske og pathophysiologic analyse.

For melanom narkotikarelaterte screening, kan enkelt melanom celler også integreres inn i dermis av full hud ekvivalenter tillate de novo melanom reir formasjon18,19. Derfor, melanom celler kombinert med primære fibroblaster i forholdet 5:1, sentrifugeres sammen på 200 x g i 5 min og resuspended i GNL før blande med kollagen. Som et resultat, vil melanom celle reir spontant danne dermal batterirommet. Vår erfaring bare celler metastatisk vekst fase skjemaet riktig redene, sammenlignet med melanom celler av RGP eller VGP15. En stor ulempe av slike modeller er at antall og størrelsen på melanom reir dannet ikke kan forutses, og kan variere mellom individuelle huden rekonstruerer uavhengig behandling. For eksempel kan 1000 celler seeded i dermal rommet få 10 reir som består av 100 celler eller 100 reir som består av 10 celler hver (figur 5). Variablene biologiske presentere med tre mangler: først, antallet og størrelsen av melanom reir dannet er uforutsigbare; andre metastaser i vivo er vanligvis større enn melanom reir og viser en mer kompleks intra-tumoral mangfold; og tredje på grunn av begrenset levetiden av svulst-reiret modeller, behandlingen startes tidlig og følgelig heller hemmer tumor utvekst i stedet for forårsaker regresjon av eksisterende svulst reir.

For å overvinne disse begrensningene organotypic melanom spheroid huden modellene kan genereres. Av dyrking 250 metastatisk melanom celler i en hengende slippe for 14 dager20, genereres spheroids reproduserbar bestående av levedyktig melanom celler en kompakt struktur med en siste diameter på rundt 500 µm mimicking ikke Stangeriaceae svulst noder, mikro-metastasering eller Inter kapillær mikro regioner solide svulster21,22. Generelt noen melanom celle linje er egnet for generering av spheroids via hengende slipp-metoden. imidlertid celler avledet fra mer avansert metastatisk svulst stadier skjemaet mer solid spheroids sammenlignet med linjer fra tidlige utviklingen stadier, f.eksRGP.

Noen celler, er det fordelaktig for riktig formet formasjon å forbedre viskositeten av hengende slippe kultur medium. Dette kan oppnås ved tilsetning av 10-50% metyl-cellulose til kultur medium. For den metyl-cellulosevatt lager løsning, autoklav 1,2 g metyl-cellulose sammen med magnetic røre bar i en 100 mL glassflaske. Legge til 100 mL forvarmet (60 ° C) medium og rør for 20 min ved romtemperatur og en 1-2 h på 4 ° C. Sentrifuge lager løsningen for 2t 5000 x g og lagre tyktflytende nedbryting på 4 ° C før bruk.

Riktig validering av full hud melanom-formet modeller er gitt av det faktum at en definerte antallet av melanom spheroids - minst statistisk - integreres dermal fibroblast/kollagen stillas jeg på dag 1 av huden modell byggingen, slik at dem vil co-utvikle under epidermal differensiering i 25-27 dager. Avkastningen av spheroids kan analyseres direkte etter seeding, fordi spheroids vises som hvite flekker i den gjennomsiktige dermal gel og kan sees uten alle forstørrelse enheter (figur 2). Som et resultat, genereres en 3D huden modell at havner modne melanom spheroids, som hadde vært kulturperler i vitro totalt ca 42 dager, viser høyeste intra-tumoral celle differensiering15.

H & E farging av huden melanom spheroid modellen avslører histologiske utseende og mobilnettet distribusjon av melanom spheroids måte til en ikke-Stangeriaceae menneskelige melanom hud metastaser i vivo15 (figur 6 ). To subpopulasjoner av melanom celler er klart kan skilles under disse forholdene: en ekstern voksende subpopulasjon og en sentral subpopulasjon hovedsakelig bestående av krympet, apoptotisk eller nekrose celler, danner den såkalte "nekrotisk" Center. Immunohistochemically bor og voksende subpopulasjoner kan oppdages ved hjelp av antistoffer mot spredning markøren KI-67, mens celler av nekrotisk center kan visualiseres tunnel flekker15. Denne bestemt fordeling av svulst celle subpopulasjoner garanteres av spheroid størrelsen (≥500 µm), skyldes mangel på næringsstoffer og oksygen i den sentrale delen der katabolske avfall akkumuleres. Følger protokollen forutsatt her tillater generering av en pålitelig og reproduserbar organotypic innebygd full-tykkelse huden modellen med menneskelige melanom spheroids som etterligner menneskelige melanom hud metastasering. Anvendelser av denne modellen inkluderer narkotikatesting, screening av giftstoffer, påvirker kosmetisk forbindelser eller laser terapi melanom utvekst og behandling.

Figure 1
Figur 1 : Dyrking av 3D organotypic huden rekonstruerer neddykket med medium og luft-flytende grensesnittet. På dag innebygd 0 primære keratinocytter er seeded over dermal rommet som består av primære fibroblaster i en kollagen type jeg-matrise. 3D huden rekonstruerer bo dyrket neddykket med EGM for 7 dager, koble fra sett inn veggen og starte krymper. På dag 8 skivene overført til 6-wells og dyrket i luft-flytende grensesnittet å tillate epidermal lagdeling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Melanom spheroids innebygd i dermal batterirommet vises som hvite flekker. Mens forbereder dermal rommet av 3D huden rekonstruere, et definert antall melanom spheroids kan legges til fibroblast kollagen type jeg blande. Når dermal gel har avgjort, blir melanom spheroids synlige som hvite flekker.

Figure 3
Figur 3 : Ordningen med 3D organotypic huden modell konstruksjon. Fjerne fettvev fra huden prøven og skjær den i mindre biter. Inkubasjon med dispase løsning overnatting på 4 ° C muliggjør separasjon av overhuden fra huden. Isolert primære fibroblaster og keratinocytter bør være dyrket separat og brukes mellom passasje 4-6 og 3-4, henholdsvis. Generasjonen av 3D huden modellen kan deretter fortsette som beskrevet i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : 3D organotypic huden rekonstruerer vise et differensiering nivå lik normal menneskelig hud. Parafinen deler av huden ekvivalenter (A) sammenlignet med normal menneskelig hud (B) var farget for uttrykket av keratins 14 (rød: λex 554 nm; λem 568 nm) og 10, involucrin (grønn: λex 490 nm; λem 525 nm ), filaggrin (grønn: λex 490 nm; λem 525 nm), og laminin 5 (grønn: λex 490 nm; λem 525 nm), og analysert med AC confocal fluorescens mikroskop. Cellen kjerner var visualisert ved DAPI flekker (blå: λex 340 nm; λem 488 nm). Immunohistochemical undersøkelse av 3D full-tykkelsen på huden ekvivalenter åpenbart riktig epidermal lagdeling danner forskjellige lag av overhuden sett i normal menneskelig hud. Mens celler fra lavere epidermal lag beiset positivt for keratin 14, differensierte mer celler fra supra basale laget viste keratin 10 og involucrin flekker. Svært differensierte celler nær i stratum corneum uttrykt filaggrin. Laminin 5 flekker viser at en basal lamina genereres for å koble fysiologisk i epidermal dermal rommet (laveste panel). Dette tallet er tatt fra Voersmann et al. 15 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Antall og størrelsen på spontant dannet melanom reir ikke kan forutsis. De novo melanom reir formasjonen i dermal rommet full hud ekvivalenter kan oppnås ved å blande et definert antall melanom celler med primære fibroblaster bygge inn begge celletyper i hvilken kollagen jeg matrise. Antall og størrelsen på spontant dannet melanom reir kan bare bli analysert fra en eldre 3D hud rekonstruere etter ca 21 dager. Som vist fra to prøvene (A) og (B), numrene og størrelsene av melanom reir kan variere mellom individuelle huden rekonstruerer. Som en konsekvens, er det vanskelig å validere disse modellene og forutsi terapeutiske effekten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Melanom spheroids integrert i huden ekvivalenter recapitulate nøkkel vise egenskaper av menneskelig kutan melanom metastasering. H & E farget parafinsnitt av svulst spheroids innebygd i huden ekvivalenter avslørt spheroids dele viktige funksjoner med ikke-Stangeriaceae menneskelige kutan melanom metastaser i vivo. To subpopulasjoner av celler er tydelig merkbar: en ekstern levende subpopulasjon og sentrale subpopulasjon hovedsakelig bestående av krympet, apoptotisk eller nekrose cellene danner "nekrotisk" sentrum. Denne fordelingen av svulst celle subpopulasjoner garanteres av spheroid størrelsen. Dette tallet har blitt endret fra Voersmann et al. 15 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Organotypic melanom spheroid huden modellen innført her garanterer ny innsikt for en dypere forståelse av intra-tumoral og svulst vert interaksjon, og gir en avansert screening plattform for å studere molekylære mekanismer av tumor utvikling og terapi motstand i fremtiden.

Å garantere best fysiologiske og i vivo mimicking for huden rekonstruerer, kvaliteten på primære cellene er av største betydning. Som nevnt ovenfor, juvenile eller Pre-Natal hudceller Vis laveste differensiering karakteren og er derfor best egnet til å generere full-tykkelse huden ekvivalenter. Den første mulige kvalitetskontrollen er omfanget av dermal sammentrekning på dag 2 etter såing av keratinocytter og equilibrating gel til EGF (protokollen avsnittene 8.2 og 8,3). Dermal gels krymper de med den beste kvaliteten på fibroblaster. Integrering av for få eller for mange fibroblaster kan også svekke dermal sammentrekning og dermed feste den epidermal dermal rommet. Dette vil i sin tur invadere epidermal differensiering, fordi denne prosessen krever en omfattende kryss-snakk mellom dermal og epidermal celler.

Kvaliteten på primære celler er også kritisk avhengig av cellen confluency samt passering av cellene. Hvis keratinocytter er vokst til ≥80% confluency de umiddelbart stoppe voksende og begynne å skille. Det er derfor viktig å kultur dem til 40-70% confluency i passaging og bruker dem ikke senere enn passering 3-4. Fibroblaster er mindre følsomme, men bør ikke brukes senere enn passasje 4-6. Vær også oppmerksom på at alle primære celler og linjer brukes til å generere organotypic melanom spheroid huden modeller er kultivert uten antibiotika, og derfor forurensning risikoen er høy. Men tillegg av antibiotika endrer fysiologi av de enkelte cellene og dermed reduserer kvaliteten på huden ekvivalenter.

Generelt, er svulst formet formasjon mulig fra nesten alle typer av svulst cellelinjer og også fra kreftceller fersk isolert fra pasienten materiale. Den første celle og/eller dyrking tiden for å få optimal spheroid størrelser kan variere avhengig av hvilken celle brukes. Størrelsen på 150-200 µm, kan alle celler i en spheroid fortsatt tilstrekkelig leveres med næringsstoffer via enkel spredning. Bare spheroids med størrelser ≥500 µm viser en høy grad av differensiering og representerer typiske egenskapene til ikke-Stangeriaceae tumor vev22.

Organotypic melanom-formet-hud-modellen utviklet her er spesielt egnet til å studere svulst vert interaksjoner og melanom-narkotikatesting under i vivo-liker forhold15. Likevel er miljøet av melanom i vivo enda mer komplisert, skjuler en rekke svulst forbundet celletyper, inkludert immunceller og endotelceller. Siden tillegg av riktig primære immunceller står overfor problemer med histocompatibility, er disse modellene ikke ennå kjøpedyktig dataskjerm tilstrekkelig immun-terapeutiske metoder.

Likevel melanom spheroids kan genereres fra ferske isolert pasienten materiale og når inkludert i full hud rekonstruere, kan tjene som individuelle narkotika screening plattformer. Med integrering av melanom metastasering i huden rekonstruerer er tenkelig å teste stoffet kombinasjoner i en tilpasset terapeutisk tilnærming. Inkludert organotypic 3D hud-melanom-modellen i preklinisk testing er sannsynlig å sikre at bare de mest lovende romanen terapeutiske begrepene blir tatt frem i klinisk testing, dermed redusere den utmattelseskrig rate potensielle nye behandlinger for dette sykdom og øker frekvensen av terapeutiske suksess i kliniske forsøk.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Hanna Voersmann for å etablere 3D organotypic melanom-formet-hud-modellen og gir utmerket protokoller. Forfatterne takker også Silke Busch verdifulle kundestøtte. Arbeidet ble støttet av BMBF e: Med programmet "Melanom Sensitivity" 031A423A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal serum albumin (FCS) Thermo Fisher Scientific 10270106 add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 1X dilute in PBS
RPMI Thermo Fisher Scientific 61870010 for cultivation of melanoma cell lines
DMEM  Thermo Fisher Scientific 41965062 for cultivation of primary fibroblasts
Dispase Gibco life technologies  17105041 2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I BD Biosciences 354249 usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon  Nunc 140629 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer BD Falcon 352360 yellow
Gentamycine Thermo Fisher Scientific 15750060 dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium Cell Systems do not add FCS or antibiotics
Collagenase SERVA 17454 NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes Cell Systems FC-0007 alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts Cell Systems FC-0001 alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM
[+] 4,5 g/l Glucose,
[+] L- Glutamine,
[-] L- Pyruvate		 Gibco life technologies 41965 mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine Gibco life technologies  21765-029 add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF  Gibco life technologies  13247-051 add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride Merck Chemicals 2381 add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid Alfa Aesar 18851 add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin Lilly HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine Sigma-Aldrich  E-0135 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine Sigma-Aldrich P-0503 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine Sigma-Aldrich  T-0665 add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine Sigma-Aldrich T-6397 add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-088816 add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone Sigma-Aldrich P-8783 add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes Sigma-Aldrich H-3784 add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine Sigma-Aldrich S-4311 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride Sigma-Aldrich  C-7017 add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS Sigma-Aldrich F-0392 Lot 086K0361 add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine Sigma-Aldrich  A-9795 add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine PromoCell C-42209 add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride Sigma-Aldrich 255521 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody Dako M7002 1:50
anti cytokeratin 14 antibody Santa Cruz sc-53253 1:200
 anti laminin 5 antibody Santa Cruz sc-32794 1:50
anti filaggrin antibody Thermo Fisher Scientific MA5-13440 1:50
anti involucrin antibody Acris Antibodies AM33368PU 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled LifeSpan Biosciences LS-C153907 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled Jackson Immuno Research 115-165-003 1:1000
DAPI Sigma-Aldrich 10236276001 1:100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boulais, N., Misery, L. The epidermis: a sensory tissue. Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).
  2. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).
  3. Shain, A. H., Bastian, B. C. From melanocytes to melanomas. Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).
  4. Clark, W. H. Jr Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer. Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).
  5. Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host. Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).
  6. Miller, A. J., Mihm, M. C. Jr Melanoma. N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).
  7. Balch, C. M., et al. Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification. J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).
  8. Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials. Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).
  9. Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma. Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).
  10. Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
  11. Flaherty, K. T., et al. Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).
  12. Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. Systemic therapy of metastatic melanoma. J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).
  13. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
  14. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  15. Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing. Cell Death. Dis. 4, e719 (2013).
  16. Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation. J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).
  17. Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).
  18. Sinnberg, T., et al. Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide. J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).
  19. Niessner, H., et al. The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells. J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).
  20. Foty, R. A. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  21. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  22. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).

Tags

Kreftforskning problemet 135 melanom spheroids organotypic hele huden modellen 3D melanom screening screening system
3D Organotypic melanom Spheroid huden modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, I., Kulms, D. A 3D… More

Müller, I., Kulms, D. A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model. J. Vis. Exp. (135), e57500, doi:10.3791/57500 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter