यहां, हम एक 3 डी organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति त्वचा मॉडल है कि recapitulates वास्तुकला और एक अंग की कोशिकीय जटिलता/ vivo में एक ही समय में व्यवस्थित प्रयोगात्मक समायोजित करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश हस्तक्षेप.
melanocytes के घातक परिवर्तन, मानव त्वचा की वर्णक कोशिकाओं, मेलेनोमा के गठन का कारण बनता है, वृद्धि हुई मेटास्टेटिक क्षमता के साथ एक अत्यधिक आक्रामक कैंसर. हाल ही में, मोनो chemotherapies लक्षित कळेनासे अवरोधकों के साथ मेलेनोमा विशिष्ट संयोजन चिकित्सा द्वारा सुधार करने के लिए जारी. फिर भी, मेटास्टेटिक मेलेनोमा एक जीवन खतरा रोग रहता है, क्योंकि ट्यूमर प्राथमिक प्रतिरोध प्रदर्शन या उपंयास चिकित्सा के लिए प्रतिरोध का विकास, जिससे tumorigenic क्षमता पुनः प्राप्त । आदेश में घातक मेलेनोमा की चिकित्सीय सफलता में सुधार करने के लिए, पारंपरिक उपचार दृष्टिकोण के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान आणविक तंत्र का निर्धारण आवश्यक है; हालांकि, इसके लिए इन विट्रो मॉडल में इनोवेटिव सेलुलर की आवश्यकता है । यहां, हम एक इन विट्रो तीन आयामी (3 डी) organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति मॉडल है कि घातक मेलेनोमा के vivo में वास्तुकला चित्रित कर सकते है और अंतर ट्यूमर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर मेजबान बातचीत में नई अंतर्दृष्टि वारंट हो सकता है परिचय । मॉडल एक 3 डी मानव पूर्ण त्वचा पुनर्निर्माण प्राथमिक त्वचा कोशिकाओं से मिलकर मॉडल में परिपक्व और विभेदित मेलेनोमा spheroids की संख्या निर्धारित शामिल हैं । सेलुलर संरचना और एंबेडेड मेलेनोमा spheroids के भेदभाव की स्थिति में त्वचा के मेलेनोमा मेटास्टेसिस में से एक के समान है vivo। एक दवा स्क्रीनिंग मंच के रूप में इस organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति मॉडल का उपयोग कर चयनित संयोजन चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया करने वालों की पहचान का समर्थन कर सकते हैं, जबकि गैर के लिए अनावश्यक उपचार बोझ बख्शते-प्रतिक्रिया, जिससे लाभ में वृद्धि चिकित्सीय हस्तक्षेप ।
मानव त्वचा दो अलग डिब्बों कि प्रतिकूल पर्यावरणीय प्रभाव1से शरीर की रक्षा में विभिंन कार्यों की सेवा से बना है । कम चमड़े का डिब्बा एक fibro-लोचदार संयोजी ऊतक के होते हैं । यह ढीला जुड़ा कोलेजन और elastin fibroblasts द्वारा संश्लेषित फाइबर से बना है, एक यांत्रिक बाधा समारोह की सेवा । dermis ऊपरी एपिडर्मिस से बेसल लेमिना जो दोनों त्वचा डिब्बों के बीच एक निरंतर संचार के कारण एक extracellular मैट्रिक्स के रूप में उत्पादित है द्वारा अलग है । dermis के विपरीत, एपिडर्मिस एक स्क्वैमस उपकला है जो मुख्य रूप से keratinocytes के होते हैं और चार परतों में विभेदित किया जा सकता है. परत बेसल विभेदक बेसल keratinocytes जो लगातार परत spinosum और परत granulosum में परत corneum के चरणों के माध्यम से त्वचा जनक कोशिकाओं से प्राप्त stratifying के होते हैं निर्जलीकरण और संक्रमण से शरीर को बचाने के लिए2। Melanocytes बेसल झिल्ली पर गठबंधन कर रहे हैं, और कई keratinocytes के साथ वृक्ष एक्सटेंशन के माध्यम से संवाद । वे त्वचा मेलेनिन का उत्पादन पराबैंगनी विकिरण के प्रतिकूल प्रभाव से त्वचा के ऊतकों की रक्षा, उंर बढ़ने, प्रतिरक्षादमन, सूजन, और गैर की प्रेरण-मेलेनोमा त्वचा कैंसर की तरह । यूवी विकिरण घातक मेलेनोमा को melanocytes के परिवर्तन के लिए योगदान है, तथापि, अभी भी बहस के अंतर्गत है3।
मेलेनोमा विकास अलग ट्यूमर प्रगति चरणों में विभेदित है, और कुछ आनुवंशिक, सुघड़ द्वारा विशेषता है, और histologic परिवर्तन4। वे या तो de नोवो या एक जंमजात या प्राप्त nevus melanocyte प्रसार के एक स्थानीय वृद्धि के कारण सौम्य neoplasia पैदा करने से उत्पंन । यह अग्रदूत घाव संरचनात्मक रूप से संशोधित dysplastic ऊतक atypic कोशिकाओं है, जो पहले घातक चरण, रेडियल विकास चरण (RGP) के लिए जारी रख सकते हैं युक्त में बदल सकते हैं । इस प्रारंभिक ट्यूमर प्रगति चरण एपिडर्मिस के भीतर रेडियल proliferating कोशिकाओं की विशेषता है, इल्लों dermis के भीतर कुछ स्थानीय रूप से इनवेसिव कोशिकाओं दिखा । बाद ऊर्ध्वाधर वृद्धि चरण (वीजीपी) मेलेनोमा कोशिकाओं के दौरान पहले से ही एक मेटास्टेटिक और इनवेसिव phenotype बेसल लेमिना के माध्यम से तोड़ने के लिए dermis के गहरे भागों के रूप में अच्छी तरह से चमड़े के नीचे ऊतक5घुसपैठ के द्वारा दिखा । अंत में, मेटास्टेटिक मेलेनोमा (मिमी) मेटास्टेटिक कोशिकाओं के साथ सबसे आक्रामक प्रगति चरण का प्रतिनिधित्व करता है प्रणालीबद्ध रक्त और लिम्फ प्रणाली में फैल जिगर, फेफड़े, और मस्तिष्क की तरह लंबे अंगों पर आक्रमण करने के लिए6।
तारीख करने के लिए, जल्दी निदान सर्जरी के बाद अभी भी घातक मेलेनोमा की सबसे प्रभावी चिकित्सा बनी हुई है । दूर मेटास्टेसिस के साथ रोगियों के लिए पूर्वानुमान, तथापि, विशेष रूप से गरीब7रहता है, क्योंकि शास्त्रीय रसायन चिकित्सा परहेजों केवल थोड़ा उत्तरजीविता लाभ8,9प्रदान करते हैं । हालांकि, ठहराव के दशकों के बाद, लक्षित चिकित्सा में हाल के अग्रिमों काफी घातक मेलेनोमा के पूर्वानुमान में सुधार हुआ है ।
Dysregulation के दो प्रमुख mitogen सक्रिय मार्ग, रास-आरएएफ-खल्क-ERK और PI3K-एकेटी-PTEN सिग्नलिंग मार्ग, वर्तमान प्रमुख ड्राइवरों की मेलेनोमा प्रगति, विशेष रूप से जब constitutively आद्य oncogenes BRAFV600 के बिंदु उत्परिवर्तन को सक्रिय करने और NRAS१०उपस्थित होते. तदनुसार, लक्षित कळेनासे अवरोधकों के आविष्कार मेटास्टेटिक मेलेनोमा से पीड़ित रोगियों के लिए चिकित्सीय लाभ का वादा किया । इस बिंदु के लिए आयोजित नैदानिक परीक्षणों के एक भीड़ मेटास्टेटिक मेलेनोमा के साथ रोगियों के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्राप्त नहीं किया है । लगभग सभी प्रतिक्रियाओं प्राथमिक प्रतिरोध दिखा रोगियों की एक उपजनसंख्या के साथ आंशिक, कर रहे हैं । इसके अलावा, माध्यमिक पतन के लिए अग्रणी प्रतिरोध के अधिग्रहण रोगियों के बहुमत में मनाया गया था11,12।
यह स्पष्ट हो जाता है कि उत्परिवर्तन स्थिति का विश्लेषण अकेले सबसे शक्तिशाली चिकित्सीय रणनीति विकसित करने के लिए पर्याप्त नहीं है । नई तेजी से और विश्वसनीय नैदानिक उपकरण व्यवस्थित रिकॉर्ड और व्यक्तिगत कैंसर कोशिकाओं की जवाबदेही का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हैं । मानव मेलेनोमा पर वर्तमान में उपलब्ध डेटा के विशाल बहुमत दो आयामी (2d) मेलेनोमा सेल संस्कृतियों से प्राप्त किया गया है । ट्यूमर कोशिकाओं, तथापि, 3 डी में हो विभेदित कैंसर कोशिका उपआबादी के बीच और साथ ही कैंसर की कोशिकाओं और गैर के बीच सेलुलर crosstalk की अनुमति के आसपास के मेजबान ऊतक बदल दिया । इसलिए, यह 3 डी वातावरण में विकसित मेलेनोमा, एक नैदानिक स्क्रीनिंग मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए13,14का पुनर्निर्माण करने के लिए सबसे अच्छा होगा ।
organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति त्वचा मॉडल यहां शुरू की अंतर के एक गहरी समझ ट्यूमर और ट्यूमर मेजबान बातचीत के लिए नई अंतर्दृष्टि वारंट, और एक उंनत जांच मंच प्रदान करने के लिए ट्यूमर के विकास के आणविक तंत्र का अध्ययन कर सकते है और भविष्य में थेरेपी प्रतिरोध ।
सबसे अच्छा और शारीरिक गारंटी करने के लिए vivo में नकल उतार त्वचा की स्थिति को खंगाला, प्राथमिक कोशिकाओं की गुणवत्ता अत्यंत महत्वपूर्ण है । जैसा कि ऊपर कहा गया, किशोर या प्रसव पूर्व त्वचा कोशिकाओं को सबसे कम अंतर ग्रेड दिखाने के लिए और इसलिए सबसे अच्छा पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष उत्पंन करने के लिए उपयुक्त हैं । पहली संभव गुणवत्ता नियंत्रण keratinocytes बोने के बाद 2 दिन में चमड़े का संकुचन की हद तक है और ईजीएम को जेल equilibrating (प्रोटोकॉल वर्गों ८.२ और ८.३) । चमड़े का जैल fibroblasts की सबसे अच्छी गुणवत्ता के साथ सबसे हटना होगा । इसके अलावा, बहुत कम या बहुत अधिक fibroblasts के एकीकरण चमड़े का डिब्बा करने के लिए एपिडर्मल का अधययन संकुचन और फलस्वरूप लगाव ख़राब हो सकता है । यह बारी में एपिडर्मल भेदभाव समझौता होगा, क्योंकि इस प्रक्रिया को एक व्यापक पार अधययन और एपिडर्मल कोशिकाओं के बीच बात की आवश्यकता है ।
प्राथमिक कोशिकाओं की गुणवत्ता भी गंभीर कोशिका के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के पारित होने के रूप में प्रवाह पर निर्भर करता है । यदि keratinocytes ≥ करने के लिए बड़े हो रहे हैं ८०% प्रवाह वे तुरंत बंद करो proliferating और अंतर करने के लिए शुरू. यह इसलिए उंहें संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण है ४०-७०% passaging के दौरान प्रवाह और उंहें कोई बाद में 3-4 बीतने से उपयोग करें । Fibroblasts कम संवेदनशील हैं, लेकिन बाद में 4-6 बीतने से नहीं किया जाना चाहिए । कृपया यह भी ध्यान दें कि सभी प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों organotypic मेलेनोमा अंडाकार आकृति त्वचा मॉडल उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त कर रहे हैं, और इसलिए संदूषण जोखिम अधिक है । हालांकि, एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा व्यक्तिगत कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान में परिवर्तन और इसलिए त्वचा समकक्ष की गुणवत्ता कम कर देता है ।
सामान्य तौर पर, ट्यूमर अंडाकार आकृति गठन ट्यूमर सेल लाइनों के लगभग सभी प्रकार से और ताजा रोगी सामग्री से अलग ट्यूमर कोशिकाओं से भी संभव है. प्रारंभिक कक्ष संख्या और/या इष्टतम अंडाकार आकृति आकार प्राप्त करने के लिए खेती समय उपयोग किए गए कक्ष प्रकार के आधार पर भिंन हो सकते हैं । १५०-२०० µm के एक आकार तक, सभी कोशिकाओं को एक अंडाकार आकृति में शामिल अभी भी पर्याप्त रूप से सरल प्रसार के माध्यम से पोषक तत्वों के साथ आपूर्ति की जा सकती है । केवल आकार के साथ spheroids ≥ ५०० µm सेलुलर भेदभाव के एक उच्च डिग्री दिखाने के लिए और गैर-संवहनी ट्यूमर ऊतक के विशिष्ट सुविधाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं22.
organotypic मेलेनोमा-अंडाकार आकृति-त्वचा-मॉडल यहां विकसित ट्यूमर-मेजबान बातचीत का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है और मेलेनोमा दवा के तहत परीक्षण के लिए vivo की तरह स्थितियोंमें 15 । फिर भी, vivo में मेलेनोमा का वातावरण और भी अधिक जटिल है, ट्यूमर संबंधित कोशिका प्रकार की एक किस्म बंदरगाह, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं सहित. उचित प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलावा histocompatibility के साथ समस्याओं का सामना करने के बाद से, इन मॉडलों को पर्याप्त रूप से प्रतिरक्षा-चिकित्सीय दृष्टिकोण की निगरानी करने में सक्षम नहीं हैं ।
फिर भी, मेलेनोमा spheroids हौसले से अलग रोगी सामग्री से उत्पंन किया जा सकता है और एक बार पूर्ण त्वचा पुनर्निर्माण में शामिल, व्यक्तिगत दवा जांच प्लेटफार्मों के रूप में सेवा कर सकते हैं । यहां तक कि मेलेनोमा मेटास्टेसिस के टुकड़ों की त्वचा में एकीकरण के एक सिलवाया चिकित्सीय दृष्टिकोण में दवा संयोजन का परीक्षण करने के लिए कल्पना करना है । नैदानिक परीक्षण में organotypic 3d skin-मेलेनोमा मॉडल सहित, यह सुनिश्चित करने में मदद की संभावना है कि केवल सबसे होनहार उपंयास चिकित्सकीय अवधारणाओं आगे नैदानिक परीक्षण में लिया जाता है, इस प्रकार इस के लिए संभावित नए उपचार के उदासीनता दर को कम करने रोग और नैदानिक परीक्षणों में चिकित्सीय सफलता की दर में वृद्धि.
The authors have nothing to disclose.
लेखक 3 डी organotypic मेलेनोमा-अंडाकार आकृति-त्वचा मॉडल की स्थापना और उत्कृष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए हैना Voersmann धंयवाद । लेखकों ने बहुमूल्य तकनीकी सहायता के लिए सिल्क बश का भी शुक्रिया अदा किया । काम BMBF e:Med कार्यक्रम “मेलेनोमा संवेदनशीलता” 031A423A द्वारा समर्थित किया गया था ।
fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |